1、交通大學體內(nèi)IL-2瘤苗抗腫瘤效應及安全性檢測The study about ANTI-TUMOR EFFECT AND SAFETYOF IL-2 GENE VACCINE IN VIVO：張某某醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院普外科海指導老師：學科（專業(yè)）：外科學（普通外科學）培養(yǎng)：交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院攻讀學位：學位答辯時間：2008 年 5 月交通大學性本人鄭重:所成交的，是本人在導師的指導下，獨立進行取得的成果。除文中已經(jīng)注明的內(nèi)容外，本不包含任何其他個人或集體已經(jīng)或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本的法律結果由本人承擔。作者簽名：日

2、期：年月日交通大學使用書本作者完全了解學校有關保留、使用的規(guī)定，同意學校保留并向國家有關部門或機構送交的復印件和，允許被查閱和借閱。本人交通大學可以將本的全部或部分內(nèi)容編入有關的數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等保存和匯編本。（），在年后適用本書。本屬于不（）。（請在以上括號內(nèi)打“”作者簽名：指導教師簽名：日期：年月日日期：年月日目錄中要體內(nèi)IL-2瘤苗抗腫瘤效應及其安全性檢測摘 要目的:本課題轉(zhuǎn)導白細胞介素-2（IL-2）的腸癌細胞瘤苗的抗腫瘤效應及其安全性檢測。方法：結腸癌細胞株 COLO205 采用脂法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 IL-2，應用 ELISA 法檢測瘤苗的 IL-2 的表達，篩選高表

3、達 IL-2的細胞克隆作為瘤苗。將已構造好的結腸癌鼠模型分為兩組，采用瘤體內(nèi)注射的方法，注射經(jīng) 60Gy60Co 照射的瘤苗細胞（治療組）和 PBS緩沖液（對照組）,密切觀察腫瘤生長狀況，五處死所有鼠，取出腫瘤，觀察并稱重，免疫組化法檢測 IL-2的表達。把已制瘤苗用 60Co 進行照射，將照射瘤苗細胞繼續(xù)培養(yǎng)，備好的大腸癌用苔盼藍染色法測定細胞的存活率，將照射的瘤苗細胞和未照射組的瘤苗進行荷瘤試驗。結果: 獲得瘤苗最高表達為 COLO205-H5 量為 139.13 ng/1107/24h。瘤體內(nèi)注射瘤苗組的鼠腫瘤生長緩慢，較早達到期，而對照組的腫瘤生長迅速，差異有顯著性。（ t=2.7,p

4、0.05）治療組腫塊的重量也明顯小于對照組（t=7.2，p0.01）。移植瘤治療組IL-2 免疫組化結果顯示陽性，而對照組為,說明了瘤苗在移植瘤IL-2。照射 60Gy60Co 瘤苗細胞培養(yǎng)在 25 天內(nèi)全部死體內(nèi)存活并亡，荷瘤試驗顯示照射后的瘤苗未能成瘤，而照射組均已成瘤。結論:通過體內(nèi)實驗證實了 IL-2轉(zhuǎn)導結腸癌細胞的瘤苗具有一定的抗腫瘤效應，經(jīng) 60Gy60Co 照射后能消除其致瘤性，為腫瘤的治療提供了一定的實驗基礎。:大腸癌,白細胞介素-2,瘤苗，移植瘤英要The studyabout ANTI-TUMOR EFFECT AND SAFETY OFIL-2 GENE VACCINE

5、IN VIVOABSTRACTObjective: To investigate the anti-tumor effectof IL-2genevaccine and detect its safety.Methods: Eukaryotic expresvectors containing humanIL-2gene was stably transfectedo colorectal cancer celllinecolo205bylipofectamine.TheclonesstablyoverexpresIL-2 gene were identified byELISA detect

6、ion,the clones ofhighly stably overexpresg of IL-2 wereobtained and used for subsequent test. The athymic nude micecarrying the human colon cancer were subdividedo two groups:treatment groups and placebo groups. The cell clones containingIL-2 gene were irradiated by 60Co(60Gy) and used as treatmentg

7、roup, the phosphate-buffered saline (PBS) administration wasused for the placebo group. After 5ks, killing all mice ,unloading the tumor lump and determining its weight, detectingIL-2 gene expresby using immunohistochemical staining.60CoProliferative viability of IL-2 gene vaccine irradiated by(60Gy

8、)was testedbytypan excluassayinvitro,tumenesis capacity of IL-2 gene vaccine irradiated by60Co(60Gy) was tested in xenograft tumor ms in athymic nudemice in vivo.Result: We obtained clones of highly expressing IL-2 genein colon cancer cell line colo205, and the secretion level ofcell clones of highl

9、y expressing IL-2 gene was 139.13ng/1107/24h. The nude micereatment group show the slower tumorgrownd smaller tumor weight compared with those in placebogroup(t=2.7,p0.05 ； t=7.2 ， p0.01).Immunohistochemicalstaining shows IL-2 gene overexpresice of treatmentgroup while little expresof IL-2 gene in p

10、lacebo group.The IL-2 gene cell vaccine irradiated by 60Co(60Gy) shows lowerproliferative viability and detach the culture plate after 25days by using typan exclumethod in vitro, the IL-2 genecell vaccine irradiated by 60Co (60Gy) have little tumenesiscapacity in nude mice in vivo.: We studied anti-

11、tumor effect of colon cancercell line colo205 transferredIL-2 gene in vivo and its safetydetection, our results showthe cell vaccinesess some60Coanti-tumor effect and cancercell vaccine irradiated by(60Gy) loss its tumenesis.KEY WORDS: colorectal cancer,erleukin-2, gene vaccine，xenograft tumor引言大腸癌是

12、一種常見的，近年來呈現(xiàn)逐年升高的趨勢。目前，大腸癌的治療方法主要是以手術為主、輔以局部或全身的放化療，并有了很高的提高，但50%左右的仍然死于轉(zhuǎn)移和復發(fā)1。近30年來，隨著人類對大腸癌的發(fā)生、發(fā)展的分子機理不斷深入的，人類對大腸癌在水平上已有深入。大腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟，多階段的復雜過程2，其主要是由的癌的激活和抑癌的失活、DNA修飾功能缺失和機體免疫功能低下等引起的3。大腸癌的治療已取得一定的臨床實驗療效，并將們更加重視，將會為結直腸癌患臨床治療帶來新的選擇方法,尤其對出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的晚期的大腸癌患者帶來。大腸癌的發(fā)生、發(fā)展經(jīng)歷了多、多步驟的過程，其中與環(huán)境、飲食、和遺傳協(xié)同作用有重要的關

13、系4 5。大腸癌在發(fā)生發(fā)展過程中經(jīng)歷生活一系列的突變和（或）缺失，造成其不僅在生物學特征方面不同于正常的細胞，而且在免疫學方面也發(fā)生顯著變化6。如一些突變和異常表達，使腫瘤細胞表面出現(xiàn)新的抗原，一些缺失或表達下降，造成某些抗原丟失7，這些改變使得腫瘤與機體免疫系統(tǒng)之間曾出現(xiàn)錯綜復雜的關系：一方面腫瘤細胞表面存在特異性抗原，機體免疫系統(tǒng)能識別這些抗原并產(chǎn)生一系列免疫應答，最終排斥腫瘤8；另一方面，機體免疫系統(tǒng)受包括腫瘤本身在內(nèi)的許多影響，發(fā)生免疫耐受，使腫瘤逃避宿主免疫，得以生長并發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移9。治療誕生于上世紀 80 年代末及 90 年代初，作為一種新興的治療是主要的候選疾病10。但腫瘤屬復雜

14、已正式進入臨床試驗，疾病，可能涉及多種的異常，發(fā)病過程是多階段多步驟的，至今只有部分被鑒定，腫瘤發(fā)病的分子機制尚未完全清楚。目前主要存在的有如何選擇有效的轉(zhuǎn)導11。靶、如何實現(xiàn)有效的治療是從水平調(diào)控細胞中缺陷的表達，修補有缺陷的，或以正常矯正、替代缺陷的，達到治療缺陷所致的遺傳病免疫缺陷；或的激活和(或)抑癌失活所致的腫瘤等疾病治療12。目前采用的主要因癌等13。策率有：突變的矯正、前提藥物的激活、免疫應答的增強、溶瘤目前針對大腸癌治療主要有：治療、原癌和抑癌有治療14 15，而免疫關的治療、免疫治療、聯(lián)合治療是當前研究的一個熱點。無論性的還是獲得性的免疫反應都被認為機體抗腫瘤重要的機制16。

15、大腸癌細胞具有抗原性，能誘導機體產(chǎn)生免疫應答，但絕大多數(shù)腫瘤仍能繼續(xù)生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移，說明機體的免疫系統(tǒng)未能發(fā)揮抗腫瘤作用。免疫學發(fā)現(xiàn)，腫瘤抗原尤其是弱抗原在腫瘤長期的刺激下，可作用于不同分化的狀態(tài)的抗原特異性淋巴細胞，使其處于特異的免疫無應答狀態(tài)17。無論性的還是獲得性的免疫反應都被認為機體抗腫瘤重要的機制18。腫瘤細胞還可以通過不表達抗原表位、抗原調(diào)變脫落或加工缺陷、缺乏 MHC-I 類分子或免疫共刺激分子等途徑逃避機體免疫系統(tǒng)的。在患者外周血中常出現(xiàn) T 細胞亞群的紊亂，表現(xiàn)為 CD4細胞（Th）減少，CD8細胞（TcTs）增加，CD4CD8細胞比值下降或倒置，同時 NK、LAK 細胞也存

16、在不同的程度的活性下降。此外，細胞因子譜也常出現(xiàn)紊亂，表現(xiàn)為TGF-、IL-10、VEGF、和 PEG 等細胞因子濃度升高，而 IL-2、INF-、GM-CSF 和 IL-12 等濃度的下降19。人們設想通過免疫調(diào)節(jié)劑增強腫瘤免疫原性、解除機體免疫耐受，以調(diào)整免疫應答達到祛除腫瘤的目的20。腫瘤免疫治療已有一個多世紀的歷史。早期應用滅活的腫瘤細胞、細胞濾過或粗提取物進行主動免疫治療，但效果不佳。其后應用經(jīng)物理、化學或生物學方法，如加熱、冷凍、放射線治療、加入神經(jīng)氨酸酶或等方法，處理腫瘤細胞制成腫瘤?；?qū)⒆鳛樽魟┑?BCG 或 BCG-多糖類物質(zhì)與腫瘤聯(lián)合注射。以上方法應用于腎癌和黑色素瘤治療取

17、得了一定的療效。此后人們探索將一些外源性導入腫瘤細胞，以增強其免疫原性，有利于被機體免疫系統(tǒng)識別，激發(fā)特異性細胞毒性反應21。據(jù) Wiley公布的治療臨床試驗資料顯示已成為其主要研究領域，占總方案數(shù)的 66.2。當前大腸癌治療主要涉及免疫治療、糾正突變的 P53、抑癌的激活和腺介導癌細胞裂解等策略。其中免疫治療約占三分之二，多數(shù)采用的策略是經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄將細胞因子導入腫瘤細胞，制成“瘤苗”，注入患者體內(nèi)后通過局部境，增強宿主的特異性抗腫瘤免疫反應22 23。細胞因子改變腫瘤微環(huán)白細胞介素 2 具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，其在結直腸癌的生物治療中的價值已得到肯定24。IL-2 主要有活化的 Th1 或 C

18、D4+T 細胞產(chǎn)生25，通過自和旁方式作用于靶細胞，有效地激發(fā)宿主特異性抗腫瘤免疫反應（CTL、CD4+和CD8+ ）和非特異免疫反應（NK、LAK、巨噬細胞等）26。臨床應用 IL-2 單用或聯(lián)合 LAK、TIL 治療大腸癌取得了一定的療效，但其療效成劑量依賴性，而相應的毒副反應卻限制了其大劑量應用27，因此難以充分發(fā)揮療效。本采用逆轉(zhuǎn)錄作為載體于體外將外源性的 IL-2轉(zhuǎn)到至同種異體的腸癌細胞株，篩檢擴增建立高表達的細胞克隆，建立腫瘤細胞。在體外檢測外源性 IL-2的整合和表達情況，并凍存于液氮中（本實驗小組先前已完成）。復蘇瘤苗，采用 ELISA 檢測瘤苗的表達 IL-2，選用高表達量的

19、細胞瘤苗，作為后續(xù)實驗使用。瘤苗安全性處理采用照射 60Co 的方法，劑60Co量為 60Gy。照射過后瘤苗細胞無論在體內(nèi)還是在體外均失去無限增殖的能力，通過 60Co 照射滅活了其致瘤性，具有安全性。建立大腸癌動物模型，給予瘤體內(nèi)注射瘤苗細胞，而對照組給予 PBS,兩組結果對比，在體內(nèi)進行檢測證明轉(zhuǎn)導 IL-2腸癌瘤苗的有效性。為 IL-2瘤苗治療大腸癌的有效性、安全性提供了重要的試驗依據(jù)，豐富了大腸癌的治療。試驗材料細胞株腸癌細胞株 SW1116、COLO205 和 HT-29 由本實驗組凍存于交通大學醫(yī)學院生化，IL-2轉(zhuǎn)導腸癌細胞瘤苗SW1116、COLO205、HT-29，由本實驗組

20、先前完成并凍存于交通大學醫(yī)學院生化。細胞培養(yǎng)RPMI1640 培養(yǎng)液、0.25胰酶、胎牛購于 GBCO雜交試驗ELISA 試劑盒購于 Diaclone 公司。動物模型Balb/c小鼠 24 只購于并飼養(yǎng)于中國試驗動物中心。免疫組化兔抗人 IL-2的多克隆抗體 和 HRP 標記的羊抗兔抗體購于Sigma 公司。試驗方法細胞培養(yǎng)大腸癌細胞系及腫瘤細胞培養(yǎng)于 1640 基礎培養(yǎng)液中，含 10%的胎牛血清的，于 37，5%CO2，相對濕度為 90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期換液和細胞計數(shù)。大腸癌瘤苗生物活性的鑒定抗體夾心 ELISA 法檢測 IL-2 表達（蛋白質(zhì)水平檢測）各細胞克隆培養(yǎng)上清樣品在室溫下解凍

21、，適當稀釋，按說明書配置各試劑，取待測樣品、標準液及對照液各 100l 分別加入 96 孔反應板微孔內(nèi)，于各孔內(nèi)加入 50l 生物素標記的抗 IL-2 檢測抗體，室溫下孵育 1 小時，漂洗 3 次。加入 100l 鏈球菌素親和素辣根過氧化物酶溶液，室溫下孵育 30 分鐘，漂洗 3 次。加入 100l 顯色劑 TMD,避光孵育 15 分鐘后加入 100lH2SO4 溶液終止反應，立刻上酶標儀檢測。根據(jù)標準樣品的不同稀釋的濃度及相應的 OD 值作標準曲線，查看所側(cè)細胞上清樣品的 IL-2量，用 Excel 完成。挑選穩(wěn)定高表達的細胞克隆作為后繼的動物試驗所用的瘤苗。瘤苗安全性的檢測照射 60Co

22、對瘤苗細胞生長的影響胎盤藍排斥試驗測定細胞的存活率將照射后的瘤苗細胞用1 x PBS洗2次，025胰酶消化，然后用1ml完全新鮮培養(yǎng)液懸浮，取4滴于載玻片上，用苔盼藍染色染色23分鐘，細胞中深藍色顆粒浸潤即為細胞，透亮的則為活細胞。4滴樣品各隨機取視野計算100個細胞，細胞存活率=活細胞數(shù)100。把4個數(shù)值平均，即為某一天細胞的存活率，總細胞數(shù)x存活率即得某天的活細胞數(shù)。瘤苗荷瘤試驗把瘤苗按是否照射 60Co，分為兩組：照射組和未照射組，注射瘤苗細胞懸液于鼠側(cè)背部皮下，進行荷瘤試驗，每組六只鼠，密切觀察兩組鼠生長狀況，看是否長出移植瘤（具體的步驟見下面“鼠移植瘤模型的建立”）。實驗分兩組：照射

23、 60Co 轉(zhuǎn)染 IL-2 的 COLO205 瘤苗細胞組和照射 60Co 轉(zhuǎn)染 IL-2 的COLO205 細胞組,每組 6 只鼠，共 12 只。體內(nèi)實驗檢測瘤苗的抗腫瘤效應。結腸癌細胞系 COLO205鼠移植瘤模型的建立1)Balb/c小鼠 12 只，鼠齡 45 周，體重 1525g，購于中國實驗動物中心鼠飼養(yǎng)于無菌室層流架無特定病原體(SPF)環(huán)境中，給予高壓滅菌的水和飼料食用。2)COLO205 大腸癌細胞生長至亞融合狀態(tài)時，棄完全培養(yǎng)液，PBS 洗滌 3，0.05%typsin/0.02% EDTA 消化成單細胞懸液，800 rpm5 min，4離心；用 PBS 重懸細胞，細胞數(shù)調(diào)整

24、至 1108/ml。在每只小鼠側(cè)背部皮下注射腫瘤細胞懸液 50l(5106 細胞)。3)4)待移植瘤直徑達到 0.5cm 左右時，實驗分為兩組：治療組和對照組。應用的轉(zhuǎn)導了IL-2的COLO205 瘤苗對腫瘤組織行瘤內(nèi)注射，對照組注射 PBS。瘤苗治療移植瘤把好經(jīng)檢測高表達的轉(zhuǎn)染 IL-2腸癌 COLO205 細胞瘤苗進行復蘇，復蘇后瘤苗細胞存活率達到 80%以上，待細胞生長至亞融合狀態(tài)，進行安全型處理后（用 60Gy60Co 照射)為治療組，對照組為 PBS。當荷瘤鼠移植瘤直徑達 0.5cm 左右時,進行治療試驗。治療組向移植瘤內(nèi)注射瘤苗（細胞量大約為 1107 個/每只鼠，制成細胞懸液），

25、對照組為 PBS,兩組液體體積相等，每隔 1 周注射一次。從首次注射之日起密切觀察兩組鼠生長狀況，每隔 3 天用游標卡尺檢測腫瘤長徑和短徑，計算并比較腫瘤的體積。計算公式為腫瘤體積：V=(長徑短徑)/23/6。兩組間體積比較采用 t 檢驗，EXCEL 、SPSS11.5 完成。移植瘤的處理觀察 5處死小鼠，解剖鼠，取出腫瘤稱重，OCT 包埋，冰凍切片機切片，免疫組化檢測 IL-2 的表達。兩組間重量比較采用t 檢驗，SPSS11.5 完成。免疫組織化學檢測：1)冰凍切片經(jīng)冷室溫固定 30 分鐘后，TBS 洗 5 分鐘。2)0.6的 H2O237孵育 20 分鐘，以去除內(nèi)源性的過氧化物酶活性。3

26、)TBS 洗 5 分鐘，1:20 正常羊37封閉 30 min。4)加入一抗 37孵育 2h。5)TBS 洗 3 遍后加入 HRP 標記的二抗 37孵育 1h，6)TBS 洗 3 遍，DAB 顯色，顯微鏡下控制顯色時間，約 5-10 分鐘，蘇木素襯染細胞核后封片觀察。結果ELISA 檢測 IL-2 蛋白水平得表達ELISA 檢測 IL-2 蛋白水平得表達結果如表 1 表示。其中 IL-2 表達最高的為 COLO205-H5 混合克隆，表達量為 139.13 ng/1107/24h，表達最克隆是為 COLO205-11，表達量為 129.23 ng/1107/24h，平均表達量高的單克隆為 61

27、.51 ng/1107/24h。未轉(zhuǎn)染 IL-2 的三個結腸癌細胞株培養(yǎng)液上清中均未檢測到 IL-2 的表達?？傮w IL-2 表達單克隆 IL-2 表達混合克隆 IL-2 表達細胞株克隆數(shù) 范圍平均值克隆數(shù) 范圍平均值克隆數(shù)范圍平均值SW11621028.318.321028.318.3/HT-29241.8938.2715.19221.89 38.2715.7929.3210.6310.23COLO205160139.1361.51110129.2359.43524.12139.1364.25：ng/1107/24hr）表 1(schedule 1s轉(zhuǎn)導大腸癌細胞株 IL-2 的表達情況（e

28、 of gene transducted colorectal cancer cell strain express IL-2unity：ng/1107/24h)瘤苗細胞的安全性檢測結果照射 60Co 對瘤苗細胞的影響經(jīng)60Co照射后瘤苗細胞體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨天數(shù)的增加，細胞存活率下降，活細胞數(shù)減少，照射后一周內(nèi)細胞的存活率約為50，25天內(nèi)細胞瘤苗全部，結果見表2（同種細胞兩株細胞的檢測的結果）。上述結果表明照射明顯下降，在第15天時候細胞幾乎全部，因此，經(jīng)60Co照射后后的細胞瘤苗細胞已經(jīng)失去了腫瘤性的無限增殖能力，失去了致瘤性。劑量天數(shù)60Gy13681013152025存活率（）1009

29、75328820.30.060100955225510.20表 2 照射 60Co 對瘤苗細胞的影響influence of radiation tumor vaccine with 60Co)(schedule 2體內(nèi)實驗檢測瘤苗的安全性未照射 60Co瘤苗組在第 16 天出現(xiàn)了腫瘤，而照射組未能成瘤,見圖 1。60Co體內(nèi)和體外實驗均說明了應用處理過瘤苗細胞已失去腫瘤細胞的無限增殖的能了，失去了致瘤性，用來治療腫瘤是安全可行的。體內(nèi)實驗瘤苗的抗腫瘤效應治療組給予瘤移植瘤生長速度明顯慢于對照組，對照組鼠生長狀態(tài)較差，腫瘤體積不斷增大，在第 31 天時已有 2 只鼠不能耐受而。治療組鼠生長狀況

30、較為良好，在第 22 天時腫瘤生長已經(jīng)達到期。在第 31 天時處死所有鼠，取瘤稱重。從治療之日起，移植瘤的生長曲線見圖 2，兩組間體積比見表 3。處死鼠后取腫瘤，兩組間移植瘤重量的比較見表 4。時間點（每隔 3 天）1234567891011治療組（ 鼠的平均體積）785980113412581431156918922051215421672181對照組（ 鼠的平均體積）8211121145717932234279436854005445149215011t=2.7P0.05表 3. 移植瘤體積比(schedule 3volume ratioof transplaniontumor)12345

31、組別治療組0.330.50.610.530.47對照組1.051.751.351.401.30t=7.2P0.01表 4 移植瘤重量比weight ratio of transplan(schedule 4iontumor)移植瘤的免疫組化腫塊經(jīng) OCT 包埋制成冰凍切片后進行免疫組織化學檢測。結果顯示治療組移植瘤內(nèi) IL-2 表達呈強陽性，而對照組移植瘤內(nèi) IL-2 為表達為，見圖 3。說明瘤苗在移植瘤內(nèi)存活，并能繼續(xù)IL-2。大腸癌是一種常見的，近年來呈逐漸升高的趨勢，對人類的生命了極大的威脅。據(jù)2007 年顯示，的大腸癌發(fā)病率居于中居第三位。我國內(nèi)結直腸癌的也呈逐年上升趨勢，位于消化道腫

32、瘤的第二位，每年新發(fā)數(shù)約為 1316 萬，人數(shù)約為69 萬，多發(fā)于大中城市。地區(qū) 2005 年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示大腸癌達 40.8人/10 萬，其中每年新增病例 3000 余例，大腸癌發(fā)病已成為第二位高發(fā)腫瘤。近年來隨著電子結腸鏡、吻合器和新型化療藥物的臨床應用，以及全直腸系膜切除術的推廣和新型放療技術的改進，大腸癌綜合診治水平得到了顯著的提高28，總體五年生存率達 50左右29。但欲進一步提高療效，甚至徹底攻克惡性腫瘤這一頑癥，尚需借助于免疫治療新型治療方式30。IL-2 具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用而在大腸癌治療中得以廣發(fā)應用。West WH31等闡明體外給予 IL-2 時有一定的生理閾值，即 1.8

33、10IU/m2d,低于此值則無抗腫瘤活性，而達此“閾值”后 IL-2 的輸注劑量越高，其效果越好，然而單一 IL-2治療大腸癌療效并不理想。利用 IL-2 與其他化療聯(lián)合應用，應用免疫療法，在大腸癌中取得了較好的療效32 33。但無論是全身還是局部給藥，作為藥物體外給予的 IL-2 只能按照藥代動力學規(guī)律吸收、分布和代謝、不可能具備生理或旁的作用模式34。由于狀態(tài)下比滲漏和淋巴細胞滲透導致的嚴重的毒副反應限制了給藥劑量，使用常規(guī)治療方式難以在腫瘤局部達到有效的濃度35。腫瘤從 20 世紀 80 年代末和 90 年代初以后，腫瘤臨床和應用開發(fā)，并已成為國際上腫瘤免疫治療的熱點，其中修飾的成為目前

34、的熱點。其就是應用重組技術將目的導入腫瘤細胞而成的腫瘤細胞36。Wang XY37等，通過能表達熱休克蛋白的 cDNA 轉(zhuǎn)導入鼠源性 CT-26大腸癌細胞，來表達增強其免疫原性，并聯(lián)合使用 GM-CSF，抑制了移植瘤（CT-26細胞）的生長，顯示其抗腫瘤效應。Lyons JA38等利用重組體利基森林顆粒為載體編碼了鼠源性的生長因子受體-2，治療 鼠移植瘤（CT-26 細胞），進行密度分析顯示免疫接種的抑制腫瘤的反應，從而達到抑制腫瘤的生長。采用以缺陷型逆轉(zhuǎn)錄為載體，將IL-2轉(zhuǎn)染至細胞，建立細胞瘤苗。輸入機體后，在腫瘤的局部持續(xù)一定劑量的IL-2，有利于腫瘤抗原局部達到有效濃度，增加腫瘤免疫原

35、性，動員T、B淋巴細胞、NK細胞和巨噬細胞等效應細胞，并誘導其分化成熟，產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應。同時避免了大劑量的IL-2使用，減少了IL-2的毒副反應表明腫瘤細胞轉(zhuǎn)導IL-2可增加生成，有利于免疫效應的細胞侵潤39。同時可以轉(zhuǎn)導多藥耐藥并聯(lián)合細胞毒性藥物聯(lián)合使用，產(chǎn)生較好的協(xié)同效應40。在體外轉(zhuǎn)導IL-2的鼠源性的大腸癌細胞，而制成的腫瘤，治療移植瘤表明瘤抵御親本腫瘤細胞的，延緩腫瘤細胞的，延緩了腫瘤的發(fā)展和擴散41 42。Sobol RE43等用缺陷性逆轉(zhuǎn)錄為載體把IL-2轉(zhuǎn)染到成細胞中，建立了細胞瘤苗。在臨床實驗中，將瘤苗和已處理過的腫瘤細胞混合種植于皮下。5例中有4例中出現(xiàn)了T細胞增多。但

36、就療效而言，并未出現(xiàn)臨床緩解病例。由于樣本數(shù)較少，需進一步加以驗證。安全性采用60Co照射后，轉(zhuǎn)導細胞尚能持續(xù)細胞因子長達23周，但致瘤性44，采用60Gy60Co照射后的瘤苗細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，一周內(nèi)瘤苗細胞大約存活50%，25天內(nèi)全部，而瘤苗細胞的在照射后24小時稍增加，而給予皮下注射1107瘤苗細胞量的注射，未出現(xiàn)毒副反應45。為瘤苗的利用提供安全性保障。同時瘤苗經(jīng)過照射后，增強了生物活性。本在本課題組完成瘤苗建立和體內(nèi)生物學檢測的基礎的上，繼續(xù)完成后繼的試驗。由于前期試驗已完成的相應的瘤苗，已一段時間，所以在體內(nèi)檢測之前，對以復蘇瘤苗細胞進行 ELISA 檢測，來選擇高表達的瘤苗細胞進行后

37、繼的動物試驗。經(jīng)檢測， 轉(zhuǎn)染 IL-2的混合克隆大腸癌瘤苗細胞COLO205-H5 的表達量最高。建立大腸癌鼠模型（COLO205 細胞），選用經(jīng)檢測的最高表 IL-2 的大腸癌細胞株，進行安全處理后（采用 60Gy60Co 照射），制成細胞懸液向瘤體內(nèi)注射，對照組用 PBS，經(jīng)照射后的瘤苗細胞一周內(nèi)的存活率約為 50%，15 天內(nèi)幾乎全部，所以采用每隔一周進行一次治療，觀察腫瘤生長情況，描繪腫瘤生長曲線。明顯得出，治療組的移植瘤生長比對照組生長緩的抗腫瘤效應。安全性處理采用給予腫瘤照射 60Co，慢，明顯顯示了腫瘤60Co量為 60Gy，繼續(xù)進行細胞培養(yǎng)，測定照射對細胞活性的影響，采用苔盼藍

38、排斥試驗測定細胞計數(shù)，一周內(nèi)瘤苗細胞存活約為 50%，約為 25 天全部，得出瘤苗細胞在體外經(jīng) 60Co 照射后失去無限增殖的能力。瘤苗細胞進行 鼠荷瘤試驗，結果照射組未長出腫瘤，而未照射組則長出腫瘤。從這兩方面明顯得出，給予腫瘤照射 60Co，瘤苗失去了致瘤性，失去在體外無限增值的能力，而沒有改變其生物學活性，達到了安全性處理的目的。本試驗成功地在體內(nèi)證實了IL-2轉(zhuǎn)導腸癌細胞腫瘤抗腫瘤的有效性，采用60Co照射后的腫瘤是具有安全性的。為IL-2瘤苗腸癌的臨床試驗及應用提供了一定方法借鑒，奠定了試驗基礎。由于這是一種處于探索階段的治療方法，還有一些需要繼續(xù)解決的問題，如給藥的劑量、方法、腫瘤

39、本身免疫性逃避改變等。本課題組采用的同種異體的大腸癌細胞株作為前提細胞，避免了大腸癌元代培養(yǎng)的，簡化了瘤苗的治療，有利于臨床的,尤其適用于無法通過手術取得腫瘤細胞的晚期大腸癌腫瘤細胞的晚期。但本課題組將于后繼的試驗中繼續(xù)探索大腸癌細胞體外原代培養(yǎng)的成功方法，減少污染，提高成功率，以便建立化的大腸癌細胞瘤苗，提高特異性，增加療效。同時由于大腸癌的形成是多、多步驟的過程，所以考慮聯(lián)合其他治療的方法，如聯(lián)合其他的細胞因子，以及抑癌，來探索更有效的大腸癌的生物治療。結論在蛋白質(zhì)水平上檢測了 IL-2修飾的瘤苗的高表達性，建立了大腸癌動物模型，在體內(nèi)檢驗了腫瘤抗腫瘤的有效性。在細胞和荷瘤試驗兩方面證明了

40、采用 60Co 照射后的腫瘤是具有安全性的。為腫瘤的臨床試驗以及臨床應用奠定了基礎。參考文獻綜述大腸癌治療的現(xiàn)狀及展望交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院普外科（200025）綜述審校摘要：大腸癌常規(guī)治療方法為手術為主，輔以局部或全身的放化療，但的年的5年生存率不高。治療是一種新型的治療腫瘤的方法，治療大腸癌是一種有效的治療方法。將會成為一種很受臨床歡迎的治療大腸癌的方法。本文針對大腸癌的治療進行綜述。：大腸癌；治療一直以來，大腸癌在我國病率中處于很高的，并有增高的趨勢。近30年來，隨著人類對大腸癌的發(fā)生的的分子機理不斷深入的，人類對大腸癌在水平上已有深入的。大腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟，多階段的復雜

41、過程，其主要是由癌的激活和抑癌的失活、DNA修飾功能缺失和機體免疫功能低下等引起的。目前，大腸癌的治療方法主要是以手術為主，輔以局部或全身的的放化療，但未能明顯提高大腸癌的五年生存率。隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展及對大腸癌發(fā)病、發(fā)展機制的進一步深入，大腸癌的基因治療已取得一定的療效，并將們更加重視，將會成為一種大量應用于臨床的腫瘤治療方法。大腸癌治療策略的現(xiàn)狀及進展1.1細胞因子的治療：細胞因子的治療法就是將細胞因子的在體外導入受體細胞后，再回輸機體或直接將細胞因子導入體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境中產(chǎn)生細胞因子，激活抗腫瘤的免疫反應，從而達到抗腫瘤的效果，目前常用的大腸癌細胞因子主要包括白細胞介素112(

42、IL1-12),干擾素、（INF、），腫瘤壞死因子（TNF），粒細胞集落刺激因子（GM-csf）等。Chikkanna等1應用IL-12治療大腸癌CT26鼠荷瘤模型后，增強T細胞等免疫細胞的抗C等 2腫瘤功能。Kudo-Saito白細胞介素12（IL-2）偶聯(lián)rF-GM-CSF治療能顯著增強抗腫瘤效應，聯(lián)合治療組瘤體體積比單獨治療組（白細胞介素12治療）顯著減小，腫瘤生長緩慢，轉(zhuǎn)移減少，鼠帶瘤存活期延長。為白細胞介素12（IL-12）治療細胞因子治療大腸癌提供了理論的可行性，給臨床利用白細胞介素細胞因子治療大腸癌提供了實驗依據(jù)。Zhao等3ZD55-IL-24治療結腸癌使腫瘤細胞凋亡率顯著增加

43、，而正常細胞不受影響。比傳統(tǒng)的ONYX-015或Ad-IL-24治療有更好的療效，ZD55載體介導的IL-24顯示出更強的抗腫瘤效應。J A Lyons等4將VEGFR-2利用利基森林為載體轉(zhuǎn)染入CT26大腸癌細胞，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)接種轉(zhuǎn)染細胞的鼠腫瘤密度顯著降低，腫瘤增長緩慢，其機制可能是轉(zhuǎn)染大腸癌細胞的VEGFR-2競爭抑制了VEGF與內(nèi)皮細胞的VEGFR結合。由此可見細胞因子治療大腸癌具有較好的療效，并且具有一定的靶向作用，毒副作用小等優(yōu)點，也可以為術后輔助治療提供更好的方法，顯示其優(yōu)越的臨床價值。1.2 癌和抑癌的治療：癌是細胞固有的，其表達的產(chǎn)物為生理狀態(tài)下正常細胞增殖分化所必需的，在一

44、定的條件下被激活，呈現(xiàn)在時間和空間上的差異表達，可導致細胞增殖分化過程失衡而引起細胞惡變，針對等5將胰癌的過度活化可用反義寡核苷酸和（或）核酶抑制癌。Durai島素樣生長因子結合蛋白-4（IGFBP-4）導入大腸癌 HT-29 荷瘤模型內(nèi)，IGFBP-4治療組較對照組，Bax 表達增加，Bcl-2 表達下降，腫瘤細胞凋亡增加，密度降低，有效的抑制了鼠移植瘤的生長。Ras在大腸癌中約有 50%的突變突變的腫瘤治療有一定價值。Dvory 等6構建了三率，所以選擇性針對 Ras組 Ras 突變型的結腸癌模型，分別是 R1，SW480 和 HCT116。然后將攜帶Bax,caspase-8 和 PKG

45、 的導入到上述腫瘤細胞內(nèi)，有效地抑制了腫瘤的形成。選擇性的過表達前凋亡對 Ras突變的結腸癌有很好的抑制作用，而正常組織的細胞生長不受影響。因此，這種療法對 Ras 突變的大腸癌臨床治療有一定的指導意義。Lledo S 等7應用反義核算技術將 anti-k-ras 和antiomerase 寡核苷酸注入結腸癌細胞 SW480 內(nèi)，有效地抑制了腫瘤細胞的增殖，其抑制效果取決于寡核苷酸的類型，劑量和作用時間，在劑量為 20mM 作用 48 小時后，細胞下降了 99.67%。反義 K-ras 和端粒酶的結合協(xié)同增強了腫瘤的抑制效應，為臨床治療提供了一定的實驗依據(jù)。抑癌又叫隱性癌、抗癌、腫瘤易感。這類

46、在控制細胞生長、增殖及分化過程中起著十分重要的負調(diào)節(jié)作用，并潛在抑制腫瘤生長。如果功能缺失、突變等異?？蓪е聬盒赞D(zhuǎn)化而發(fā)生腫瘤。因此可以通過恢復抑癌的功能來抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，一般將具有正常功能的野生型的抑癌（P53、P16、Rb 等）利用各種途徑轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞內(nèi)，重建失活得癌的功能，從而達到抑制腫瘤的細胞異常生長的目的。P53 的突變可見于 50%的結腸癌患者。因此改善 P53 的功能對結腸癌的治療顯得尤為重要。Rayburn 等8發(fā)現(xiàn) TLR9（toll-like receptor 9）激動劑可促進結腸癌細胞的凋亡，提高癌細胞對放，化療的敏感性，這與其改善等9發(fā)現(xiàn)P53 的功能相關，TL

47、R9 可作為未來結腸癌臨床治療的候選藥物。Aizup53 的負性調(diào)節(jié)因子 Mdm2 的抑制劑 Nutlin-3 可激活野生型的 p53 的表達，進而誘導了凋亡Bax 和P的表達，促進了G2/M 期阻滯，抑制腫瘤生長。Nutlin-3 為臨床無 P53 突變的結腸癌的治療提供了一定的實驗依據(jù)。1.3治療：一些或細菌的產(chǎn)物可將無毒或極低毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為毒性產(chǎn)物，導致細胞，這類被稱為。其治療原理將導入某一細胞，表達并生成特定酶類，轉(zhuǎn)化無毒或極低物前體為毒性產(chǎn)物，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。WolfgangWalther10等在大腸癌細胞的鼠荷瘤模型（CoLo5734 和 SW480）體內(nèi)注射 CD，在治

48、療五天后，瘤體內(nèi)注射組較對照組腫瘤增長顯著降低鼠體內(nèi) CDmRNA 和蛋白水平顯著升高，CD快速注射有效抑制腫瘤生長，增強抗腫瘤效應。Hiraoka 等11攜帶 CD的 RCR 載體門脈注射大腸癌細胞 CT26 肝轉(zhuǎn)移荷瘤模型中，腫瘤細胞 RCR 表達量升高，腫瘤生長受到抑制。Li 等12CD偶聯(lián)放療能夠協(xié)同增強抗腫瘤療效，在大腸癌細胞株（HR8348）的荷瘤模型中，CD聯(lián)合放療使腫瘤體積減小了 81.6%，對局部復發(fā)性結腸癌有一定療效。由此可見 CD是一種有效的抗腫瘤，為治療治療大腸癌提供了理論依據(jù)，為臨床治療大腸癌提供了較好的方法。1.4 抗腫瘤生成形成治療：1971 年Folkman 提出了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是依賴型的，阻滯生成是遏制腫瘤生長的有效策略這一學說。現(xiàn)已針對腫瘤形成的分子機制所設計了各種抗生成治療策略，并已成為目前腫瘤治療的熱點領域。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有賴于點的形成，腫瘤的的形成取決于促生成分子和抗分子二者之間的平衡。促生成因子是腫瘤形成所必需的，其中最重要的內(nèi)皮生長因子（VEGF），大腸癌患者中的 VEGF 表達水平與腫瘤