1、 通信作者 王永紅，電話(huà)：（023）69011029，E-mail:wyh0231029圍生期營(yíng)養(yǎng)不良對(duì)仔鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響和機(jī)制的初步探究康卓君，王永紅，羅 強(qiáng)，王小林，董為偉(400016重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室) 摘要 目的 研究圍生期營(yíng)養(yǎng)不良對(duì)仔鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，探討其可能的機(jī)制。方法 懷孕14d的SD大鼠分為實(shí)驗(yàn)組（半量飲食組）與對(duì)照組（正常飲食組），至哺乳期結(jié)束（仔鼠出生21d）后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的仔鼠均正常飲食。測(cè)量仔鼠出生時(shí)和成年時(shí)的體質(zhì)量。采用Morris水迷宮測(cè)試仔鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能。免疫組化檢測(cè)DNA氧化損傷（8-OhdG）和Wes

2、tern blot檢測(cè)DNA氧化損傷修復(fù)（OGG1）指標(biāo)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組仔鼠出生和成年后體質(zhì)量分別為（4.660.28）、（187.6622.67）g均小于對(duì)照組分別為（6.590.16）、（279.5018.73），P0.01；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，空間探索實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組潛伏時(shí)間長(zhǎng)分別為（37.214.93）、（16.415.21），P0.05；穿越平臺(tái)次數(shù)較少分別為（6.571.22）、（13.122.34）s，P0.05；跨越目標(biāo)象限時(shí)間占整個(gè)游泳的時(shí)間百分率低分別為（32.754.58）、（60.316.74）%，P0.01，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組學(xué)習(xí)記憶功能均比對(duì)照組

3、下降；8-OHdG的表達(dá)在幼年期（22d）和成年期（90d）實(shí)驗(yàn)組均比較高分別為（18.010.05）、（21.150.10），與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分別為（5.770.03）、（10.810.08），P0.05；OGG1的表達(dá)在幼年期（22d）和成年期（90d）實(shí)驗(yàn)組均比較低分別為（0.320.082）、（1.570.102），與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分別為（0.810.057）、（2.780.53），P0.05。結(jié)論 圍生期營(yíng)養(yǎng)不良對(duì)仔鼠成年期的學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生影響，其機(jī)制可能與DNA氧化損傷、修復(fù)調(diào)節(jié)的障礙有關(guān)。 關(guān)鍵詞 圍生期營(yíng)養(yǎng)不良；學(xué)習(xí)記憶；DNA氧化損傷、修復(fù)The ini

4、tial mechanism of perinatal malnutrition in learning and memory function of offspringKang Zhuojun Wang Yonghong Luo Qiang Wang Xiaolin Dong Weiwei (Department of Neurology，Chongqing Municipality neurology Key Laboratory，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Chongqing Medical University ，Chongqing，400016，China).

5、Abstract Objective To study the perinatal malnutrition affect learning and memory function of offspring, to explore the possible formation mechanism.Method Pregnancy 14d SD rats were divided into experimental group (half the amount of diet group) and the control group (normal diet group). To the end

6、 of lactation(born 21d),pups of experimental and control groups had a normal diet. Monitor the weight of offspring(borth and 90 day after birth), using Morris water maze behavioral test to monitor learning and memory function. Using immunohistochemistry and Western blot detect oxidative DNA damage,

7、repair index(8-OHdG and OGG1).Result Compared to the control group(6.59 0.16), (279.50 18.73)weights of the experimental group (4.66 0.28), (187.66 22.67), P0.01 was significantly lighter;Morris water maze test :space exploration experiments ,experimental group (37.21 4.93) had long latency than the

8、 control group (16.41 5.21) ;across the platform less frequently (6.57 1.22), (13.12 2.34) s, and (P 0.05) ;across the target quadranttime to the total swimming time percentage alse less(32.75 4.58) (60.31 6.74)%, P 0.01, Morris water maze test showed that comparing with control group,experimental g

9、roup learning and memory function decline;8-OHdG expression is comparatively higher in the experimental group in its infancy (22d) and adult (90d) (18.01 0.05) (21.15 0.10)compared with the control group was statistically significant (5.77 0.03) (10.81 0.08), P 0.05; OGG1 expression in infancy (22d)

10、 and adult (90d) the experimental group were lower (0.32 0.082) (1.57 0.102)statistically significant compared with the control group (0.81 0.057) (2.78 0.53), P 0.05.Conclusion Perinatal malnutrition affects on the learning and memory function of offspring, may be through the mechanism DNA oxidativ

11、e damage and repair regulation. Key words Perinatal malnutrition；Learning and memory；DNA oxidative damage/repair Corresponding auther: Wang Yonghong, E-mail:wyh0231029圍生期營(yíng)養(yǎng)不良在發(fā)展中國(guó)家特別是經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)還十分普遍。圍生期是胎兒生長(zhǎng)、發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，負(fù)面的宮內(nèi)環(huán)境對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育將產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響1，學(xué)習(xí)記憶功能減退、成人疾病的發(fā)生。圍生期營(yíng)養(yǎng)不良導(dǎo)致成年子代學(xué)習(xí)記憶功能下降的機(jī)理尚不明確，有研究提出圍生期營(yíng)養(yǎng)不良可以編程氧化應(yīng)

12、激的學(xué)說(shuō)2，還有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子學(xué)說(shuō)3、膽堿能神經(jīng)學(xué)說(shuō)4等。本實(shí)驗(yàn)以DNA氧化損傷、修復(fù)平衡失調(diào)為切入點(diǎn)，通過(guò)研究仔鼠幼年和成年期DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-Hydroxy-2-deoxyguanosine ，8-OHdG）、DNA氧化損傷修復(fù)酶8-羥基鳥(niǎo)嘌呤DNA糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG1）表達(dá)量變化和其關(guān)系，來(lái)探究圍生期營(yíng)養(yǎng)不良與學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系和可能的作用機(jī)制。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動(dòng)物分組和模型建立 重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)健康懷孕的雌性SD大鼠12只，體質(zhì)量200220g，與6只健康成年雄性SD大鼠

13、按雌雄比例為2:1合籠喂養(yǎng)在恒溫(202)和12h:12h明暗交替的動(dòng)物房進(jìn)行交配，以發(fā)現(xiàn)陰栓時(shí)記為懷孕0d，正常飼養(yǎng)14d后，將受孕雌鼠編號(hào)，使用隨機(jī)數(shù)據(jù)表隨機(jī)分為2組，每組6只母鼠，每只1籠。(1)懷孕期間：實(shí)驗(yàn)組的母鼠于懷孕第14天開(kāi)始半量飲食，12g/d。對(duì)照組不限量飲食（223g/d）。(2)哺乳期間：實(shí)驗(yàn)組從產(chǎn)仔第0天開(kāi)始，第07天飲食量1221g/d；第814天飲食量2436g/d；第1521天飲食量3842g/d。對(duì)照組不限量飲食(通過(guò)計(jì)量基本是實(shí)驗(yàn)組2倍)。通過(guò)懷孕和哺乳期實(shí)驗(yàn)組的限量飲食造成早期營(yíng)養(yǎng)不良模型5。仔鼠21d斷乳后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均正常飲食，飼養(yǎng)至成年90d。動(dòng)物

14、飼料由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分別含16蛋白質(zhì)、3脂肪、60碳水化合物，維生素適量。每只孕鼠哺乳相同數(shù)量的仔鼠(8只)以保證每只仔鼠哺乳均衡。1.1.2 主要試劑 兔抗8-OhdG（北京博奧森公司），OGG1/2(H-300)(美國(guó)Santa Cruz公司)，EnVision兩步法試劑盒、全蛋白提取試劑盒、Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG(H+L)(北京中杉公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（江蘇碧云天公司）等。 1.2 方法1.2.1 仔鼠的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物模型建立后到成年（3月齡），應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力6,7。 = 1

15、 * GB3 定位航行實(shí)驗(yàn)：用60s內(nèi)找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）表示，反應(yīng)大鼠的學(xué)習(xí)能力。 = 2 * GB3 空間探索實(shí)驗(yàn)：記錄大鼠在2min內(nèi)游泳軌跡，分別計(jì)算其跨越目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間占游泳時(shí)間的百分率、跨越平臺(tái)次數(shù)，反應(yīng)大鼠的空間記憶能力。1.2.2 8-OHdG的免疫組化染色 取幼年期（22d）、成年期（90d）仔鼠，3.5水合氯醛(按0.01mlkg，腹腔麻醉)將動(dòng)物麻醉，先用生理鹽水沖洗快灌，再用4多聚甲醛溶液灌注，取腦，固定，石蠟包埋，制作石蠟切片。免疫組織化學(xué)采用EnVision兩步法。石蠟組織切片二甲苯2次逐級(jí)脫蠟，梯度乙醇至水，3H202溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化

16、物酶，放入檸檬酸鈉(pH 6.0)微波修復(fù)，然后山羊封閉血清封閉。加一抗兔抗-8-OHdG（北京博奧森公司），4濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜，第2天37復(fù)溫。PBS緩沖液沖洗，滴加二抗，濕盒內(nèi)37孵育。PBS沖洗，DAB顯色，顯微鏡下觀察，自來(lái)水沖洗終止顯色。蘇木精對(duì)比染色，1鹽酸乙醇風(fēng)化，氨水返藍(lán)。脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。每只仔鼠選取3張切片，使用IPP6.0軟件分析平均灰度值（IOD值）。1.2.3 OGG1的Western blot檢測(cè) 取幼年期（22d）、成年期90d）仔鼠大腦海馬的100 mg組織，液氮低溫研磨，加裂解液5080l，冰上作用30 min，離心(4，12

17、 000 r/min，5min)，吸取上清，Bradford法測(cè)蛋白濃度。配10的分離膠和5的積層膠，蛋白上樣50g，SDS垂直電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜90 min，5脫脂牛奶封閉60 min；加一抗OGG1/2(H-300)(美國(guó)Santa Cruz公司)和兔抗鼠-actin單克隆抗體(1：2000)，4過(guò)夜，第2天室溫孵育60min，洗膜；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1：5000)室溫孵育60min，洗膜；加ECL顯影液，曝光，顯影。由于目標(biāo)蛋白與內(nèi)參相對(duì)分子質(zhì)量接近，操作中先將一個(gè)抗體顯完影，再使用碧云天抗原抗體洗脫液洗脫后，重新封閉，敷抗，顯影，曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。使用Quantity

18、One軟件測(cè)定各條帶的平均光密度值，分別將OGG1與對(duì)應(yīng)-actin蛋白顯色條帶的光密度值的比值標(biāo)示OGG1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間的比較采用單因素方差分析的方法，水迷宮數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。2 結(jié)果2.1 仔鼠體質(zhì)量情況體質(zhì)量是衡量個(gè)體營(yíng)養(yǎng)發(fā)育是否充分的一項(xiàng)簡(jiǎn)單有效的指標(biāo)，以出生時(shí)（0d）和成年后（90d）體質(zhì)量來(lái)判斷仔鼠是否有早期營(yíng)養(yǎng)不良。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組仔鼠出生和成年后體質(zhì)量均低于對(duì)照組。見(jiàn)表1。表1 仔鼠出生和成年后體質(zhì)量比較（g,s）n出生時(shí)體質(zhì)量成年后體質(zhì)量對(duì)照組126.590.16279.5018.73實(shí)驗(yàn)組124.660

19、.28a187.6622.67aa:P0.05，與對(duì)照組比較2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1 Morris水迷宮學(xué)習(xí)成績(jī)（定位航行實(shí)驗(yàn)） 與對(duì)照組相比，在各時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)（P0.01），隨著訓(xùn)練的進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的逃避潛伏期逐漸縮短（P0.05），對(duì)照組第4天逃避潛伏期較前1d沒(méi)有明顯改變（P0.05）。見(jiàn)表2。表2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平均潛伏期的比較（s,n=12，s）組別第1天第2天第3天第4天第5天對(duì)照組48.605.3030.985.43a24.774.65a21.517.3816.415.21a實(shí)驗(yàn)組58.864.25b55.335.62b51.943

20、.46b44.365.72ab37.214.93aba：P0.05，與前1d比較；b：P0.01，與對(duì)照組比較2.2.2 Morris水迷宮記憶成績(jī)（空間探索實(shí)驗(yàn)） 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組穿越平臺(tái)次數(shù)減少（P0.05），實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組跨越目標(biāo)象限時(shí)間占整個(gè)游泳的時(shí)間百分率顯著減少（P0.01）。見(jiàn)表3。表3 穿越平臺(tái)次數(shù)和跨越目標(biāo)象限時(shí)間百分率的比較（s,n=12）組別穿越平臺(tái)次數(shù)跨越目標(biāo)象限時(shí)間占整個(gè)游泳的時(shí)間百分率（%）對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組13.122.346.571.22a60.316.74 32.754.58ba：P0.05，b：P0.01，與對(duì)照組比較2.3 8-OHdG的免疫組化結(jié)果觀察組織

21、切片，200倍鏡下幼年期（22d）和成年期（90d）實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組8-OHdG的表達(dá)均具有差異，見(jiàn)圖1。400倍鏡下，幼年期仔鼠海馬CA3區(qū)，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的細(xì)胞層數(shù)和數(shù)目都明顯減少。比較海馬CA3區(qū)的IOD值，實(shí)驗(yàn)組8-OHdG的表達(dá)較對(duì)照組有顯著差異分別為（18.010.05）、（5.770.03），P0.01。成年期組織切片，仔鼠海馬CA3區(qū)實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的細(xì)胞層數(shù)和數(shù)目也明顯減少。實(shí)驗(yàn)組海馬CA3區(qū)8-OHdG表達(dá)的IOD值較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分別為（21.150.10）、（10.810.08），P0.05。見(jiàn)圖1、2。 A：幼年期實(shí)驗(yàn)組；B：成年期實(shí)驗(yàn)組；C：幼年期對(duì)照組；D：成年期

22、對(duì)照組圖1 8-OHdG在海馬區(qū)的表達(dá)（EnVision 200） A：幼年期實(shí)驗(yàn)組；B：成年期實(shí)驗(yàn)組；C：幼年期對(duì)照組；D：成年期對(duì)照組圖2 8-OHdG在海馬CA3區(qū)的表達(dá)（EnVision 400）2.4 OGG1的Western blot檢測(cè)結(jié)果DNA氧化損傷修復(fù)酶OGG1在幼年期（22d）和成年期（90d）表達(dá)實(shí)驗(yàn)組均比較低分別為（0.320.082）、（1.570.102），與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分別為（0.810.057）、（2.780.53）,P0.05。見(jiàn)圖3。 401031 2 222 2 OGG1 1 2 222 2 -actin 4310390d22d1：實(shí)驗(yàn)組；2

23、：對(duì)照組圖3 Western blot 檢測(cè)各時(shí)期OGG1蛋白的表達(dá)3 討論圍生期胎兒生長(zhǎng)、發(fā)育迅速，器官發(fā)育不成熟，胃腸道功能不全，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體內(nèi)儲(chǔ)備少，因而對(duì)母體營(yíng)養(yǎng)供給的需求量大。圍生期營(yíng)養(yǎng)直接影響到胎兒腦細(xì)胞的增殖，可以造成大腦、小腦萎縮，海馬體積變小8，嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)，新生兒腦細(xì)胞可減少20%9。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組在懷孕和哺乳期均限量飲食，造成早期營(yíng)養(yǎng)不良的模型，出生時(shí)和成年期體質(zhì)量均比對(duì)照組輕，海馬CA3區(qū)形態(tài)學(xué)觀察，幼年期和成年期腦組織的細(xì)胞層數(shù)都減少，神經(jīng)元數(shù)目也減少。圍生期的營(yíng)養(yǎng)狀況，不僅影響胎兒的生長(zhǎng)，而且決定了胎兒的氧化應(yīng)激水平。首先，蛋白質(zhì)的缺乏會(huì)使谷胱甘肽（GSH）或含硫氨

24、基酸減少，抗氧化酶合成減少或活性下降9。其次，微量營(yíng)養(yǎng)素如硒、銅、鋅、錳，維生素C是抗氧化劑必不可少的輔助因子，微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏時(shí)，抗氧化劑活性會(huì)降低10。而腦組織含有豐富的多不飽和脂肪酸，消耗全身20%的氧，抗氧化劑活性又比較低，這就使大腦更易于受氧化應(yīng)激的侵襲11 ，因此腦組織中的DNA大分子在氧化應(yīng)激水平較高的情況下易于發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。8-OHdG目前已成為DNA氧化損傷中最常采用的生物標(biāo)志物，而OGG1是一個(gè)帶有AP裂解酶活性的雙功能DNA糖苷酶，主要識(shí)別和切除DNA雙鏈中的8-OHdG，其功能具有特異性12。DNA氧化損傷修復(fù)酶的減少，DNA氧化損傷產(chǎn)物的堆積，使機(jī)體長(zhǎng)期處于高氧化應(yīng)

25、激狀態(tài)，這種內(nèi)環(huán)境的改變和DNA的破壞導(dǎo)致仔鼠腦組織中神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)纖維消失、突觸減少，特別是膽堿能神經(jīng)突觸的減少，將形成學(xué)習(xí)記憶能力和認(rèn)知功能的降低13-15。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組成年期仔鼠的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶功能明顯下降；幼年期和成年期的8-OHdG比對(duì)照組升高，OGG1比對(duì)照組降低, 這可能是圍生期營(yíng)養(yǎng)不良引起仔鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的機(jī)制之一。圍生期營(yíng)養(yǎng)對(duì)子代生存和健康具有非常重要的意義，為母體提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，不僅滿(mǎn)足胎兒的生長(zhǎng)，而且降低胎兒的氧化應(yīng)激水平、保障子代的學(xué)習(xí)和記憶能力。為了提高人口素質(zhì)，減少成人疾病發(fā)生，需要從胎兒期、嬰幼兒期就開(kāi)始預(yù)防；要保證母嬰良好的營(yíng)養(yǎng)，

26、需要社會(huì)、政府、婦幼及兒科醫(yī)務(wù)工作者們做出有效而長(zhǎng)期的努力。參考文獻(xiàn)：1Calkins K, Devaskar S U. Fetal origins of adult diseaseJ.Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care,2011,41(6):158-176.2Luo Z C, Fraser W D, Julien P, et al. Tracing the origins of “fetal origins” of adult diseases: programming by oxidative stress?J. Med Hypotheses,20

27、06,66(1):3844.3 HYPERLINK /pubmed?term=%22Wang%20L%22%5BAuthor%5D Wang L, HYPERLINK /pubmed?term=%22Xu%20RJ%22%5BAuthor%5D Xu R J. The effects of perinatal protein malnutrition on spatial learning and memory behaviour and brain-derived neurotrophic factor concentration in the brain tissue in young r

28、atsJ. HYPERLINK /pubmed/17392152 l # o Asia Pacific journal of clinical nutrition. Asia Pac J Clin Nutr, 2007, 16(Suppl 1):467-472.4 Mellott T J, Kowall N W, Lopez-Coviella I, et al. Prenatal choline deficiency increases choline transporter expression in the septum and hippocampus during postnatal d

29、evelopment and in adulthood in ratsJ.Brain Res,2007, 1151:1-11.5Coupe B, Dutriez-Casteloot I, Breton C, et al. HYPERLINK /pubmed/19094092 Perinatal undernutrition modifies cell proliferation and brain-derived neurotrophic factor levels during critical time-windows for hypothalamic and hippocampal de

30、velopment in the male ratJ. J Neuroendocrinol,2009, 21(1):40-48.6張峰, 姚紅兵, 李兵, 等.慢性間歇性缺氧對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬CA3區(qū)GFAP表達(dá)的影響J.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009,31(12)：1161-1163.7 Vorhees C V, Williams M T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memoryJ. Nat Protoc, 2006, 1(2):848-858.8

31、 HYPERLINK /pubmed?term=%22Matos%20RJ%22%5BAuthor%5D Matos R J, HYPERLINK /pubmed?term=%22Orozco-Sol%C3%ADs%20R%22%5BAuthor%5D Orozco-Solis R, HYPERLINK /pubmed?term=%22Lopes%20de%20Souza%20S%22%5BAuthor%5D Lopes-de-Souza S, et al. Nutrient restriction during early life reduces cell proliferation in the hippocampus at adulthood but does not impair the neuronal differentiation process of the new generated cellsJ. Neuroscience, 2011,196:16-24.9Bonatto F, Polydoro M, Andrades M E, et al. Effect of protein malnutrition on redox state of the hippocampus of ratJ. Brain Res, 2005,1