1、分子流行病學(xué)Molecular Epidemiology第一頁，共一百二十八頁。第1頁，共128頁。 Contents1.Introduction2.Research methods3.Brief introduction to common laboratory techniques4.Utilization of molecular epidemiology5.Example for molecular epidemiological researches6.Prospect (look into the future)第二頁，共一百二十八頁。第2頁，共128頁。 Section one

2、Introduciton 第三頁，共一百二十八頁。第3頁，共128頁。一、分子流行病學(xué)的概念及其發(fā)展 Definition and progresses of molecular epidemiology （一）分子流行病學(xué)的概念 Definition of molecular epidemiology 分子流行病學(xué)(molecular epidemiology)是應(yīng)用分子生物學(xué)的基本理論和技術(shù)，研究疾病或健康的人群現(xiàn)象。它從分子水平揭示影響疾病或健康分布的因素，為更有效地控制疾病和促進(jìn)健康提供基因或分子水平的研究方法和防治手段。第四頁，共一百二十八頁。第4頁，共128頁。 Molecular

3、 epidemiology is a branch of epidemiology that combines theories and methods in both epidemiology and molecular biology. What defines molecular epidemiology, as opposed to conventional epidemiology, is its use of biological and in particular genetic markers as a measure of the propensity of developi

4、ng a disease or as an indicator of a disease or an exposure in the study of the distribution and cause of disease. 第五頁，共一百二十八頁。第5頁，共128頁。Molecular epidemiology has the same objectives as conventional epidemiology: to study the occurrence, development and prognosis of disease, to evaluate the effecti

5、veness of preventive and therapeutic interventions, and to provide essential evidence for clinical and healthcare decision making.第六頁，共一百二十八頁。第6頁，共128頁。 概念的演變： 近20年來分子生物學(xué)被引入流行病學(xué)研究領(lǐng)域。 使流行病學(xué)研究中的組間比較更為準(zhǔn)確； 對(duì)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)更為明確； 對(duì)暴露與疾病發(fā)生過程的研究更為精確。 目前，分子流行病學(xué)成為現(xiàn)代流行病學(xué)的一個(gè)重要組成部分。 第七頁，共一百二十八頁。第7頁，共128頁。 最早使用“分子流行病學(xué)”這一

6、術(shù)語的是Kilboure，他于 1972年用分子生物學(xué)技術(shù)探討了流感病毒抗原變異與流感大流行之間的相互關(guān)系，旨在通過研究病毒分子結(jié)構(gòu)，來闡明流感發(fā)生大流行的原因。 但作者并未解釋“分子流行病學(xué)”的涵義。之后有關(guān)學(xué)者相繼使用這一術(shù)語，不斷有一些解釋。 第八頁，共一百二十八頁。第8頁，共128頁。 1993年Schulte出版了第一部分子流行病學(xué)專著，并給分子流行病學(xué)定義為，“在流行病學(xué)研究中，應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)志物，包括生化的、分子的、生理學(xué)的、免疫學(xué)的、遺傳學(xué)的等信號(hào)，這些事件信號(hào)代表致病因子與所致疾病之間連續(xù)過程中一個(gè)個(gè)相關(guān)的環(huán)節(jié)?！?第九頁，共一百二十八頁。第9頁，共128頁。 （二）血清流行病

7、學(xué)定義 血清流行病學(xué)(seroepidemiology)是應(yīng)用血清學(xué)方法檢測人群中特異性抗原、抗體、各種代謝產(chǎn)物、遺傳標(biāo)記、生化指標(biāo)、營養(yǎng)成分等血液成分，借以了解疾病或健康狀況在人群中的分布及其影響因素，探討疾病發(fā)生的原因并評(píng)價(jià)預(yù)防措施的效果。血清流行病學(xué)是流行病學(xué)的一個(gè)重要分支之一。 第十頁，共一百二十八頁。第10頁，共128頁。 血清流行病學(xué)有狹義和廣義之分。 而廣義上的血清流行病學(xué)實(shí)際上由于分子流行病學(xué)的迅猛發(fā)展，已逐步融入分子流行病學(xué)之中，實(shí)際上已屬于分子流行病學(xué)的研究范疇。所以，我們不再將血清流行病學(xué)單作一章介紹，而是并于分子流行病學(xué)這一章中一并介紹，更具實(shí)際意義，也更有助于讀者對(duì)分

8、子流行病學(xué)的理解。 第十一頁，共一百二十八頁。第11頁，共128頁。二、與傳統(tǒng)流行病學(xué)的關(guān)系 Relationship between conventional and molecular epidemiology 分子流行病學(xué)就是要揭開暴露與疾病之間的“黑匣子”之謎。 第十二頁，共一百二十八頁。第12頁，共128頁。Conventional EpidemiologyExposure DiseaseMolecular Epidemiology第十三頁，共一百二十八頁。第13頁，共128頁。 暴露標(biāo)志 疾病標(biāo)志暴露 內(nèi)劑量 生物學(xué) 早期生物 結(jié)構(gòu)和 臨床疾病 預(yù)后意義 效應(yīng)劑量 學(xué)效應(yīng) 功能改變

9、 易感性標(biāo)志 傳統(tǒng)流行病學(xué)與分子流行病學(xué)的關(guān)系第十四頁，共一百二十八頁。第14頁，共128頁。三、分子流行病學(xué)的發(fā)展 Progress of molecular epidemiology 分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展： 1分子流行病學(xué)的研究方法越來越多： 如在分子流行病學(xué)產(chǎn)生的初期，主要研究手段是質(zhì)粒圖譜分析、核酸雜交等技術(shù)，且程序煩瑣、費(fèi)事費(fèi)力，目前許多新的技術(shù)已應(yīng)用于分子流行病學(xué)研究，且可自動(dòng)化或半自動(dòng)化測定，如聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）、DNA序列分析、酶定量分析等等。 2研究內(nèi)容越來越多：已從研究傳染病的病原體、傳染源、傳播途徑，逐漸延伸至非

10、傳染性疾病或健康狀態(tài)，以及人群易感性和疾病預(yù)防、治療措施的評(píng)價(jià)等等。 3應(yīng)用范圍越來越大：從預(yù)防醫(yī)學(xué)到整個(gè)生命科學(xué)。第十五頁，共一百二十八頁。第15頁，共128頁。 Section two Research methods 第十六頁，共一百二十八頁。第16頁，共128頁。一、生物標(biāo)志的確定與標(biāo)本采集 Determination of biomarkers and collection of specimens （一）生物標(biāo)志的確定(determination of biomarkers) 生物標(biāo)志(biomarker)分為三大類，即暴露標(biāo)志(exposure marker)、效應(yīng)標(biāo)志(effe

11、ct marker)和易感標(biāo)志(susceptibility marker)。 這三類標(biāo)志只不過是些籠統(tǒng)指標(biāo)，具體到某一種疾病或健康狀況，應(yīng)根據(jù)研究內(nèi)容與目的確定與之密切相關(guān)連的具體標(biāo)志。第十七頁，共一百二十八頁。第17頁，共128頁。 1.暴露標(biāo)志的選擇 (selection of exposure markers) 應(yīng)選擇那些最具代表暴露劑量而又十分客觀、穩(wěn)定、敏感、特異的標(biāo)志。 暴露標(biāo)志是指那些與疾病或健康有關(guān)的暴露因素的 生物標(biāo)志，包括外暴露標(biāo)志和內(nèi)暴露標(biāo)志。 外暴露標(biāo)志(external exposure marker)：暴露因素進(jìn)入機(jī)體之前的標(biāo)志，如病毒、細(xì)菌、支原體等微生物及毒素

12、、粉塵、煙霧、化學(xué)致癌物等。 內(nèi)暴露標(biāo)志(internal exposure marker) ：暴露因素進(jìn)入機(jī)體之后的標(biāo)志。 第十八頁，共一百二十八頁。第18頁，共128頁。 2.效應(yīng)標(biāo)志的選擇 (selection of effect markers) 機(jī)體在暴露于有關(guān)危險(xiǎn)因子以后到疾病發(fā)生這期間，會(huì)產(chǎn)生與之相對(duì)應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)(biological effect)或稱為生物學(xué)反應(yīng) (biological response)。因此，可以產(chǎn)生功能性或結(jié)構(gòu)性變化的生物標(biāo)志，如發(fā)生變異的基因、產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物等。 應(yīng)選擇那些最能代表生物學(xué)效應(yīng)實(shí)際情況的標(biāo)志，且同樣應(yīng)具特異、敏感、簡便等優(yōu)點(diǎn)。 第十九

13、頁，共一百二十八頁。第19頁，共128頁。3.易感標(biāo)志的選擇 (Selection of susceptibility marker) 易感標(biāo)志是指機(jī)體對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展易感程度的生物標(biāo)志。 在確定易感人群時(shí)，通常選擇免疫學(xué)指標(biāo)和易感基因作為易感測定標(biāo)志。第二十頁，共一百二十八頁。第20頁，共128頁。 （二）標(biāo)本的采集(Collection of specimens) 標(biāo)本的采集、運(yùn)送和儲(chǔ)存是實(shí)驗(yàn)室分析的第一步，也是很關(guān)鍵的一步。為了采集高質(zhì)量的標(biāo)本，應(yīng)注意以下幾個(gè)問題：第二十一頁，共一百二十八頁。第21頁，共128頁。 1.采集最適標(biāo)本 (Collection of optimal spec

14、imens) 首要問題是有的放矢，一般根據(jù)已有流行病學(xué)資料和疾病的臨床表現(xiàn)進(jìn)行分析，初步推斷可能是哪類疾病，再根據(jù)發(fā)病規(guī)律和病程決定采集何種標(biāo)本?？梢詮囊韵聨讉€(gè)方面考慮取材部位： 從病原體入侵部位取材； 從病原體感染的靶器官取材； 根據(jù)病原體的排泄途徑取材； 非傳染性疾病主要從受損組織取材或其它能反映效應(yīng)指標(biāo)的標(biāo)本； 直接采集病原標(biāo)本。 此外，根據(jù)疾病的種類、病情采集標(biāo)本。有的疾病需要在發(fā)病的早期采集標(biāo)本，有的則需要在早期和晚期采集標(biāo)本。第二十二頁，共一百二十八頁。第22頁，共128頁。常采集的標(biāo)本有： 病原體標(biāo)本； 體液標(biāo)本，如血液、尿液、胃液、精液、分泌物等； 組織標(biāo)本，如機(jī)體各種組織、毛

15、發(fā)、媒介體等。第二十三頁，共一百二十八頁。第23頁，共128頁。 2.標(biāo)本的運(yùn)送與儲(chǔ)存 (Transport and storage of specimens) 標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送往實(shí)驗(yàn)室，馬上檢測最好，如不能馬上進(jìn)行應(yīng)注意適當(dāng)保存。根據(jù)情況可采取冷凍、冷藏運(yùn)輸，以保持活性。 采集的標(biāo)本應(yīng)放入適當(dāng)?shù)娜萜鳎圆灰讚p壞和泄漏，特別是烈性病原體標(biāo)本，應(yīng)加金屬套罐，派專人專車運(yùn)送。 采集的標(biāo)本除了防止擴(kuò)散，也應(yīng)防止被污染包括生物性的、化學(xué)的或其它標(biāo)本的污染。 采集的標(biāo)本儲(chǔ)存后應(yīng)不影響檢測結(jié)果，即在任何時(shí)間檢測都可獲得一致的結(jié)果。 所有的標(biāo)本都應(yīng)有詳細(xì)的記錄和標(biāo)簽等。第二十四頁，共一百二十八頁。第24頁

16、，共128頁。 二、常用實(shí)驗(yàn)室方法(Common lab methods) （一）核酸研究方法(Research methods of nucleic acid) 隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，人們清楚地了解到生物的任何性狀（表型）是由于其本身的遺傳物質(zhì) 核酸（DNA或RNA）所決定的。對(duì)于核酸的分析最能客觀地反映各種生物現(xiàn)象（效應(yīng)）的本質(zhì)。第二十五頁，共一百二十八頁。第25頁，共128頁。 1.核酸中堿基含量的測定 (Assay of basyl content in nucleic acid) 常用的是G+C含量的測定。親緣關(guān)系近的病原體，它們的G+C含量相同或近似，親緣關(guān)系遠(yuǎn)的病原體

17、，它們的含量不同。 因此，可用于傳染病傳染源和傳播途徑的分析。但在某些情況下，G+C含量相同或近似的病原體其親緣關(guān)系不一定近似。因?yàn)樯鲜龇治鲋环从沉撕怂岬暮塑账峤M成，并不能反映核苷酸序列。第二十六頁，共一百二十八頁。第26頁，共128頁。 2.核酸電泳和限制性內(nèi)切酶圖譜分析 (Nucleic acid electrophoresis and restriction enzyme analysis) 某些病原體，如引起腹瀉的輪狀病毒，它們的核酸是分節(jié)段的，直接提取核酸即可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)生特定的電泳帶，每一型的輪狀病毒的電泳帶具有特定的數(shù)目和大小、分布特征等。 其它大多數(shù)病原體或生物標(biāo)本的

18、核酸，可用限制性內(nèi)切酶酶切消化以后，再進(jìn)行電泳分析，不同的病原體或生物標(biāo)本產(chǎn)生不同電泳圖譜。 第二十七頁，共一百二十八頁。第27頁，共128頁。 圖2 T-A克隆后酶切鑒定結(jié)果 Fig 2 Enzyme digestion analysis of T-A control clone fragment of JR23 strain 第二十八頁，共一百二十八頁。第28頁，共128頁。 3.核酸雜交 (nucleic acid hybridyzation) 核酸雜交需要一個(gè)探針(probe)，即一種標(biāo)有示蹤分子的特異單鏈 DNA 或 RNA分子，這種探針可與待測標(biāo)本中的特異性序列結(jié)合。 常用于生物標(biāo)

19、本中病原體特異核苷酸序列的檢測。 常用的有斑點(diǎn)雜交、原位雜交、轉(zhuǎn)印雜交等方法。第二十九頁，共一百二十八頁。第29頁，共128頁。 4.寡核苷酸指紋圖 (oligonucleotide finger printing) 病原體或生物標(biāo)本的核酸經(jīng)特定的酶消化后，可進(jìn)行雙向電泳，然后再進(jìn)行放射自顯影，顯示出一定的圖譜特征，稱為指紋圖 (finger printing)。此圖譜具有特異性。 常用于微生物同源性分析。第三十頁，共一百二十八頁。第30頁，共128頁。 5.質(zhì)粒圖譜分析(plasmid figure analysis) 不同的細(xì)菌的質(zhì)粒DNA不同，因此可對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切反應(yīng)、電泳、圖譜分

20、析。 常用于微生物同源性分析。第三十一頁，共一百二十八頁。第31頁，共128頁。 6. PCR(polymerase chain reaction) PCR是一種80年代初發(fā)展起來的一種高效體外基因DNA擴(kuò)增技術(shù)，需要一對(duì)寡核苷酸引物（上游和下游各一），在耐熱的DNA多聚酶的作用下，合成特異的DNA序列，包括高溫變性、低溫退火、中溫引物延伸三個(gè)步驟，這三個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，在短時(shí)間內(nèi)可擴(kuò)增至幾百萬倍。 此法具有高度特異、敏感、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。 常用于基因擴(kuò)增、克隆、標(biāo)本中特異性核苷酸序列檢測等。第三十二頁，共一百二十八頁。第32頁，共128頁。 7. DNA序列分析 (DNA sequencin

21、g) DNA序列分析有了很大的發(fā)展，常用雙脫氧末端終止法。由于與計(jì)算機(jī)相結(jié)合產(chǎn)生了自動(dòng)化分析儀，使核酸序列分析變得非常簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠。 該方法是所有核酸分析技術(shù)中最可靠的一種方法，可用于任何來源的兩個(gè)或多個(gè)DNA片段之間核苷酸序列的比較。 所以，是追蹤傳染源、分析傳播途徑、闡明流行規(guī)律十分可靠的分子流行病學(xué)方法。 第三十三頁，共一百二十八頁。第33頁，共128頁。 8.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 ( single-stranded conformation polymorphism,SSCP) 是將基因擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈核酸，然后進(jìn)行非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），觀察區(qū)帶的遷移率。由

22、于遷移率與核酸的構(gòu)象密切相關(guān)，只有一個(gè)核苷酸的突變就可以改變分子構(gòu)象，因而表現(xiàn)在電泳遷移率上的差別。 此法可以檢測基因突變。但不能確定基因變異的位點(diǎn)及方式，最后還需要進(jìn)行序列測定。 SSCP可用于病原體和生物標(biāo)本的研究。第三十四頁，共一百二十八頁。第34頁，共128頁。 9.基因定點(diǎn)突變技術(shù) (Site-directed mutagenesis) 此技術(shù)可隨意在克隆的基因上進(jìn)行突變，然后測量突變后基因功能的改變。常用于基因結(jié)構(gòu)與功能的研究。第三十五頁，共一百二十八頁。第35頁，共128頁。 （二）蛋白質(zhì)研究方法(Research methods of proteins) 只要有蛋白質(zhì)在，就有基

23、因在，蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，幾乎所有生物體都具有蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究分析，實(shí)際上是間接地對(duì)其相對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行分析，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的氨基酸（aa）順序是由相對(duì)應(yīng)的核苷酸順序決定的，因此蛋白質(zhì)分析也具有特異性。 蛋白質(zhì)技術(shù)包括PAGE、肽圖分析(peptide mapping)、轉(zhuǎn)印技術(shù)、色譜技術(shù)、測序技術(shù)等。 第三十六頁，共一百二十八頁。第36頁，共128頁。 （三）酶學(xué)技術(shù)(Enzymatic techniques) 大多數(shù)酶屬于蛋白質(zhì)，因此可以用分離蛋白質(zhì)的方法分離酶，并可在特定條件下定性、定量測定其活性，同樣也可以測其分子量。第三十七頁，共一百二十八頁。第37頁，

24、共128頁。 （四）免疫學(xué)技術(shù)(Immunological techniques) 分子流行病學(xué)的研究中，常用分子免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)，如酶標(biāo)記（EIA）、熒光標(biāo)記（FIA）、放射標(biāo)記（RIA）三大標(biāo)記技術(shù)。 單克隆抗體（McAb）技術(shù)的應(yīng)用為免疫學(xué)技術(shù)開辟了新的天地，不僅可以用于疾病的診、治，還可用于病原體同源性分析等。 第三十八頁，共一百二十八頁。第38頁，共128頁。 （五）生物芯片技術(shù)(Biochip techniques) 生物芯片(biochip)技術(shù)是近幾年才發(fā)展起來的一種基于分子雜交原理的檢測技術(shù)。它是通過縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成

25、于硅芯片或玻璃芯片表面的微型分析系統(tǒng)，以便對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因或其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。 按照芯片上固化的生物材料的不同，可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片。與傳統(tǒng)的儀器檢測相比，生物芯片有高通量、微型化、自動(dòng)化、成本低、防污染等優(yōu)點(diǎn)。目前最成功的是基因芯片。 第三十九頁，共一百二十八頁。第39頁，共128頁。 （六）其他技術(shù)(other techniques) 分子流行病學(xué)應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)很多，除了上述介紹的技術(shù)外，還有各種色譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、其他理化分析等實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。 當(dāng)然分子流行病學(xué)研究方法也離不開傳統(tǒng)流行病學(xué)的現(xiàn)場流行病學(xué)研究方法，即描

26、述性、分析性、干預(yù)性研究等（見有關(guān)章節(jié)）。傳統(tǒng)流行病學(xué)研究方法結(jié)合生物學(xué)標(biāo)志檢測，從分子或基因水平更深一層次揭示病因、致病機(jī)制等，是當(dāng)前常用的分子流行病學(xué)研究模式。 第四十頁，共一百二十八頁。第40頁，共128頁。 三、研究設(shè)計(jì)要點(diǎn)(Key points for research design) 分子流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)，是在傳統(tǒng)流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)的原理和模式的基礎(chǔ)上，再考慮分子生物學(xué)技術(shù)或生物學(xué)標(biāo)志的應(yīng)用帶來的有關(guān)問題。 生物學(xué)標(biāo)志是指代表生物生理、組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞以及大分子的可識(shí)別物質(zhì)。如前所述，分子流行病學(xué)就是要揭開暴露與疾病之間的“黑匣子”之謎。 因此，在進(jìn)行分子流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)時(shí)，首先應(yīng)

27、按照傳統(tǒng)流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)的一般要求，如明確的研究目的，選擇有代表性的樣本及數(shù)量，各種對(duì)照組的設(shè)置，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的可比性、方法的準(zhǔn)確性、合適的資料統(tǒng)計(jì)分析方法、偏倚的控制等。 這些是流行病學(xué)研究的最基本要點(diǎn)，如果脫離這些要點(diǎn)，即使在研究中使用了先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，也得不到準(zhǔn)確的研究結(jié)果。 第四十一頁，共一百二十八頁。第41頁，共128頁。 以下幾點(diǎn)供進(jìn)行分子流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)時(shí)參考。 （一）明確研究目的 進(jìn)行研究設(shè)計(jì)時(shí)首先要明確該研究要解決的問題，確實(shí)做到有的放矢。 （二）選擇客觀準(zhǔn)確的測定指標(biāo) 研究中所選擇的各種“標(biāo)志”，必須是客觀的、穩(wěn)定的和有代表性的測定指標(biāo)，并且容易檢測到。 生物學(xué)標(biāo)志的選

28、擇是否恰當(dāng)，決定著分子流行病學(xué)研究的成敗。第四十二頁，共一百二十八頁。第42頁，共128頁。 （三）選擇科學(xué)的測定方法 所選擇的測定方法應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，使用簡便快速、成熟可靠、被公認(rèn)的測定方法。應(yīng)用新的測定方法時(shí)，應(yīng)注意所得結(jié)果和其他方法所得結(jié)果的可比性。 （四）研究模式的選擇 流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)模式一般分為描述流行病學(xué)、分析流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)流行病學(xué)研究模式。不論那種研究模式，都可以引入分子生物學(xué)理論和技術(shù)，構(gòu)成分子流行病學(xué)研究。 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)难芯磕Ｊ健?第四十三頁，共一百二十八頁。第43頁，共128頁。 （五）樣本的選擇 樣本的選擇是任何流行病學(xué)研究中不可避免的問題，分子流行

29、病學(xué)研究樣本的選擇其原理和方法與一般流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)相同，但對(duì)分子流行病學(xué)來說，樣本及其大小的選擇難度更大一點(diǎn)。要特別注意樣本來源的地區(qū)、人群、遺傳因素和環(huán)境因素的交互作用。 （六）質(zhì)量控制 質(zhì)量控制是分子流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)中一個(gè)重要部分，它直接關(guān)系到所得結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性、科學(xué)性和可信性。第四十四頁，共一百二十八頁。第44頁，共128頁。 1.一般性實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制 確定標(biāo)本采集方案：包括采集部位、時(shí)間及方法；標(biāo)本采集后的貯存問題等； 藥品和試劑的選擇：同一測定指標(biāo)最好使用同一批號(hào)的藥品和試劑。更換批號(hào)時(shí)應(yīng)進(jìn)行對(duì)比和標(biāo)準(zhǔn)化； 實(shí)驗(yàn)方法的確定：對(duì)于同一種生物標(biāo)志的測定要用統(tǒng)一的方法； 儀器設(shè)備的確

30、定：如無特殊情況，不要更換儀器。調(diào)校后一般不應(yīng)重新調(diào)校； 操作要規(guī)范化：每一實(shí)驗(yàn)步驟都要規(guī)范化，保證同一操作者或操作者之間的可重復(fù)性。 第四十五頁，共一百二十八頁。第45頁，共128頁。 2.設(shè)立多種對(duì)照 實(shí)驗(yàn)開始前就應(yīng)設(shè)立好對(duì)照，一般應(yīng)設(shè)以下對(duì)照： 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照（陽性對(duì)照）：是指含有待測或某種生物標(biāo)志，并已知其含量的生物標(biāo)本； 空白對(duì)照（陰性對(duì)照）：是指不含待測或某種生物標(biāo)志的生物標(biāo)本； 重復(fù)對(duì)照（相關(guān)對(duì)照）：是指來源于同一份待測生物標(biāo)本具有不同編號(hào)的多份生物標(biāo)本或與待測生物標(biāo)本有關(guān)系的生物標(biāo)本。第四十六頁，共一百二十八頁。第46頁，共128頁。 3.預(yù)實(shí)驗(yàn) 正式實(shí)驗(yàn)開始前應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保所用

31、方法的可重復(fù)性。一般包括本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室之間不同操作者之間的交叉重復(fù)實(shí)驗(yàn)等。 4.誤差、偏倚的控制 分子生物學(xué)技術(shù)雖然敏感、精確，但導(dǎo)致誤差、偏倚的因素也很多。包括: 檢測者本身、試劑、藥品、材料、儀器等； 同一受檢者的生理生化變化； 人群中的生物遺傳學(xué)差異等方面。 應(yīng)針對(duì)具體環(huán)節(jié)制定詳細(xì)的質(zhì)控方法。第四十七頁，共一百二十八頁。第47頁，共128頁。 （七）分析與總結(jié) (Analyses and summary) 在研究設(shè)計(jì)中要預(yù)測研究結(jié)果，事先確定明確的資料統(tǒng)計(jì)分析方法，并擬定資料的總結(jié)、分析與報(bào)告的詳細(xì)計(jì)劃。第四十八頁，共一百二十八頁。第48頁，共128頁。 Section three

32、Common lab techniques 第四十九頁，共一百二十八頁。第49頁，共128頁。 正確應(yīng)用實(shí)驗(yàn)技術(shù)是分子流行病學(xué)研究成功的關(guān)鍵。 （一）生物標(biāo)本中核酸的提取(Extraction of nucleic acid from biospecimens) 核酸攜帶有生物體的遺傳物質(zhì)，是生物體細(xì)胞的重要組成成分。 基因分型、變異分析、多態(tài)性分析、基因序列分析等是分子流行病學(xué)研究中非常重要的手段之一。但在進(jìn)行這些分析之前，首先要提取和純化核酸。第五十頁，共一百二十八頁。第50頁，共128頁。 1. DNA的提取(Extraction of DNA) 通過破壞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核膜后，再除去蛋白質(zhì)

33、可獲得基因組DNA。 基本過程： （1）在EDTA和變性劑存在下加入蛋白酶K消化除去蛋白質(zhì)； （2）用 RNA 酶除去 RNA； （3）用酚和氯仿抽提 DNA； （4）用乙醇和異丙醇把 DNA從溶液中離心沉淀出來。第五十一頁，共一百二十八頁。第51頁，共128頁。 2. RNA的提取 (Extraction of RNA) RNA提取的基本過程： 裂解細(xì)胞； 除去蛋白質(zhì)； 提取核酸混合物； 將RNA與DNA分離。第五十二頁，共一百二十八頁。第52頁，共128頁。 （二）質(zhì)粒DNA的提取(Extraction of plasmid DNA) 一般首先培養(yǎng)足夠量的細(xì)菌，先將所研究的質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)

34、化感受態(tài)細(xì)菌，然后進(jìn)行克隆，培養(yǎng)擴(kuò)增一定量后，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行其它分析。 提取方法很多，其共同點(diǎn)是： 離心沉淀細(xì)菌； 裂解細(xì)菌； 除去細(xì)菌殘壁、染色體DNA、RNA； 異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA。 實(shí)際應(yīng)用中，有小量提取法和大量提取法之分。第五十三頁，共一百二十八頁。第53頁，共128頁。 （三）DNA限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù) (Restriction endonuclease technique of DNA) 限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)是一類能識(shí)別雙鏈 DNA 分子中特異核苷酸序列的 DNA 水解酶，是基因工程、基因診斷、DNA序列分析中常用的工具酶。 因此，

35、內(nèi)切酶酶切技術(shù)是基因分子生物學(xué)中最基本、最重要的技術(shù)。 限制性內(nèi)切酶主要來自于原核細(xì)胞，每種酶都有自己特定的反應(yīng)條件如緩沖液、反應(yīng)溫度、作用時(shí)間等，根據(jù)研究目的可選用小量酶解反應(yīng)，大量酶解反應(yīng)和雙酶解反應(yīng)等。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)酶切產(chǎn)物（DNA片段）進(jìn)行鑒定分析。 第五十四頁，共一百二十八頁。第54頁，共128頁。表1 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的一般條件條件反應(yīng)類型小量(分析用)大量(制備用)反應(yīng)體積20 l根據(jù)需要DNA量0.5-1.0 g根據(jù)需要酶用量1-2u/g DNA1-2u/g DNA10 x緩沖液2l根據(jù)需要牛血清白蛋白100 g/ml100 g/ml反應(yīng)溫度根據(jù)需要根據(jù)需要反應(yīng)

36、時(shí)間2 h2 h(可適當(dāng)延長)第五十五頁，共一百二十八頁。第55頁，共128頁。 （四）DNA重組技術(shù)(Recombination techniques of DNA DNA重組（DNA recombination)是指將兩個(gè)基因（或 DNA 片段）經(jīng)內(nèi)切酶消化切割，互相交換連接形成新的DNA片段的過程。 常將目的基因插入質(zhì)粒 DNA 載體之中，進(jìn)行基因重組，基因定點(diǎn)突變分析，結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究，其功能往往是通過基因表達(dá)來測定的。 DNA重組的方法主要有粘端連接法、平端連接法和平-粘連接法。具體采用何種方法，要根據(jù)目的基因末端的性質(zhì)、載體 DNA 經(jīng)內(nèi)切酶切割后的性質(zhì)來選擇應(yīng)用。第五十六頁，

37、共一百二十八頁。第56頁，共128頁。 1.粘端連接法 粘端連接法有兩種情況，主要取決于目的DNA粘端的性質(zhì)。 目的DNA兩端為相同的粘性末端：帶有相同粘性末端的目的DNA可以克隆到具有匹配的相同粘性末端的線性質(zhì)粒DNA中。 優(yōu)點(diǎn)：目的DNA和質(zhì)粒DNA連接處的酶切位點(diǎn)仍然保留。 缺點(diǎn)：質(zhì)粒DNA容易自身環(huán)化，重組體可能帶有目的DNA的串聯(lián)拷貝，目的DNA可能反方向插入。 第五十七頁，共一百二十八頁。第57頁，共128頁。第五十八頁，共一百二十八頁。第58頁，共128頁。 目的DNA兩端為非互補(bǔ)的粘性末端：用兩種不同的內(nèi)切酶對(duì)目的DNA進(jìn)行消化時(shí)即可產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突出端的DNA 片段。用同樣的兩

38、種酶將質(zhì)粒 DNA 切開，這樣載體DNA末端和目的DNA末端完全互補(bǔ)，在DNA連接酶的作用下，二者就可形成重組體。 此法的優(yōu)點(diǎn)是： 原酶切位點(diǎn)仍然保留； 目的DNA只以一個(gè)方向插入至質(zhì)粒DNA中，故此法稱為定向克??； 載體DNA末端不互補(bǔ)，不能自身環(huán)化。 第五十九頁，共一百二十八頁。第59頁，共128頁。 2.平端連接法 某些內(nèi)切酶不產(chǎn)生粘性末端，而是產(chǎn)生平端，也稱頓性末端。有些情況下，目的 DNA雖經(jīng)內(nèi)切酶切割產(chǎn)生粘性末端，但在載體DNA上找不到與之相匹配的酶切位點(diǎn)，這種情況下需將二者或其中之一的粘性末端補(bǔ)平，再采用平端連接法連接。第六十頁，共一百二十八頁。第60頁，共128頁。 平接法：目

39、的DNA和載體DNA的平端或粘性末端補(bǔ)齊后用DNA連接酶連接。 接頭法：此法是利用核酸化學(xué)合成技術(shù)，合成一種含有特定酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA片段（稱為接頭），再用DNA連接酶將接頭連接到目的DNA的兩端，然后用該內(nèi)切酶切割成能與載體DNA粘性末端互補(bǔ)的粘性末端，最后將二者連接。 此法適用于沒有所需內(nèi)切酶位點(diǎn)的目的DNA。第六十一頁，共一百二十八頁。第61頁，共128頁。第六十二頁，共一百二十八頁。第62頁，共128頁。 3.平-粘連接法 此法在目的DNA和載體DNA只有一個(gè)匹配酶切位點(diǎn)，又要考慮目的DNA插入方向時(shí)使用，也屬于定向克隆。此法優(yōu)點(diǎn)是單方向插入，非重組體克隆背景低。 上述各種方法建立的

40、重組質(zhì)粒DNA是否成功需要鑒定。 常用方法有： 互補(bǔ)； 插入失活； 菌落原位雜交； 限制性內(nèi)切酶分析； DNA序列分析。 實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)具體情況來選擇鑒定方法。第六十三頁，共一百二十八頁。第63頁，共128頁。 （五）DNA的凝膠電泳(Gel electrophoresis of DNA) 電泳技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。常用瓊脂糖凝膠電泳和PAGE或SDS分離、鑒定、純化DNA或RNA。 此法具有簡便、快速、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，并可將分離片段（電泳帶）從凝膠中回收用于 DNA 重組或克隆。第六十四頁，共一百二十八頁。第64頁，共128頁。 1.瓊脂糖凝膠電泳 (Agarose gel e

41、lectrophoresis) 瓊脂糖加熱至90-100即可熔化成透明液體，澆到電泳槽內(nèi)，冷卻后即可形成凝膠，用于電泳，常用TAE作為電泳緩沖液。 電泳時(shí)根據(jù)DNA片段大小確定凝膠濃度，一般用0.8-1.0%。一般檢測鑒定時(shí)，用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，要想從凝膠中回收DNA，需要低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，若要分析單鏈DNA，需要堿性瓊脂糖凝膠電泳。 第六十五頁，共一百二十八頁。第65頁，共128頁。圖 3 pBSK+-NDV HN DNA瓊脂糖凝膠電泳 1：Marker；2,3,5,6,9,10,12：突變株；4,7,8,11：野毒株 第六十六頁，共一百二十八頁。第66頁，共128頁。 2.聚丙烯酰胺

42、凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE PAGE分兩種： 非變性PAGE：非變性PAGE用于分離純化雙鏈DNA片段，缺點(diǎn)是不能測定DNA的大小，因?yàn)檫w移率受堿基組成和序列的影響，同樣大小的DNA片段由于空間結(jié)構(gòu)不同，其遷移率出現(xiàn)差異。 變性PAGE：變性PAGE用于分離和純化單鏈DNA片段，DNA的遷移率與堿基組成和序列有關(guān)，可用于DNA序列分析，分離同位素標(biāo)記的探針等。第六十七頁，共一百二十八頁。第67頁，共128頁。 1 2 3 4 5圖 4 風(fēng)疹病毒E1基因表達(dá)產(chǎn)物SDS（上清，考馬斯亮藍(lán)染色）1: Negative control G

43、S1152: Plasmid control pGAPZA3: Low range protein marker4: Expression strain 15: Expression strain 2第六十八頁，共一百二十八頁。第68頁，共128頁。 3.從凝膠中回收和純化DNA (Recovery from gel and purificaiton of DNA) 在進(jìn)行基因克隆、重組、探針標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)中，需要從凝膠中回收DNA，回收的方法有： 低熔點(diǎn)瓊脂糖法 壓碎浸泡法 透析袋洗脫法 DEAE-纖維素膜法等。 上述每種方法均有各自的使用范圍、回收率和特點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)情況選擇合適的回收方法。第六十

44、九頁，共一百二十八頁。第69頁，共128頁。 （六）核酸雜交(Nucleic acid hybridization) 據(jù)DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，先制備一條帶有標(biāo)記的多核苷酸鏈作為探針,檢測標(biāo)本中與之相對(duì)應(yīng)的那條互補(bǔ)鏈，稱為核酸雜交 ( nucleic acid hybridization)。 核酸雜交技術(shù)具有高度特異性，廣泛用于對(duì)待測DNA或RNA進(jìn)行定性和半定量分析。 第七十頁，共一百二十八頁。第70頁，共128頁。 核酸探針分為基因組DNA探針、cDNA探針、cRNA探針及人工合成的寡核苷酸探針等。實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)研究目的選擇不同類型的探針。探針需用標(biāo)記物標(biāo)記。 標(biāo)記物一般分為放射性標(biāo)記和非放射

45、性標(biāo)記。兩種標(biāo)記方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，放射性標(biāo)記靈敏度和特異性高，但應(yīng)用不當(dāng)時(shí)放射性物質(zhì)易造成環(huán)境污染和人體損害，同時(shí)也比較昂貴。 所以，近年來非放射性標(biāo)記方法越來越多，并不斷完善。放射性標(biāo)記物有3H，14C，32P，35S，125I，131I等。非放射性標(biāo)記物有生物素(biotin)、地高辛(digoxigenin，Dig)、熒光素(fluorescin)、標(biāo)記金屬等。第七十一頁，共一百二十八頁。第71頁，共128頁。核酸雜交方法很多，如：斑點(diǎn)雜交(dot hybridization)原位雜交(In-situ hybridization)Southern雜交(Southern hybridizat

46、ion) Northern雜交(Northern hybridization)等。 第七十二頁，共一百二十八頁。第72頁，共128頁。 （七）聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR PCR 技術(shù)在分子流行病學(xué)研究中具有非常重要的地位。已被廣泛地應(yīng)用于體外基因擴(kuò)增、基因診斷、基因克隆、基因序列分析、基因定點(diǎn)突變分析等。 優(yōu)點(diǎn)是簡便、快速、靈敏等。 缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)室污染問題，易出現(xiàn)假陽性。第七十三頁，共一百二十八頁。第73頁，共128頁。 基本原理是： 根據(jù)待測基因兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物，即上游引物和下游引物，在標(biāo)本中模板存在的情況下，耐熱DNA聚合酶可利用四種dNTP使

47、引物沿著模板延伸。整個(gè)過程可分為三個(gè)步驟： 變性94-97 30-50S； 退火25-65 60-90S； 延伸70-74 60-120S。 一般重復(fù)25-30個(gè)循環(huán)，即可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。用雜交、PCR-SSCP、序列分析等對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。 PCR技術(shù)不斷發(fā)展和完善，并產(chǎn)生了一些改良的PCR方法，如定量PCR、原位PCR、RT-PCR、免疫PCR等等。 第七十四頁，共一百二十八頁。第74頁，共128頁。 （八）DNA序列分析(DNA sequencing) DNA序列分析是鑒定基因一級(jí)結(jié)構(gòu)、基因突變分析、突變株檢測等研究的重要手段。測序方法很多，常用的是雙脫氧末端終止法。 基本原理：

48、特異性引物和DNA模板相退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，在雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作用下進(jìn)行特異性鏈的終止，然后用PAGE區(qū)分長度相差一個(gè)核苷酸（nt）的DNA，通過一定的顯示閱讀nt序列。 目前測序工作已與計(jì)算機(jī)相結(jié)合，趨向于自動(dòng)化，因此大量測序儀應(yīng)運(yùn)而生，并得到廣泛應(yīng)用。第七十五頁，共一百二十八頁。第75頁，共128頁。固定末端ACGTTGCACGTA“A”反應(yīng) “C”反應(yīng) “G”反應(yīng) “T”反應(yīng) A AC ACG ACGTACGTTGCA ACGTTGC ACGTTG ACGTTACGTTGCACGTA ACGTTGCAC ACGTTGCACG ACGTTGCACGT 第七

49、十六頁，共一百二十八頁。第76頁，共128頁。第七十七頁，共一百二十八頁。第77頁，共128頁。PAGE： A C G T ACGTTGCACGTA ACGTTGCACGT ACGTTGCACG ACGTTGCAC ACGTTGCA ACGTTGC ACGTTG ACGTT ACGT ACG AC ADNA序列測定基本原理示意圖第七十八頁，共一百二十八頁。第78頁，共128頁。第七十九頁，共一百二十八頁。第79頁，共128頁。 （九）蛋白質(zhì)的SDS及肽圖分析(SDSof proteins and peptide analysis) 1.SDS 不同的蛋白質(zhì)由于肽鏈中氨基酸組成不同，其所帶電荷的

50、性質(zhì)和數(shù)量有差異，構(gòu)象也不同。因此，當(dāng)分子量相同的兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行PAGE時(shí)，它們的遷移率可能有很大差異。 當(dāng)在樣品中加入 SDS 和2-ME時(shí)，2-ME能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)分子的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，它的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)自身的電荷量，使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物帶有相同密度的負(fù)電荷。因此，消除了不同蛋白質(zhì)間原有電荷的影響。 第八十頁，共一百二十八頁。第80頁，共128頁。 SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合還能使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，為18A，而長軸則隨蛋白質(zhì)分子量成正比地變化。

51、這樣電泳時(shí)不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，遷移率只與蛋白質(zhì)分子量有關(guān)，就能測定樣品中的各蛋白數(shù)目和分子量（MW）。 蛋白質(zhì)MW與相對(duì)遷移率呈反比。相對(duì)遷移率=樣品遷移距離（cm）/溴酚藍(lán)遷移距離（cm）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：一般用5種已知分子量的蛋白。估計(jì)待測樣品蛋白分子量在這5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白范圍之內(nèi)，使結(jié)果會(huì)更準(zhǔn)確。第八十一頁，共一百二十八頁。第81頁，共128頁。MW 測定蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線簡圖 第八十二頁，共一百二十八頁。第82頁，共128頁。 2.肽圖分析 SDS所得到的電泳條帶可以進(jìn)一步分析其氨基酸構(gòu)成?；驹恚簩DS的蛋白帶切下，用125I標(biāo)記。用胰蛋白酶消化125I然后

52、進(jìn)行電泳和層析，經(jīng)放射自顯影后，可得到特征性的圖譜，稱為肽圖(peptide mapping)。 肽圖的差異反映底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基順序的不同，當(dāng)然這種差異最終是由基因結(jié)構(gòu)的不同所決定的。 肽圖分析可用于分析蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原變異、基因結(jié)構(gòu)比較、病毒分型等。 第八十三頁，共一百二十八頁。第83頁，共128頁。 （十）細(xì)胞轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染技術(shù) Cell transformation and transfection techniques 我們習(xí)慣將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)稱為轉(zhuǎn)染（transfection)。 1.轉(zhuǎn)化 當(dāng)獲得

53、新的質(zhì)粒DNA或重組體時(shí)需要轉(zhuǎn)化到宿主菌體內(nèi)，進(jìn)一步擴(kuò)增，以便獲取大量DNA進(jìn)行進(jìn)一步研究。 轉(zhuǎn)化的方法有多種，常用CaCl2法。CaCl2處理細(xì)菌后，細(xì)胞壁細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使質(zhì)粒DNA從細(xì)胞外導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化反應(yīng)物（內(nèi)含已轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌）涂到選擇性培養(yǎng)皿上，轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌能在抗性培養(yǎng)基上生長形成菌落。第八十四頁，共一百二十八頁。第84頁，共128頁。 2.轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，主要用于基因結(jié)構(gòu)與構(gòu)成的研究，基因表達(dá)與調(diào)控的研究，基因治療與轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的研究等等。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法有多種，如脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電擊法、DEAE葡聚糖介導(dǎo)法、磷酸鈣介導(dǎo)法等。其中

54、脂質(zhì)體法較常用，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率是磷酸鈣法的幾十倍，甚至上百倍，并具有廣譜、操作使用簡便的優(yōu)勢。 脂質(zhì)體試劑Lipofectin或Lopofectamine能與靶DNA的磷酸骨架結(jié)合而生成的復(fù)合物能輕易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，完成轉(zhuǎn)染過程。第八十五頁，共一百二十八頁。第85頁，共128頁。 （十一）基因定點(diǎn)突變分析(Site-directed mutagenesis) 1.模板(template)：含有待突變的DNA重組載體，通常為單鏈； 2.引物(primer)：含突變位點(diǎn)； 3.突變反應(yīng)(mutagenesis)：新合成的一股，含突變位點(diǎn)； 4.克隆突變株(cloning of mu

55、tant)：轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選突變株； 5.純化DNA(purification of DNA)：微量法； 6.轉(zhuǎn)染與表達(dá)(transfection and expression)：選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)； 7.功能測定(functional assay)：依研究目的而定。第八十六頁，共一百二十八頁。第86頁，共128頁。 （十二）生物芯片技術(shù)(Biochip techniques) 如前所述，基因芯片技術(shù)是生物芯片技術(shù)中最成熟的一種。實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要包括一下步驟： 1.芯片制備 以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將基因探針排列在載體上。 2.樣品制備 檢測樣品往往復(fù)雜、量少，需要提取擴(kuò)

56、增，然后熒光標(biāo)記以提高靈敏度和使用者的安全性。 3.雜交反應(yīng) 選擇合適的反應(yīng)條件使熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針反應(yīng)，產(chǎn)生一系列信號(hào)。 4.信號(hào)檢測與結(jié)果分析 芯片上的各反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、強(qiáng)弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可獲得有關(guān)生物信息。 第八十七頁，共一百二十八頁。第87頁，共128頁。 存在問題： 1.特異性尚需提高； 2.操作簡便化需要提高； 3.增加信號(hào)檢測靈敏度； 4.提高集成化程度。 前景： 盡管存在問題，但與其它檢測方法相比，優(yōu)勢明顯，在很多領(lǐng)域有獨(dú)特優(yōu)勢，隨著研究的深入和不斷完善，基因芯片技術(shù)將為我們提供一條認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)的捷徑。 基因結(jié)構(gòu)決定物種，基因功能決定

57、生命的話，那么基因芯片就是幫助我們認(rèn)識(shí)生命。 第八十八頁，共一百二十八頁。第88頁，共128頁。 除了上述常用分子生物學(xué)方法外，分子流行病學(xué)中還常用到血清學(xué)方法和免疫學(xué)方法。如各種沉淀反應(yīng)、各種凝集反應(yīng)、ELISA、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫細(xì)胞的分離純化、細(xì)胞表面標(biāo)記檢測方法、免疫細(xì)胞增殖試驗(yàn)、免疫細(xì)胞殺傷試驗(yàn)、各種細(xì)胞因子的活性檢測等等。關(guān)于這些方法的原理、操作等可參考有關(guān)書籍。第八十九頁，共一百二十八頁。第89頁，共128頁。Section four Utilization of molecular epidemiology第九十頁，共一百二十八頁。第90頁，共128頁。 一、病因

58、探討(Probe for cause of a disease) （一）對(duì)生物病因的研究(Study on biological cause of a disease) 由于抗生素、疫苗、藥物的開發(fā)和應(yīng)用，許多由生物因素引起的傳染性疾病得到控制，個(gè)別疾病如天花已在全球范圍內(nèi)被消滅。但原危害嚴(yán)重的疾病如結(jié)核仍然存在，并繼續(xù)危害人類健康。另外，一些新的傳染性疾病也不斷出現(xiàn)，如愈演愈烈的艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)等。 分子流行病學(xué)對(duì)諸如AIDS的病原體人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)

59、等病原體的分子結(jié)構(gòu)，特別是基因結(jié)構(gòu)與功能、分型和鑒定、檢測等方面做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)。第九十一頁，共一百二十八頁。第91頁，共128頁。 （二）對(duì)非生物性病因的研究(Study on non-biological cause of a disease) 非生物性致病因素在日常生活中也常常遇到。暴露于危險(xiǎn)因子是疾病的開始，也是一級(jí)預(yù)防的理論基礎(chǔ)。 非生物性致病因素主要包括各種物理和化學(xué)因素，如各種射線、溫度、濕度、高空作業(yè)、化學(xué)物質(zhì)或藥物等，暴露于這些因素后對(duì)宿主基因有何影響？產(chǎn)生何種效應(yīng)？ 例如，亞硝酸鹽類化合物與胃癌有關(guān)，但到底亞硝酸鹽類如何作用于胃部細(xì)胞基因，如何誘發(fā)癌變，哪些人群更易感等

60、問題，都需要用分子流行病學(xué)手段從基因水平入手，解決上述問題。第九十二頁，共一百二十八頁。第92頁，共128頁。 二、危險(xiǎn)因素評(píng)價(jià)(Evaluation of risk factors) 與人類疾病或健康有關(guān)的危險(xiǎn)因素有許多。例如，腫瘤病毒(oncovirus)能誘發(fā)腫瘤，風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒等病毒能由母體傳給胎兒，造成胎兒宮內(nèi)感染，嚴(yán)重的可導(dǎo)致胎兒畸形，或死產(chǎn)、流產(chǎn)。 這些因素在人群中危害程度有多大，誘發(fā)腫瘤或畸形的發(fā)生概率如何等，都需要用分子流行病學(xué)方法加以解決。第九十三頁，共一百二十八頁。第93頁，共128頁。 對(duì)于生物性危險(xiǎn)因素，首先我們應(yīng)了解它的生物標(biāo)志(biomarker)分布情況，