1、用于增強結(jié)腸癌化療的腸道菌群葡萄糖醛酸酶響應(yīng)甘草酸膠束結(jié)直腸癌(colorectalcancer, CRC)是世界上最常見的惡性 腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康，且呈現(xiàn)年輕化、發(fā)病率和死 亡率屢創(chuàng)新高的特點1.由于大多數(shù)CRC患者確診時即為晚 期，伴隨遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)切除的機(jī)會.因此，化療是CRC 的主要治療手段2.然而，在反復(fù)給藥后，患者會產(chǎn)生耐藥 性從而導(dǎo)致化療失敗.其中，腫瘤細(xì)胞表面P-糖蛋白(P-gp) 的過度表達(dá)是導(dǎo)致化療抵抗的主要原因之一 3.P-糖蛋白 可以識別和結(jié)合大多數(shù)疏水性化療藥物，將藥物“泵”到腫 瘤細(xì)胞外，降低胞漿內(nèi)有效藥物濃度，從而削弱化療療效4. 癌癥患者一旦出現(xiàn)耐藥

2、性問題，即使改用替代性化療藥物或 者增大藥物用量，都很難改善治療效果，而且會產(chǎn)生更加嚴(yán) 重的毒副作用5.因此，迫切需要解決腫瘤化療耐藥的問 題.抑制腫瘤細(xì)胞P-gp表達(dá)是增強腫瘤化療的有效策略.一些 P-gp抑制劑，如基因干擾siRNA能直接沉默P-gp基因表達(dá)， 具有良好治療潛力6.然而，siRNA是帶負(fù)電的生物大分子， 容易在血液循環(huán)中被降解，細(xì)胞攝取差且轉(zhuǎn)染效率低7.采 用納米顆粒8,如脂質(zhì)體9和聚合物納米粒子10包裹化 療藥物和siRNA,可以實現(xiàn)二者的高效遞送，減少P-gp表達(dá)， 增強治療效果Ul.但是，這些納米載體通常十分復(fù)雜，難 草酸的CMC值為0.57mg/niL,說明甘草酸在

3、濃度高于 0. 57mg/mL時能自組裝形成膠束，可以將疏水藥物阿霉素包 載在其疏水空腔內(nèi)，具有高效載藥能力.Fig.2ThesynthesisandcharacterizationofDOXGLCSmicel les. (a)Thecriticalmicelleconcentration(CMC)ofglycyr rhizin(GL). TEMimagesof(b)GLCSmicellesand(c)DOXGLCS micelles, (d)ThesizedistributionofGLCSandDOXGLCSmic elles. (e)Thesizestabilityand(f)zetap

4、otentialstabili tyofDOXGLCSmicelles.2. 2膠束形貌和粒徑特征圖2(b)和2(c)分別是空白膠束GLCS和載藥膠束D0XGLCS 的透射電鏡照片.照片清晰地顯示膠束為規(guī)則的球形，分散 良好.動態(tài)光散射結(jié)果表明，膠束載藥前后的粒徑分別為252 和165nm,且有較窄的粒徑分布(PDI分別為0. 223和0. 164). 包載阿霉素后膠束粒徑變小，這歸功于正電性的阿霉素對整 個膠束靜電體系的平衡，從而使得膠束更穩(wěn)定，粒徑更小(圖 2(d).穩(wěn)定性是納米載藥體系臨床轉(zhuǎn)化的重要評價指標(biāo).將 D0XGLCS膠束在PBS中保存1周，并于第1、2、3、5和7 天分別測定膠

5、束的粒徑和電勢.結(jié)果如圖2(e)和2(f)所示, 膠束在1周內(nèi)具有良好的時間穩(wěn)定性，這有利于膠束的體內(nèi) 長循環(huán)，增強療效.2. 3膠束載藥和釋藥性能研究膠束的載藥量通過測定計算為17. 1%,說明該體系能有效包 載疏水藥物.DOXGLCS膠束響應(yīng)腸道菌群觸發(fā)釋藥行為如圖 3(瑚和3化)所示.經(jīng)，和$6培養(yǎng)后，藥物釋放緩慢，24h 內(nèi)的釋藥量不足10%.動態(tài)光散射結(jié)果顯示膠束的粒徑在整 個過程中也基本保持不變.其優(yōu)異的穩(wěn)定性是由于帶正電荷 的殼聚糖和阿霉素與帶負(fù)電荷的甘草酸間的強靜電相互作 用相比之下，經(jīng)SCF共培養(yǎng)后，D0X釋放明顯，在8h內(nèi)達(dá) 到70%, 24h內(nèi)達(dá)到90%.同樣，膠束粒徑也

6、隨之變大，意味 著膠束結(jié)構(gòu)被破壞.以上結(jié)果表明，口服D0XGLCS膠束可以 實現(xiàn)藥物在富含細(xì)菌的腸道和腫瘤組織中特異性釋放，避免 了在胃部的提前泄露.Fig.3Thegutmicrobiota-responsivedrugreleasebehaviou rofDOXGLCSmicelles. (a)ThereleaseprofilesofDOXfromD 0XGLCSmicellesinSGF,SIF,andSCFconditions. (b)Thepar ticlesizesofDOXGLCSmicellesunderdifferentcondition s. (c)TheHPl.Canal

7、ysisofGLafterincubationwithgutmicro biota.TheyellowcurvesrepresentthcGLanddecomposedGLu nderSCFconditions,respectively. Thebluecurverepresen tstheproducedGA.隨后，通過高效液相色譜(HPLC)分析腸道菌群對甘草酸的代 謝轉(zhuǎn)化行為.如圖3(c)所示，膠束經(jīng)SCF共培養(yǎng)后，甘草酸 的峰強度顯著降低(31min).同時，在27min時出現(xiàn)了甘草次 酸的特征峰，表明腸道菌群轉(zhuǎn)化了膠束中的甘草酸，生成了 P-gp抑制劑甘草次酸.2.4載藥膠束的腫瘤細(xì)

8、胞抑制效果評估膠束經(jīng)腸道菌群代謝產(chǎn)生的甘草次酸是一種有效的P-gp抑 制劑，能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)藥物積累，增敏結(jié)腸癌化療.因此，我 們評估了載藥膠束在細(xì)胞水平上克服化療耐藥性的能力.為 了確保DOXGLCS膠束的安全性，首先對膠束進(jìn)行生物相容 性研究.如圖4(a)所示，空白膠束對正常腸上皮細(xì)胞NCM460 沒有明顯毒性隨后，通過MTT法探究了膠束對結(jié)腸癌細(xì)胞 的化療增敏作用.將游離DOX和DOXGLCS膠束分別與模擬結(jié) 腸液SCF共培養(yǎng)后，測定其對CT26細(xì)胞或HCT116細(xì)胞的殺 傷效果.如圖4(b)和4(c)所示，相比游離DOX, DOXGLCS膠 束具有更強的細(xì)胞毒性.將甘草次酸和阿霉素共混后，

9、阿霉 素毒性增強，說明DOXGLCS膠束能增強化療效果是產(chǎn)生的 甘草次酸的結(jié)果(圖4(d).Fig. 4Theenhancedcheniotherapyeffectofmicellesinvitro .(a)Thecel1viabi1ityofNCM460cel1streatedbyDOXfreeGL CSmicelles. ThecellviabilityofCT26celIs (b)andHCT116c ells(c)treatedbyfreeDOXandDOXGLCSmi ce11eswi thd i ffe rentDOXconcentrations. (d)Thecellviabil

10、ityofCT26cell streatedbyfreeDOXandDOX+GAwithdifferentDOXconcentra tions. (e)TheCLSMimagesofCT26cellstreatedbyfreeD0Xan dI)OXGLCSmice 11 es (I)0Xconcentrationswere2mg/Land4mg/ L,respectively). ThescalebarislOO u m. (f)Themeanfluor escenceintensity (MFI)ofD0XinCT26cellsmeasuredbyflow cytometer, (g)The

11、P-gpexpressionofCT26cellstreatedbyf reeDOXandDOXGLCSmicelles.共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)結(jié)果顯示相比游離DOX, DOXGLCS膠束處理后的CT26細(xì)胞具有更強的熒光強度，意 味著更多的DOX積累(圖4(e).流式定量結(jié)果進(jìn)一步表明， 該膠束顯著提高了腫瘤細(xì)胞對阿霉素的攝取能力(圖4(f). 為了證明DOXGLCS膠束通過抑制腫瘤細(xì)胞P-gp的表達(dá)來提 高藥物攝入，通過定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析 腫瘤細(xì)胞在mRNA水平上P-gp的表達(dá)情況.與DOX處理相比， DOXGLCS膠束顯著地抑制了 CT26細(xì)胞的P-

12、gp表達(dá)(圖4(g). 以上結(jié)果表明，DOXGLCS膠束在腸道菌群作用下，生成甘草 次酸抑制了腫瘤細(xì)胞P-gp表達(dá),提高了胞內(nèi)有效藥物濃度， 從而增強了阿霉素化療效果.接著，我們進(jìn)一步在耐阿霉素CT26細(xì)胞株(CT26D0X)中評估 了載藥膠束的化療增敏效果.如圖5(a)、5(c)所示，DOX對 CT26D0X細(xì)胞的半致死量濃度(IC50)值是正常CT26細(xì)胞的3 倍.CT26D0X的P-gp表達(dá)也增加了 3倍，表明成功誘導(dǎo)了阿 霉素耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞(圖5(d).和游離DOX相比,DOXGLCS 膠束表現(xiàn)出對CT26D0X細(xì)胞更強的殺傷效果(圖5(e).與CT26細(xì)胞的實驗結(jié)果一致，經(jīng)I)OXG

13、LCS膠束處理后,CT26D0X 細(xì)胞P-gp表達(dá)也明顯降低(圖5(f).Fig.5TheenhancedchemotherapyeffectofmicellesforD0X- resistantCT26cellsascomparedwithfreeD0X. Thecellviab ilityofCT26cells (a)andCT26D0Xcells(b)treatedbyfreeD OXwithdifferentconcentrations, (c)TheIC50valueofCT26 cellsandDOX-resistantCT26D0Xcells. (d)TheP-gpexpress

14、 ionofCT26cellsandD0X-resistantCT26D0Xcells. (e)Thece HviabilityofCT26D0XcellstreatedbyfreeD0XandD0XGLC Smicelles. (f)TheP-gpexpressionofDOX-resistantCT26DO XcellstreatedbyfreeDOXandDOXGLCSmicelles.2. 5載藥膠束體內(nèi)抗腫瘤效果評估根據(jù)體外實驗結(jié)果，我們對膠束體內(nèi)抗腫瘤效果進(jìn)行了評估. 通過小動物活體成像系統(tǒng)定量腫瘤組織的發(fā)光強度，以反映 腫瘤大小.如圖6(a)和6(b)所示，DOXGLCS膠束處理

15、的小鼠 生物發(fā)光最弱，表明腫瘤體積最小.單獨使用GLCS或DOX治 療組的小鼠生物發(fā)光很強，意味著其不能有效抑制腫瘤生長. 治療結(jié)束后，收集各組腫瘤，同樣表明DOXGLCS膠束抗腫 瘤效果最好(圖6(c).Fig. 6TheantitumorefficacyofmicellesinorthotopicCT26 -bearingmicemodelsascomparedwithfreeDOX. (a)Invivowh ole-bodybioluminescenceimagesoftumor-bearingmicetre atedbyPBS,DOX,GLCS,andI)OXGLCSmicelles.

16、 Threereprese ntativemicepertreatmentgroupareshown. (b)Meanbiolumi nescenceintensityofmiceafterdifferenttreatments, (c) Representativeimagesofexcisedtumorsattheendofexperi ments.為了更好地證明D0XGLCS膠束的化療增敏能力，我們進(jìn)一 步建立了原位耐阿霉素結(jié)腸癌小鼠模型.如圖7(a)所示，對 照組小鼠由于腫瘤負(fù)荷過大，出現(xiàn)死亡現(xiàn)象.DOXGLCS膠束 處理的小鼠生物發(fā)光最弱，表明腫瘤體積最小.游離DOX不 能有效抑制腫

17、瘤生長.在治療15天后，小鼠CT成像同樣表 明DOXGLCS膠束處理的小鼠腫瘤最小(圖7(b).治療結(jié)束后 處死小鼠，收集各組腫瘤組織，HE切片和Ki67免疫熒光染 色顯示經(jīng)DOXGLCS膠束治療后，腫瘤組織呈現(xiàn)出最明顯的 細(xì)胞凋亡(圖7(c).隨后，檢測了各組腫瘤的P-gp表達(dá)情況. 反復(fù)注射DOX后，腫瘤組織P-gp表達(dá)明顯升高，這與化療 誘導(dǎo)耐藥的臨床問題一致.相反地，DOXGLCS治療顯著下調(diào) 了 P-gp表達(dá)，增強了藥物療效(圖7(d).最后，對小鼠腸道 通透性進(jìn)行了評估.如圖7(e)所示，經(jīng)殼聚糖修飾的載藥膠 束DOXGLCS治療后，小鼠腸道通透性得到了明顯改善，說 明該藥物遞送系

18、統(tǒng)具有良好的腸道黏膜修復(fù)功能.Fig. 7TheantitumorefficacyofmicellesinorthotopicCT26 DOX-bearingmicemodelsascomparedwithfreeDOX. (a)Inviv owhole-bodybioluminescenceimagesoforthotopicCT26D0X -bearingmicetreatedbyPBS,DOX,andDOXGLCSmicelles. Th reerepresentativemicepertreatmentgroupareshown. (b)C Timagesofmiceafterdiff

19、erenttreatments, (c)HEimagesan dKi67imagesofintestinaltissuesoforthotopicCT26D0Xtu mor-bearingmicetreatedbyPBS,DOXandDOXGLCSmicelles ( Scalebar=50 5). (d)TheP-gpexpressionofCT26D0Xtumort issuestreatedbyPBS,DOXandDOXGLCSmicelles. (e)Theint estinalpermeabilityofmiceafterdifferenttreatments. 3結(jié)論本文設(shè)計了一種

20、腸道菌群葡萄糖醛酸酶響應(yīng)載藥膠束用于 克服結(jié)腸癌化療耐藥.通過親疏水自組裝，構(gòu)建包載疏水藥 物D0X的GL膠束.隨后，在GL膠束表面修飾殼聚糖構(gòu)建 DOXGLCS載藥體系.口服給藥后，DOXGLCS在腸道菌群作用 下裂解，釋放DOX.同時，細(xì)菌分泌的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化甘草酸 生成甘草次酸，抑制腫瘤耐藥蛋白P-gp表達(dá).在2種原位結(jié) 腸癌小鼠模型中，DOXGLCS治療均顯著地增強了化療效果, 并修復(fù)了受損的腸道黏膜.該菌群觸發(fā)釋藥型膠束為克服 CRC化療耐藥性提供了新策略.以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)12.其次，基因藥物siRNA和小分子化 療藥物在理化性質(zhì)和藥代動力學(xué)上存在很大差異，影響治療 效率13.再則，

21、siRNA及納米載體的生物安全性評估也是個 問題14.因此，開發(fā)符合臨床轉(zhuǎn)化需求的納米載體克服化 療耐藥十分關(guān)鍵15,16.腸道菌群紊亂在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色17.文 獻(xiàn)表明，結(jié)腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，并伴隨大 量分泌酶活性的增強:如膽固醇脫氧酶，脫羥酶和葡 萄糖醛酸酶18等.其中，葡萄糖醛酸酶的濃度在結(jié)腸區(qū) 域和腫瘤部位的活性比正常組織提高12.1倍19.基于此, 本文設(shè)計了一種腸道菌群葡萄糖醛酸酶響應(yīng)的甘草酸自組 裝載藥膠束(DOXGLCS),實現(xiàn)原位P-gp抑制劑的生成和化 療藥物的遞送，從而克服結(jié)腸癌化療耐藥(如圖1).甘草酸 (glycyrrhizin,GL)是一

22、種從甘草中提取的藥用分子，已在 臨床上使用了二十多年，具有良好的生物相容性20. GL由 親水性的葡萄糖酸和疏水性的甘草次酸 (glycyrrhetinicacid,GA)通過糖昔鍵連接而成21.通過 親疏水自組裝，GL形成膠束，包載疏水性藥物阿霉素 (doxorubicin,D0X).同時，在GL膠束表面靜電吸附正電性 殼聚糖(chitosan,CS),構(gòu)建DOXGLCS載藥系統(tǒng).作為一種 前藥自組裝載藥體系，D0XGLCS具有高載藥量、高穩(wěn)定性和 高腫瘤選擇性特點22,23. 口服給藥后24,膠束在胃和小 腸中保持穩(wěn)定，并有效地積累到結(jié)腸腫瘤區(qū)域.這里，細(xì)菌 分泌的葡萄糖醛酸酶25迅速水解

23、甘草酸的糖昔鍵，導(dǎo)致膠 束結(jié)構(gòu)破壞，釋放藥物DOX.同時，甘草酸轉(zhuǎn)化為P-gp抑制 劑甘草次酸，有效地降低了腫瘤細(xì)胞P-gp表達(dá)26.在2種 原位結(jié)腸癌小鼠模型中，口服DOXGLCS顯著地抑制了腫瘤 生長.此外，殼聚糖作為一種益生元，被腸道有益菌代謝， 調(diào)節(jié)失調(diào)的腸道菌群和過激的炎性狀態(tài)，修復(fù)受損的腸道黏 膜27,28.該膠束結(jié)構(gòu)簡單，成藥性好，高效逆轉(zhuǎn)了腫瘤耐 藥，為增強腫瘤化療提供了新可能.Fig. 1(a) Preparationofgutmicrobialglucuronidase-resp onsiveDOXGLCSmicellesfordeliveryofDOXandinsitug

24、ene rationofP-gpinhibitortoovercomecoloncancerchemother apyresistance. (b)Themolecularillustrationfortheself -assemblyofDOXGLCSmicellesandproductionofP-gpinhib itor,GA. (c)SchematicrepresentationofDOXGLCSmicelle stoovercomeCRCdrugresistanceandintentinalmucosalrep air.1實驗部分LI主要原料甘草酸和甘草次酸購自上海麥克林生化科技有限

25、公司.阿霉 素、花和FITC-葡聚糖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公 司.殼聚糖、冰醋酸、丙酮、DMSO和三乙胺購自國藥集團(tuán)化 學(xué)試劑有限公司.3-(4,5-二甲基嚷哇-2-yl)-2,5-二苯基四 哩澳化鉉(MTT)、RPMI1640培養(yǎng)基、Dulbecco改良培養(yǎng)基 (DMEM)、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉菌、喋吟霉素和胎牛血清 (FBS)均來自 GIBCOInvitrogen 公司.1. 2臨界膠束濃度(CMC)測定膠束的CMC值根據(jù)花熒光探針法測定29.分別向7個樣品 管中加入0. ImL花的丙酮溶液(6X10-6mol/L),靜置24h, 待溶液揮發(fā)完全后依次向樣品管中加入ImL不同濃度

26、的甘草 酸溶液(濃度分別為1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3和 15. 6mg/L),室溫靜置12h后，用熒光分光光度計檢測熒光 強度(發(fā)射波長為393nm).以熒光光譜(300360nm)的第三振 動帶13和第一振動帶II的比值為縱坐標(biāo)，以甘草酸濃度的 對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，曲線切線的交點即CMC值.3D0XGLCS膠束的制備將抗癌藥物鹽酸阿霉素溶于DMSO,加入三乙胺去除鹽酸以獲 得疏水性藥物DOX.將Img脫鹽阿霉素溶解于0. 05mLDMS0中，得到藥物溶液.將 制得的藥物溶液加入到甘草酸(lmg/mL,7mL)溶液中，在室溫 下避光攪拌lh,得到GL載藥膠束.

27、將Img殼聚糖加入到lniL2%冰醋酸溶液中，攪拌過夜，使殼 聚糖充分溶解將殼聚糖溶液快速加入到上述GL載藥膠束溶 液中，超聲lOmin, 11000r/min離心收集最終產(chǎn)品DOXGLCS.1.4膠束載藥量和體外釋藥行為測定將lmgDOXGLCS膠束分散于ImLDMSO中，通過DOX在DMSO 中的標(biāo)準(zhǔn)曲線（激發(fā)波長為488nm）計算膠束中的DOX含量， 并計算藥物的載藥量.載藥量陰（材料中包載的藥物質(zhì)量/材料的質(zhì)量）X100%為研究阿霉素體外釋放行為，將lmg/mLDOX回GLCS膠束分別 在模擬胃液（SGF,pH=2. 0）、模擬小腸液（SIF,pH=6. 8）和模擬 結(jié)腸液（SCF,p

28、H=7.4,20%小鼠糞便濾液）中孵育24h30,并 于1、2、4、8、12、24h收集上清液.釋放出的DOX含量通 過熒光分光光度計進(jìn)行檢測，最終參照DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 出累積釋放量.累積釋放量二（某時刻已經(jīng)釋放的藥物量/材料中總的藥物 量）X100%1.5粒徑、電勢和透射電子顯微鏡（TEM）膠束的粒徑和電勢在25C條件下用Nano-ZS-ZEN3600（馬爾 文儀器）進(jìn)行測定，所有數(shù)據(jù)均獨立測定3次，并以3次數(shù) 據(jù)的平均值作為最終測定結(jié)果.膠束的微觀形貌通過透射電 子顯微鏡（JEM-2100,日本）進(jìn)行觀測.1. 6高效液相色譜（HPLC）分析采用高效液相色譜法（HPLC）分析腸道菌群對

29、DOXGLCS膠束 的體外降解行為31.簡單地說，從小鼠中取0. 5g盲腸內(nèi)容 物，懸浮在含有l(wèi)mg/mLDOXGLCS膠束的40mL厭氧培養(yǎng)基中， 將混合物在37CT培養(yǎng)24h,將所有樣品液過濾以去除細(xì)菌. 在30mL氯仿中超聲提取上清液，并將所有的提取物混合在 一起，在水浴中蒸發(fā)至干燥.將殘渣溶解于甲醇中， 3000r/min離心5min,用于高效液相色譜分析.采用C-18柱 進(jìn)行測試.流動相為甲醇/乙酸鉉溶液(0. 2mol/L)/冰醋酸 (65/34/1, V/V/V)；流速：ImL/min；檢測波長為 250nm；進(jìn) 樣20 M L；樣品運行時間為40min.1.7細(xì)胞攝取實驗CT2

30、6小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMT1640培養(yǎng)基 中培養(yǎng)(1%青霉素-鏈霉素，lOOOOU/mL).轉(zhuǎn)染熒光素酶的 CT261uc細(xì)胞在添加5%喋吟霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培 養(yǎng).HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞和NCM460人正常腸上皮細(xì)胞在含 10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng).采用熒光共聚焦顯微鏡(CLSM)和流式細(xì)胞術(shù)探索結(jié)腸癌細(xì) 胞對DOXGLCS膠束攝取行為.將CT26細(xì)胞接種于六孔板并 在37CT培養(yǎng)24h.同時,D0X和D0XGLCS膠束(阿霉素含量 為2和4 U g/mL)分別與模擬結(jié)腸液SCF共培養(yǎng)24h.收集上 清，并與CT26細(xì)胞孵育4h.將CT26

31、細(xì)胞洗滌3次，重懸于 PBS中用CLSM觀察細(xì)胞內(nèi)熒光情況.對于流式細(xì)胞分析實驗, 細(xì)胞被消化收集來定量分析材料的內(nèi)吞行為.1. 8細(xì)胞毒性檢測用MTT法測定材料的細(xì)胞毒性.為了評估GLCS空白膠束對正 常細(xì)胞NCM460的細(xì)胞毒性,將NCM460細(xì)胞接種于96孔板 并在37CT培養(yǎng)24h.然后，分別加入不同濃度梯度的GLCS 溶液(31.3、62.5、125、250、500 和 1000 u g/mL),繼續(xù)孵 育24h.接著,加入MTT溶液(5mg/mL,10%).4h后，加入 150ULDMS0,在570nm處測定溶解的甲瓚紫的吸光度.為了評估DOX回GLCS膠束的細(xì)胞毒性，將CT26細(xì)

32、胞或IICT116 細(xì)胞接種于96孔板并在37笆下培養(yǎng)24h.同時，將不同濃度 的游離 DOX 或 D0XGLCS 膠束(DOX 濃度：0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、 1.6和3. 2 u g/mL)分別與SCF共培養(yǎng)24h.收集上清液，加入 到CT26細(xì)胞或HCT116細(xì)胞中孵育24h,用于后續(xù)MTT檢測. 為了直接證明腸道菌群代謝產(chǎn)生的甘草次酸的化療增敏作 用，將Img/mL甘草次酸溶液和不同濃度的DOX溶液(DOX濃 度：0.25、0.5、1和2 U g/mL)共混，加入到CT26細(xì)胞中孵 育24h,用于后續(xù)MTT檢測.1. 9 誘導(dǎo) DOX 耐藥 CT26 細(xì)胞(CT26D0

33、X)采用濃度梯度遞增法誘導(dǎo)耐阿霉素CT26細(xì)胞(CT26D0X).詳 細(xì)地，將CT261uc細(xì)胞與含50ngmL-lD0X的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h. 去除死細(xì)胞，存活下來的細(xì)胞進(jìn)一步與含50ng/mLD0X的培 養(yǎng)基共孵育.同樣地，收集活細(xì)胞再進(jìn)一步培養(yǎng).經(jīng)過3個循 環(huán)后,CT261uc細(xì)胞能在含50ng/mLD0X的培養(yǎng)基中正常生長. 接著，將DOX濃度提高到1 OOng/mL,并重復(fù)上述篩選周期. 最終,CT261 uc細(xì)胞在含300ng/mLD0X的培養(yǎng)基中生長良好， 證明成功誘導(dǎo)了 DOX耐藥的CT26細(xì)胞CT26D0X.1.10體內(nèi)抗腫瘤效果評估所有活體動物實驗均遵從武漢大學(xué)動物實驗中心動物護(hù)理 機(jī)構(gòu)和使用委員會及依據(jù)動物管理條例