1、蛋白水解液中多肽含量的測定方法&W1,任國譜宋俊梅I(1山東輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，山東濟南，250100：2湖南亞華乳業(yè)博上后工作站，湖南長沙，410116)摘要用10WW)的三氧乙酸沉淀蛋白水解液中的大分子蛋白股.經離心過遞后在上清液中加入雙縮腺試劑.于540nm下測定其OD值，繼而在Gly-Gly-Tyr-Arg匹肚標準曲線上査岀樣品中的多駄含址：關鋌詞：雙縮眠反應：三氯乙霰：多肽含童DetemiinationofContentofPeptidesinProleinHydrolysatesLUWeilfRENGuo-pu2SONGJun-mei1(1.CollegeofFoodan

2、dBioengineering,ShandongInstituteofLightIndustryJinan2501(X).China;HunanYalwaCorp.Ltd.&EastChinaNormalUniversity,Changsha4101!6.China)Abstract：Macromoleculeprotrininproteinhydrolysatewasdepositedbyusing10%trichloroaceucacid.Aftercentrifugalizationandhitration,biuretreagentwasaddedtotheclearsolution.

3、TheODvaluewasmensuratedunder540nm.ThenthecontentofpeptidesofthesamplewasobtainedtluoygJioonuascedon(hestandardcurveofGly-Gly-Tyr-Arg(etrapeptideKeywords：biuretreaction:trichloroaceticacid：contentofpeptides中因分類號：Q51文獻標識母A文章編號：1002-6630(2005X)7-0169-03蛋白庶龍人休必不可少的肯養(yǎng)素Z但不同蛋口質由F梵氨基酸組成和空間結的不同.在人體內的消化吸收率也大不

4、相同兇。將愛白質水解為多肽可以大大提高其消化吸收率.近代研憲表明.彊白質在體內消化后并不完全以氨站酸的形式吸收，而大都是以算肚的形式吸收仏因此.水解蛋白質生產多肪產品正成為當今研究的熱門課題之一。在水解蛋白質的過程中,控制蛋白質的水解程度，盡可能少的產生融廡酸，盡可能多的得到II標產物釣減是水解的根本II的，這就箜求建立-嘟唯快速測定水解液中多肽含吊冊話效方法。對徴門質水解程度的渕定有名種方法.三氯乙酸法是其中常用的一種,它是利用三氮乙酸沉淀水解液中的大分子蛋白質.繼而以微試凱氏定氮法測定上消液中可溶性氮的含爪，然斤城去水解Z酬樣胡溶液可潞性忍的含就再與樣品中的總比.從而確定梵水解程麼。此法中

5、徴毎凱氏定氮法測丘的是水解液中川溶性總氮的含呈.若改用雙縮腺法(叭便可測定其中含二個(包括二個)以上呱鋌的多肽的含fftSe本文利川10%的三眾乙酸沉淀樣品水解液中的人分子蛋白質，經離心過濾后，衽上淸液中加入雙縮I拯試劑，丁54()nm測定其OD伯，繼而AGly-Gly-Tyr-Arg皿肽標戀曲線上查出樣品中的多肚仟弗:從而建龍了收摘日期：2004-0602作者簡介：魯偉(1979)男碩士研究生研究方向為攸生物醃技術.1702005.bL26.No.7食品科學分析檢驗種快速測疋蛋門水餡液屮多狀介吊的右效方法。1材料與方法11林料主要試劑Gly-Gly-Tyr-ArgSigma公司。CuSOf5

6、H：O；NaOH：氨水:三氯乙酸.分析純。胰蛋白艇，杭州三葉生物化工廠2000U/g,(4)ProiainexNovozyiin?,1.5AU/g主耍儀器和設備紫外可見分光光度計.UV.9100型.北京珊利分析儀器公司。低速離心機LD52A型.北京醫(yī)用離心機廠超級恒溫水浴鍋.BO220型.上海實驗儀器廠有眼公訶。電子分析天平.AL204型:PH計,DELTA320型.METTLERTOLEDO公司.方法%肚含最的測定程殍:取25ml樣品溶液加入2.5ml10%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液.于漩渦泡合儀上混合均勻，mlOmin.然后在4000r/min下離心I5min.將上消液全部轉移到

7、50ml容量瓶中.并用5%的TCA定容至刻度.擁勻.然后取6.0ml上述涪液丙另一試管中,加入雙編眠試劑4.0m1(樣液:雙縮IK試劑=3:2.V/V).干淡渦混合儀上混合均勻.靜罷lOmin.2000r/min離心lOmin.取上清液J540nm下測定OD值,對照標準曲線求得樣品溶液中的多肽濃度C(mg/ml),進而可求得樣品中多fit含fib2結果與討論標準曲線的制作取I個10ml的容丘瓶.用5%的TCA依次配制0.0、0.2x0.40.6.0.81.0.1.2.1.4、1.6和1.8mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準溶液,然后分別取6.0ml標準港液，加入4.0ml雙縮麻

8、試劑,于漩渦混合儀上泡合均勻lOmin2000r/min心lOmin.取上消液540nm下測定OD做以第一管做空白對照).以肽的濃度為橫坐標X(mg/ml),ODffi為縱也標Y制作標準曲線(圖I).得到回歸方y(tǒng)=0.368lx+0.0013,R2=U沉淀反應的溫度和時何對測崔結果的影響稱取30.00g全脂奶粉,洛干200ml蒸懾水中.加入jy$i0.6000g(E/S=2%rW/W),于沿度389,pH85(以30%NaOH溶液維持pH)的條件下進行水解水解30min后，立即將水解液于90C滅酶處理lOmin.然后f-GN-Tyr-Afj改境血的址Gh圖1GlyGlyTyrA咚四肚標準曲連F

9、ig.1StatxhrdcurveofGly-Gly-Tw-Arg冷卻至室溫,冷裁保存?zhèn)溆?。準確凰取50.伽1水解液.f250ml容量瓶中定容,2.2.1反應溫度的彫響取六支試管,于每一支試管中均加入40ml上述溶液.再加入4.0ml10%的TCA。將15號試管分別于60.70.80.90和HMTC加熱處理I5mim0號試管不進行加熱處理.來逞下放涿I5min雉而按標準程中測定OD值.平行測定一次，實輪結果見茨I。*1反應溫皮対測定結工的彭響TabicIInfluenceofreactiontemperatureonOD反應浪瞭C)607080901C0S3OD-fi0.4500.4490.4

10、460.4400.445Q442由上表可以看出,雖然經過不同富度處理,但各組所測得的ODfft大體一致.也就是說.反應溫度對測定結果的影響不是很明顯，故不進行加熱處理.而讓其任空溫下反應。反磁時間的形響取六支試骨，分別加入上述溶液4,0ml.10%的TCA溶液4.0ml于振蕩器上混合均勻,分別于室溫下放賈0、30、60.90、120和150min繼而按標準程凈測定OD値.平行測定一次.結果見農2.2反滋時問對測定結奧的彩響Tabk2Influenceofreacuoaumeondeurmineresults反應時(帥迢)030608120150OD0.4430.4420.4420.4420.4

11、410.441由上表可以看出,反應時何對測定結果幾乎沒有影哨這就是說TCA能迅速使蛋口質沉淀下來.反臧速度很快。故在瀝合均勻后即可進行下面的實驗,而無需等待0回收率實驗配制4.0mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肚水落液，按標準祝仔測定其屮餌朧實毅葩復&次結果見農3標來妣的回攻李Tabic3Yieldofstandaidpeptide攔定Siififipgfml)CD收車(冬)Glv-Gly-Tyr-Ai?3.98士0.034.099.5士0.75GlyGyTyrArg4全脂坍輕3.750.054.093.81.3分析檢驗食品科學2005.Vol.26.No.7171與理論似幾乎完全

12、吻令回收率為99.5%0.75%,用10%的全脂奶粉水洛液配制4.0mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肚溶液，按標準程序測定其中多肽含比實觀重復六次.結果見表3.回收率為93.8%13%.全脂奶粉中的礦物質彭響體系的OD詵這在后埃試險中將有所涉及。梢密度測試配制40mpml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽水溶液,按相同程序進行6輪平行測定.以檢臉測定程序的精巒度，結果見農翟4Table4Precisionexperiment&Xc4氐Xu比Sa13.954.00-0.050.00250.0012523.953.950.000.0000034.004.100.100.01000.0

13、0544.053.950.100.01000.00553.954.00-0.050.00250.0012S64003.950.050.0025000125Z47.850.050X)2750.0137S注：In和尬為平行5?為方差。精密度SEES】嚴為0.0479(n為測定輪數),標準備差g(G/x)X100(x為測定平均值為1.2%,平均ffl7y3.99mg/ml應用硏充251全脂妬粉.夫豆蛋白粉和大切拔樣中的初比含量W10%If全脂奶粉，10%的腕脂奶粉.10%的大豆分離蛋白.10%的脫脂大豆蛋門粉和2.()mg/ml的大豆狀樣按標準程斤測定OD值，結果見農5。*5全臘刪大豆龍白松和大豆肪

14、佯中的多咬含丘Table5Peptidescotiteniofwholeniilkpouder.soybeanproteinpowderandsoybeanpeptidesRI&塵脂大亙分職廃大豆W馳高蛍日證日粉odS0.060-0.0600.0800.04S0.446由表5可以看出.奶粉溶液能使體系的OD值偏低1.6和1.8mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Aig四肽標準溶液，然后分別取6.0ml標準溶液，加入4.01111雙縮腺試劑，混合均勻，靜置10miib2000r/min離心lOmiib取上清液于540IU11F測定0D值(以第一管做空白對照)。以肽的濃度為橫坐標X(mg.iul)

15、,0D值為縱坐標Y,制作標準曲線。2多肽含量的測定多肽含量的測定程序：取2.51111樣品溶液，加入2.5111110%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，丁漩渦混合儀上混合均勻，靜置10mm然后在4000i/miu下離心15miib將上清液全部轉移到50ml容量瓶中,并用5%的TCA定容至刻度,搖勻。然后取6.0ml上述溶液置另-試管屮，加入雙縮腺試劑4.0ml(樣液:雙縮腺試劑=3:2,V/V),于漩渦混合儀上混合均勻，靜置lOmiib2000i7min離心lOmim取上清液于540nm下測定OD值，對照標準曲線求得樣品溶液中的多肽濃度C(mg/ml),進而可求得樣品中多肽含量。所需試劑：大豆蛋白、木瓜蛋白幽、三氯乙酸、Glv-Gly-Tyr-Aig四肽標準溶液、氫氧化鈉、硫酸銅雙縮腮配制方法：先將雙縮淼試劑A加入組織樣液，振蕩均勻(必須營造堿性環(huán)境)，再加入雙縮脈試劑B,振蕩均勻。雙縮服試劑A的成分是氮純化鈉的質雖分數為0.1g/niL的水港液；雙縮服試劑B