1、毒理學(xué)基礎(chǔ)（全套課件250P）化學(xué)毒物的一般毒性作用一般毒性作用（general toxicity,基礎(chǔ)毒性,basic toxicity）：指外來化學(xué)物在一定的劑量、一定接觸時間和接觸方式下對機體產(chǎn)生的綜合毒效應(yīng)。一般毒性作用根據(jù)接觸時間的長短可分為急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒性。相應(yīng)的試驗稱急性毒性試驗、亞慢性毒性試驗和慢性毒性試驗。1 急性毒性作用2 局部刺激試驗 （local irritation test）3 蓄積毒性作用及其評價4 亞慢性和慢性毒性作用1 急性毒性作用新外源化合物首先需必須闡明其急性毒性的強度及特征。1.1 基本概念1.2 急性毒性試驗的目的1.3 急性毒性試驗設(shè)計

2、1.4 急性毒性替代試驗1.5 LD50應(yīng)用中的有關(guān)問題1.6 急性毒性評價1.1 基本概念急性毒性（acute toxicity）是指機體一次接觸或在24小時內(nèi)多次接觸外來化學(xué)物后所引起的快速劇烈的中毒效應(yīng)（結(jié)構(gòu)與功能變化）。一次接觸因給予途徑不同定義不同：口服和注射指瞬間將受試物給予機體；吸入和皮膚接觸指在特定期間內(nèi)（24小時）機體持續(xù)接觸受試物。1.2 急性毒性試驗的目的確定受試物使一種或幾種實驗動物死亡的劑量水平（LD50， LD100，LD01 ），以初步估計該化合物對人類毒害的危險性。為進一步的蓄積毒性試驗、亞慢性與慢性毒性試驗及特殊毒性試驗提供劑量和判斷指標(biāo)的依據(jù)。闡明一種化合物

3、的相對毒性、作用方式和特殊毒性表現(xiàn)，找出量-效關(guān)系，以便其毒性包括臨床癥狀、生理生化和病理變化、毒性性質(zhì)和可能的靶器官等有初步了解。為毒理學(xué)機制研究的初步探索。確定機體在環(huán)境中接觸的受試物侵入機體的途徑，研究受試物的代謝動力學(xué)過程。研究受試物急性中毒的預(yù)防和急救治療措施。1.3 急性毒性試驗設(shè)計1.3.1 試驗動物的選擇1.3.2 動物分組及樣本例數(shù)1.3.3 動物喂養(yǎng)環(huán)境1.3.4 劑量選擇1.3.5 染毒途徑1.3.6 試驗周期1.3.7 觀察指標(biāo)1.3.1 試驗動物的選擇原則是所選動物應(yīng)使試驗的結(jié)果能反映或預(yù)測人體接觸時的反應(yīng)。要求動物健康，體重差異不超過10%，試驗前應(yīng)禁食16小時。同

4、時盡量選用飼養(yǎng)管理方便、成本低的動物。1.3.1.1 動物種屬選擇1.3.1.2 動物品系選擇1.3.1.3 動物性別選擇1.3.1.4 動物年齡與體重選擇1.3.1.1 動物種屬選擇嚙齒類動物貓和犬豬和靈長目嚙齒類動物因缺乏嘔吐反射而利于經(jīng)口接觸受試物的吸收，但不適于研究經(jīng)口能引起嘔吐的化學(xué)毒物的毒性。大鼠和小鼠繁殖力強、壽命短、食譜與人類似、便于分析比較明確的生物學(xué)指標(biāo)，且價格低、易管理。大鼠在代謝和毒性反應(yīng)上與人類較為接近，用于急性毒性試驗占第一位。小鼠占第二位。家兔因盲腸較長，經(jīng)口接觸毒物在腸道的吸收充分，結(jié)果往往毒性大于其他動物。貓和犬因試驗成本較高，不適于樣本量大的試驗如測定LD5

5、0。僅僅用來驗證對毒性或?qū)κ茉囄锏亩拘?yīng)做深入研究時以及對某些毒作用的種屬敏感性進行比較。貓和犬有高度發(fā)達的嘔吐反射系統(tǒng)，有催吐效應(yīng)的化合物在經(jīng)口接觸時應(yīng)注意。豬和靈長目豬的食譜及皮膚結(jié)構(gòu)與人接近，是一種用來估計外來化合物對人急性毒性危害水平較好的試驗動物。但其飼養(yǎng)管理不便，價貴，也不適于樣本量大的試驗。靈長目動物在種系上與人類最接近，結(jié)果最能反映人體的反應(yīng)。但其價格昂貴，獲得較難?；静挥糜诩倍驹囼?。1.3.1.2 動物品系選擇動物品系是指源于一個共同祖先而具有特定基因型的一群生物。不同品系的同種動物，可對同一被檢物發(fā)生不同反應(yīng)，即存在品系差異。為了在同種動物中減少這種遺傳特性所決定的品系差

6、異，在毒性試驗中，最好采用同品系動物，即純種動物。1.3.1.3 動物性別選擇性別的選擇依試驗?zāi)康摹⒁蠖?。如需要著重觀察受試驗物對雄性動物生殖功能的影響，應(yīng)選用雄性動物。如為受試物的致畸形試驗作準備，則可只選用雌性動物。如一般地闡明受試物毒性的大小與性質(zhì)，則應(yīng)雌雄各半。1.3.1.4 動物年齡與體重選擇動物年齡一般選用初成年者。最常用的是出生2-3月齡、體重分別為200克和20克左右的大、小鼠；犬則需喂養(yǎng)1年左右；豚鼠體重200-250克；家兔2000-2500克；貓1500-2000克。如需研究受試物急毒作用的年齡差別，則應(yīng)選用不同年齡組動物。1.3.2 動物分組及樣本例數(shù)試驗動物應(yīng)按年

7、齡、性別和體重進行分層隨機分組。隨機方法可用抽簽法和隨機數(shù)字表法，即先將動物編號后，進行抽簽或查隨機數(shù)字表。注意隨機不等于隨意！每組樣本例數(shù)小鼠10至20只，大鼠12至16只，家兔8至12只。1.3.3 動物喂養(yǎng)環(huán)境實驗動物喂養(yǎng)室室溫應(yīng)控制在223，家兔可控制在203，相對濕度30%-70%，無對流風(fēng)。每籠動物數(shù)以不干擾動物個體活動及不影響試驗觀察為度，必要時單籠喂養(yǎng)。飼養(yǎng)室采用人工晝夜為好，早6點至晚6點進行12小時光照，其余時間黑暗。一般食用常規(guī)試驗飼料，自由飲水。1.3.4 劑量選擇一般采用查文獻和預(yù)試驗（少量動物試驗），估計LD50的范圍。然后以此劑量為中間劑量，然后以4倍數(shù)上下各推兩

8、個劑量組，共5組，使相鄰兩對數(shù)劑量的差值相等。如P90表6-3。1.3.5 染毒途徑接觸途徑的選擇應(yīng)以人在生產(chǎn)生活環(huán)境中接觸該化合物的方式為出發(fā)點。主要有：1.3.5.1 經(jīng)口接觸1.3.5.2 經(jīng)呼吸道接觸1.3.5.3 經(jīng)皮膚接觸1.3.5.1 經(jīng)口接觸其是指將受試物經(jīng)口攝入或用機械直接送入胃的過程。具體包括：灌胃：接觸量和時間準確，但操作相對不便。摻入飼料：是將受試物摻入飼料或飲水中，讓動物自行攝入的方法，其操作簡便，但接觸量和時間不夠準確。吞咽膠囊：是將受試物裝入膠囊內(nèi)，放入動物舌咽部迫使動物咽下。本法操作不便，僅適于較大的動物。1.3.5.2 經(jīng)呼吸道接觸其適于在常溫、常壓下生產(chǎn)生活

9、中以氣態(tài)、蒸汽態(tài)、氣溶膠、煙霧與粉塵狀態(tài)存在的受試物的急性毒性試驗。具體接觸方式有：吸入（將試驗動物置于含有一定濃度的受試物的染毒柜或其它容器中，讓動物自然吸入）和注入（將受試物直接注入試驗動物的氣管或肺內(nèi)）。該途徑接觸的持續(xù)時間可依據(jù)試驗要求而定。毒性大的接觸時間可短些，毒性小的可長些。國內(nèi)一般在求LC50時為2小時。1.3.5.3 經(jīng)皮膚接觸液態(tài)、粉塵態(tài)和氣態(tài)外來化學(xué)物均有接觸皮膚的機會。不僅與外露皮膚接觸并被吸收，有的還能穿透衣服經(jīng)皮膚吸收。外來化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收是指角質(zhì)層完整的皮膚，若皮膚破損，化學(xué)物經(jīng)真皮直接吸收，而與靜脈吸收的機制相似。1.3.6 試驗周期急性毒性試驗除計算受試物的L

10、D50/LC50外，還需要通過觀察實驗動物的中毒癥狀判斷受試物的毒作用性質(zhì)，推斷中毒的靶器官等。因此，試驗周期一般為2周。1.3.7 觀察指標(biāo)應(yīng)根據(jù)急毒試驗的目的來確定觀察指標(biāo)。1.3.7.1 致死量/濃度1.3.7.2 中毒癥狀1.3.7.3 死亡及其時間1.3.7.4 體重1.3.7.5 其他指標(biāo)1.3.7.1 致死量/濃度常用LD50/LC50。其計算一般采用改良寇氏（krber ）法： LD50= log1 Xmi(Pi0.5) Xm為最大劑量的對數(shù)；i為相鄰兩對數(shù)劑量之差的絕對值；Pi為各組陽性反應(yīng)率的總和。毒性較大的用LD5/LC5。毒性劇烈的用LD1/LC1。1.3.7.2 中毒

11、癥狀在急性毒性試驗中，動物的中毒癥狀及死亡一般出現(xiàn)在給予受試物24-48小時內(nèi)，故觀察1周即可。如中毒反應(yīng)出現(xiàn)較遲，主要在給受試物后48小時-4天，則觀察期也應(yīng)相應(yīng)延長至2-4周。特別在48-72小時內(nèi)要仔細觀察各劑量組動物的一般反應(yīng)、臨床表現(xiàn)、死前表現(xiàn)及這些反應(yīng)出現(xiàn)的時間。具體觀察指標(biāo)見P123表6-1。1.3.7.3 死亡及其時間觀察試驗動物接觸受試物后的死亡過程有利于探討其中毒機制或死因。在同系化學(xué)物中，有些在致死量下表現(xiàn)出動物先興奮后抑制，死亡時發(fā)生抽搐；而有的則只引起抑制癥狀，表現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，并在抑制狀態(tài)下慢慢死亡，表明同系物之間的毒作用有差別。1.3.7.4 體重在急毒試驗

12、中對于存活動物尤其是低于LD50組的動物，應(yīng)觀察動物體重變化，以便了解受試物引起的中毒效應(yīng)是短暫的還是較長期的。盡管引起動物體重下降或增長率減慢的原因較為復(fù)雜，如受試物影響食欲或消化系統(tǒng)功能而使動物厭食或拒食可使體重下降，受試物可能會引起腹瀉而引起食物的吸收利用也可導(dǎo)致體重下降。影響腎功能可使水鹽代謝的紊亂而可影響體重。1.3.7.5 其他指標(biāo)根據(jù)上述某些指標(biāo)的陽性結(jié)果可進一步擴大觀察項目，如測定體溫、心電、腦電等生理學(xué)指標(biāo)或某些生化指標(biāo)，有利于深入探討受試物的毒作用特征。對死亡動物要取部分組織進行病理解剖學(xué)檢查，記錄各器官系統(tǒng)肉眼可見的病變；停止觀察后也應(yīng)抽取部分存活的動物進行病理解剖學(xué)檢查

13、。病理解剖學(xué)檢查對遲發(fā)性死亡動物，尤其是發(fā)生雙峰死亡的現(xiàn)象是必要的。雙峰死亡指早期死亡較多，繼而減少，然后又出現(xiàn)大批死亡的現(xiàn)象。病理解剖學(xué)檢查對估計受試物的毒理作用有一定的意義，并可為亞慢性、慢性和其它毒性試驗的設(shè)計提供依據(jù)。1.4 急性毒性替代試驗1.4.1固體劑量法（fixed dose procedure）1.4.2急性毒性分級法（acute toxic class method）1.4.3上下移動法（階梯法，up/down method）1.4.1 固定劑量法與經(jīng)典方法不同的是它不以動物死亡作為觀察終點，可以利用預(yù)先選定的或固定的一系列劑量染毒，從而觀察化學(xué)物的毒性反應(yīng)來對化學(xué)物的毒性

14、進行分級。實踐證明可大量節(jié)省試驗動物。實驗選擇的劑量范圍是5、50、500mg/kg，最高限量是2000mg/kg。歐共體（EEC）的急性經(jīng)口毒性分級標(biāo)準是：高毒（LD5025mg/kg），有毒（LD50為25-200mg/kg），有害（LD50為200-2000mg/kg），不分級（LD502000mg/kg）4個等級。1.4.2 急性毒性分級法它是以死亡為終點的分階段試驗法，每階段3只動物，根據(jù)死亡動物數(shù)，平均2-4階段即可判定急性毒性。使用動物數(shù)量少。首選大鼠進行試驗，在25、200、2000mg/kg中選擇一個劑量開始試驗，并據(jù)其結(jié)果判斷：不需進一步試驗進行分級；下階段以相同劑量的另一

15、種性別試驗；下階段以較高或較低的劑量水平進行試驗。動物觀察14天，在染毒當(dāng)天觀察體征和死亡至少2次，之后每天觀察1次。染毒前和每周測體重，所有動物進行大體解剖，必要時進行組織病理學(xué)檢查（病檢）。1.4.3 上下移動法它以死亡為終點但也可用于觀察不同的終點。特點是所需的動物數(shù)更少。根據(jù)初步的資料確定第一個動物接受化學(xué)物的劑量，由第一只動物染毒后的反應(yīng)決定第二只動物接受化學(xué)物的劑量，如果動物死亡，則下一個劑量降低；如存活則下一個劑量增高。該方法需要選擇一個合適的劑量范圍，使大部分動物所接受的化學(xué)物劑量都在真正的平均致死量左右。1.5 LD50應(yīng)用中的有關(guān)問題LD50具有重要的毒理學(xué)意義：在藥物研究

16、中，評價藥物急毒的大小，比較不同藥物毒性的大?。挥嬎闼幬锏闹委熤笖?shù)；為后續(xù)的重復(fù)給藥毒理學(xué)試驗提供劑量參考；比較不同途徑的LD50值，獲得生物利用度的信息；試驗中毒量及其體征為臨床不良反應(yīng)監(jiān)測提供參考。LD50的局限性：評價新藥及化學(xué)物時提供的信息較少，實用性有限；影響因素多，如性別、年齡、身體狀況及環(huán)境因素等；物種差異性影響大；經(jīng)典試驗所需的動物數(shù)量多。1.6 急性毒性評價在生產(chǎn)、運輸、貯存和銷售使用過程中也需要根據(jù)外來化學(xué)物的毒性分級，采取相應(yīng)的防護措施。為評價外來化學(xué)物急毒的強弱及對人類的潛在危害程度，國際上提出了化學(xué)物急毒的分級標(biāo)準用以對急毒進行評價。為便于比較化學(xué)物的毒性及有毒化學(xué)物

17、的管理，國內(nèi)外根據(jù)LD50的大小提出了許多分級標(biāo)準。WHO公布的全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度（GHS）中關(guān)于急性毒性危險類別和標(biāo)簽的要求見P125表6-2。注意：急毒不大，慢毒可能很大。因此不能將急毒分級與慢毒分級混淆。2 局部刺激試驗?zāi)康脑谟诹私饣瘜W(xué)物對眼和皮膚的局部刺激性和腐蝕性。2.1 眼刺激試驗（eye primary irritation test）2.2 皮膚原發(fā)性刺激試驗（skin primary irritation test）2.3 皮膚致敏試驗（skin sensitization test, allergic contact dermatitis test）2.1 眼刺激

18、試驗其觀察終點為眼刺激和眼腐蝕。眼刺激（eye irritation）指眼前表面接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性炎癥變化。眼腐蝕（eye corrosion）指眼前表面接觸受試物后產(chǎn)生的局部不可逆性組織損傷。方法用Draize試驗：家兔4只，滴眼后觀察結(jié)膜（紅、腫、分泌物）、角膜（混濁度及范圍）和虹膜（紅、腫）的反應(yīng)，按規(guī)定的分級標(biāo)準進行評分。一般觀察7天，必要時延長至21天。2.2 皮膚原發(fā)性刺激試驗皮膚刺激（dermal irritation）指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性炎癥變化。皮膚腐蝕（dermal corrosion）指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部不可逆性組織損傷。不宜進行皮膚刺激試

19、驗的情況:構(gòu)效關(guān)系及理化性質(zhì)推測可能有腐蝕性物質(zhì);急毒經(jīng)皮試驗有強系統(tǒng)毒性的物質(zhì);急毒經(jīng)皮試驗染毒量達2000mg/kg仍未產(chǎn)生皮膚刺激體征的物質(zhì)。試驗采用家兔或豚鼠，觀察時間應(yīng)足以觀察到可逆或不可逆刺激作用，一般不超過14天。影響試驗的因素：皮膚的完整性受破壞；固態(tài)物的物理性狀；受試物在皮膚表面封閉染毒的嚴密程度；動物的年齡與皮膚結(jié)構(gòu)的關(guān)系；種屬差異（一般敏感順序為：兔豚鼠人豬）。2.3 皮膚致敏試驗皮膚致敏是一種對化學(xué)物免疫介導(dǎo)的皮膚反應(yīng)，人體這類反應(yīng)表現(xiàn)為：瘙癢、紅斑、水腫、丘疹、水皰等。試驗動物常選豚鼠。試驗分兩個階段：誘導(dǎo)接觸（induction exposure）：是以較低或中等濃

20、度受試物對皮膚重復(fù)染毒（涂皮或皮下注射），一般需14天。激發(fā)接觸（challenge exposure）：是間隔10-14天后，用激發(fā)劑量（低于誘導(dǎo)時的劑量）受試物處理未染過毒的皮膚部位，然后觀察24小時、48小時和72小時后皮膚反應(yīng)。以皮膚反應(yīng)程度進行評分，比較誘導(dǎo)及激發(fā)后皮膚反應(yīng)情況，以判斷受試物能否產(chǎn)生皮膚過敏反應(yīng)。3 蓄積毒性作用及其評價3.1 基本概念3.2 實驗方法及其評價3.2.1 蓄積系數(shù)法3.2.2 生物半衰期法3.2.3 蓄積率3.3 相關(guān)機體耐受性3.1 基本概念蓄積作用指反復(fù)多次接觸同一化學(xué)物時，因前次接觸時未完全自機體清除，使其多次接觸后在體內(nèi)的總量不斷增加的現(xiàn)象。蓄

21、積性指化學(xué)物具有蓄積作用的性質(zhì)。貯庫指容易蓄積化學(xué)物的組織部位。常見的有血漿蛋白、脂肪組織、肝、腎及骨骼。蓄積作用一方面包括化學(xué)物在體內(nèi)量的增加，另一方面是組織結(jié)構(gòu)和功能改變的累積。3.2 實驗方法及其評價任何毒物都可在體內(nèi)蓄積。有些毒物分次進入的量雖小，但長期接觸仍可產(chǎn)生毒性；有些毒物雖然毒性較小，但大量接觸也可產(chǎn)生毒性?；瘜W(xué)物在體內(nèi)的蓄積現(xiàn)象是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)。蓄積毒性試驗是檢測外來化學(xué)物蓄積性大小的試驗，以了解某種外來化學(xué)物在體內(nèi)的蓄積情況和程度，并可為慢毒實驗設(shè)計提供依據(jù)。短期試驗（Short-term test）指在數(shù)日內(nèi)（7-14天），每天使試驗機體接觸一次受試物的試驗。以探

22、討較大劑量和較短時間的毒性作用。其與急性毒性試驗不同。3.2.1 蓄積系數(shù)法本法是一種生物效應(yīng)的試驗方法。原理是在一定期限內(nèi)以低于致死量（ LD50 ）間隔分次給予受試動物，直至出現(xiàn)預(yù)計的毒性效應(yīng)為止。計算達到預(yù)計效應(yīng)的總蓄積劑量，求出此蓄積劑量與一次接觸該化學(xué)物產(chǎn)生相同效應(yīng)所需劑量的比值-蓄積系數(shù)K：ED50（n）/ED50 （l） n-多次接觸產(chǎn)生相同效應(yīng)的劑量總和；l-單次接觸產(chǎn)生相同效應(yīng)的劑量。K越大表明蓄積性越小。K1表示高度蓄積，1K 3表示明顯蓄積， 3 K5表示中等蓄積，K5表示輕度蓄積。蓄積系數(shù)的具體試驗方法有：固定劑量法定期遞增劑量法20天試驗法固定劑量法先按常規(guī)方法測定L

23、D50 。然后用另一批條件相同的動物，分成2-4組，每組10-20只，雌雄各半。試驗組每日定時定量（1/20-1/5 LD50之間）并以相同途徑給予受試動物，試驗期間每日記錄動物的蓄積死亡數(shù)至累計發(fā)生一半動物死亡（異外死亡除外），即可計算K值。若接觸蓄積劑量已達到5個LD50量，也可停止試驗，表明K大于5。單次接觸量應(yīng)根據(jù)動物體重作相應(yīng)調(diào)整。試驗期最長100天（每次接觸量1/20 LD50 ），最短25天（每次接觸量1/5 LD50 ）。定期遞增劑量法在測出LD50后，同上法選擇相同條件的動物，分為接觸組和對照組。試驗以4天為一期，每天給相同劑量受試物。開始按1/10 LD50給予。此后每期給

24、予量按等比級數(shù)遞增1.5倍。連續(xù)接觸20天即可結(jié)束試驗。若試驗期中只要受試物引起一半動物蓄積死亡，也可結(jié)束試驗。20天試驗法本法是我國對農(nóng)藥及食品安全性的毒理學(xué)評價中提出的方法。采用體重200克左右的成年大鼠，也可用小鼠。每個劑量組雌雄動物各10只。各組受試物劑量分別為LD50的1/20、1/10、1/5及1/2，另設(shè)對照組。每天染毒1次，連續(xù)20天，各組染毒累量可達1、2、4和10 LD50 。再繼續(xù)觀察7天。若1/20 LD50組有動物死亡，且有量效關(guān)系，則為強蓄積性，應(yīng)放棄繼續(xù)試驗。若到1/2 LD50組才有動物死亡，則為弱蓄積性。3.2.2 生物半衰期法生物半衰期（t1/2）是指外來化

25、學(xué)物在體內(nèi)消除一半所需要的時間。其可反應(yīng)化學(xué)物在體內(nèi)的蓄積量。蓄積量越大毒性反應(yīng)越強，但不一定呈平行關(guān)系。t1/2的測定可用作圖法，先求出消除速率常數(shù)K。即以時間為橫坐標(biāo)，一級動力學(xué)消除物質(zhì)以血漿對數(shù)濃度為縱坐標(biāo)，零級動力學(xué)消除物質(zhì)以血漿濃度為縱坐標(biāo)，其斜率為K。再根據(jù)不同動力學(xué)消除特性求t1/2 ：一級消除t1/2 =0.693/k；零級消除= 0.5C0/K。多數(shù)物質(zhì)以一級消除。有零級消除特性的物質(zhì)在接觸量很小時，也以一級消除，但累積到一定程度后轉(zhuǎn)變?yōu)榱慵壪?。多次接觸后t1/2 與蓄積極限量的關(guān)系見圖6-2。除吸入接觸外，蓄積極限值可按下列公式估計：L=1.44X每日吸收量X t1/2

26、（日）。3.2.3 蓄積率蓄積率是指在一定時間內(nèi)，外來化學(xué)物在體內(nèi)的蓄積量與同一期進入機體總量的百分比。其越高該化學(xué)物的蓄積性越大。其測定可用化學(xué)測定法測定，但較困難。實際采用生物測量法進行測定： 將動物分為試驗組和對照組。試驗組先在一定時期（蓄積期）內(nèi)每日給予一定量的受試物，但不得有動物死亡。蓄積一定量后同時與對照組進行LD50的測定，再按下列公式計算蓄積率。 蓄積率=（對照組LD50 -試驗組LD50 ）/蓄積期試驗組給予受試物的總量3.3 相關(guān)機體耐受性耐受性是指在一定劑量下未出現(xiàn)或出現(xiàn)程度較預(yù)期低的反應(yīng)的現(xiàn)象。在蓄積試驗中，有時常于實驗結(jié)束時將存活的動物給予一次沖擊劑量（ 一般為LD5

27、0 ），然后與未進行預(yù)先化學(xué)處理的對照組的死亡率進行比較，以確定是否具有耐受性。若試驗組較對照組的死亡率低，則具有一定的耐受性，若高于或與對照組的死亡無差別，則無耐受性。蓄積性與耐受性往往同時存在，有些以蓄積性為主，而有些以耐受性為主。4 亞慢性和慢性毒性作用及其評價4.1 基本概念及試驗?zāi)康?.2 亞慢性毒性試驗設(shè)計4.3 慢性毒性試驗設(shè)計4.4 亞慢性、慢性毒性作用評價4.1 基本概念及試驗?zāi)康?.1.1 亞慢性、慢性毒性作用的概念4.1.2 亞慢性毒性作用的試驗?zāi)康?.1.3 慢性毒性作用的試驗?zāi)康?.1.1 亞慢性、慢性毒性作用的概念亞慢性毒性作用指試驗動物連續(xù)多日接觸較大劑量的外來化

28、學(xué)物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。連續(xù)多日約相當(dāng)于受試動物壽命的1/30-1/10。一般環(huán)境毒理學(xué)和食品毒理學(xué)要求連續(xù)接觸3-6個月，工業(yè)毒理學(xué)要求3個月。呼吸道接觸主張30-90天試驗，每天6小時，每周5天；皮膚接觸試驗為30天。較大劑量上限應(yīng)小于急毒試驗的LD50 。慢性毒性作用指以低劑量外來化學(xué)物長期給予試驗動物接觸，其對試驗動物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。4.1.2 亞慢性毒性作用的試驗?zāi)康哪康闹饕菫槁驹囼炋峁┰O(shè)計依據(jù)：探討試驗動物長期接觸外來化學(xué)物可引起有害效應(yīng)的劑量，以估計該化學(xué)物慢性接觸的危險性，為進一步進行慢毒試驗提供接觸劑量的設(shè)計范圍；探討亞慢性毒性的閾劑量/濃度，確定對動物的毒作用性質(zhì)、發(fā)生毒

29、效應(yīng)的類型和靶器官，并初步確定最大無作用量，從而確定慢性毒性作用的觀察指標(biāo)；根據(jù)亞慢性毒性的閾劑量和無作用量，估計慢性接觸的危險性，為接觸該化學(xué)物的安全限量標(biāo)準提供初步依據(jù)，以確定是否需進一步進行慢毒試驗；了解受試物對動物繁殖及對子代的致畸作用，為評價受試物能否應(yīng)用于食品提供依據(jù)。4.1.3 慢性毒性作用的試驗?zāi)康穆驹囼炇峭鈦砘瘜W(xué)物一般毒性評價程序中最后階段的觀察，其目的是為了評價動物長期接觸某受試物后可能出現(xiàn)的毒性作用，尤其是進行性或不可逆的毒性作用以及致癌作用，以確定外來化學(xué)物的毒性下限，即長期接觸該化學(xué)物可以引起機體危害的閾劑量和最大無作用量，為最終評價受試物能否應(yīng)用于食品提供依據(jù)，為

30、進行該受試物的危險評價與制定人接觸該物質(zhì)的安全限量提供毒理學(xué)依據(jù)，如最高允許濃度和每日允許攝入量等。4.2 亞慢性毒性試驗設(shè)計4.2.1 試驗動物的選擇4.2.2 試驗動物的喂養(yǎng)環(huán)境4.2.3 劑量的選擇與分組4.2.4 染毒途徑4.2.5 試驗周期4.2.6 觀察指標(biāo)4.2.1 試驗動物的選擇原則上要求對受試物代謝過程基本與人類相似,應(yīng)當(dāng)是急性毒性試驗已證明的對受試物敏感的種屬和品系,同時還應(yīng)考慮與慢性毒作用試驗中預(yù)計使用的動物種屬和品系相同。若無法掌握這一情況，則應(yīng)有兩種實驗動物，一種為嚙齒類，另一為非嚙齒類，以便了解受試物毒性特征。也應(yīng)參考觀察指標(biāo)的需要而選擇，如需多次抽血檢查則不宜用小

31、鼠。性別選擇一般雌雄兼用，特殊試驗可選用單性別動物。如對性腺影響試驗。年齡選擇大鼠4周，重50克；小鼠3周，重10克。4.2.2 試驗動物的喂養(yǎng)環(huán)境在亞慢性試驗期間，動物飼養(yǎng)條件及環(huán)境可能影響毒性效應(yīng)，應(yīng)注意營養(yǎng)平衡和環(huán)境的穩(wěn)定，必須有營養(yǎng)合理的飼料、充足干凈的飲水和清潔的生活環(huán)境。并保持適宜的溫度和濕度，以保證動物健康。當(dāng)受試驗物在飼料中的比例較高（大于5%）時，須考慮其可食性及營養(yǎng)平衡問題，還要避免經(jīng)胃腸代謝后的毒物又被動物攝取而影響試驗結(jié)果。不同物種的動物應(yīng)分室飼養(yǎng)，籠具要保證實驗動物可自由活動，必要時單籠飼養(yǎng)，且應(yīng)有人工晝夜設(shè)施。4.2.3 劑量的選擇與分組所選劑量上限應(yīng)在試驗期不引起

32、動物死亡或個別死亡，但要有明顯的中毒效應(yīng)或靶器官出現(xiàn)明顯損傷?？蓞⒖技倍驹囼灥拈搫┝繛槠渖舷蓿部捎?/20-1/5LD50。亞慢性試驗應(yīng)求量-效關(guān)系，因此至少設(shè)置3-4個劑量組、1個正常對照組，必要時加1個溶劑對照組。每組動物大鼠20-40只、家兔10-20只、狗6-8只、猴2-4只，若試驗中期需處死部分動物作病理解剖檢查時應(yīng)相應(yīng)增加動物例數(shù)。4.2.4 染毒途徑染毒途徑先要盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該受試物的途徑和方式，其次應(yīng)與后來預(yù)期要進行的慢毒試驗的接觸途徑一致。經(jīng)口接觸一般采用飼喂法。但應(yīng)注意動物厭食或拒食。經(jīng)呼吸道吸入接觸的時間隨所接觸受試物而定，如為工業(yè)毒物可接觸1-4小時，環(huán)境污

33、染則可適當(dāng)延長至4-8小時。每日接觸受試物應(yīng)定時，以減小接觸量和反應(yīng)誤差。4.2.5 試驗周期試驗周期一般占實驗動物壽命的1/10。因為不同動物的壽命不同導(dǎo)致實驗周期有所不同，從幾個月至1年不等。一般對長周期、經(jīng)常接觸的受試物可選擇90天試驗周期，而對階段性接觸的受試物可選擇30天。4.2.6 觀察指標(biāo)亞慢性試驗中觀察指標(biāo)比較廣泛，其選擇十分重要。常根據(jù)急性、蓄積性試驗提供的線索及相關(guān)資料，選擇一些特異和非特異指標(biāo)，包括一般性指標(biāo)、血液和行為學(xué)檢查、生理生化指標(biāo)、病理解剖學(xué)與病理組織學(xué)檢查及器官系數(shù)測定等。4.2.6.1 一般指標(biāo)4.2.6.2 病理學(xué)檢查4.2.6.3 特異指標(biāo)4.2.6.1

34、 一般指標(biāo)為非特異指標(biāo)，是外來化學(xué)物對機體毒性作用的綜合性總體反映。主要包括：動物體重：反映化學(xué)物對消化系統(tǒng)和代謝的影響。食物利用率：攝食量與體重的增長比率。同樣反映化學(xué)物對消化系統(tǒng)和代謝的影響。癥狀：主要有毛色、眼分泌物、呼吸、神態(tài)及行為。臟器系數(shù)：臟器濕重與體重的比率?？煞从尘唧w受損的器官。一般生化指標(biāo)：主要是血象和肝腎功能指標(biāo)。4.2.6.2 病理學(xué)檢查凡是在染毒過程中死亡的動物，均應(yīng)即使解剖進行病理組織學(xué)檢查，必要時作組織化學(xué)或電鏡檢查。檢查時所選臟器應(yīng)參照急性毒性試驗的臟器改變或亞慢性毒性試驗的中毒癥狀而定。必要時可進行所有臟器的病理組織學(xué)檢查。4.2.6.3 特異指標(biāo)特異指標(biāo)是指對

35、機體亞慢性毒性作用本質(zhì)的特征性指標(biāo)。其與受試物的中毒機制密切相關(guān)。指標(biāo)選定一是全面分析受試物急性毒作用特征，初步發(fā)現(xiàn)主要危害的系統(tǒng)、器官和組織，來發(fā)現(xiàn)一些敏感或特異性指標(biāo)；另一方面是通過文獻檢索，參考一些化學(xué)物的同系物、某些特殊基團具有的特定毒性，利用構(gòu)效關(guān)系的共性來選擇特異性指標(biāo)。4.3 慢性毒性試驗設(shè)計慢毒試驗是制定人體日允許攝入量所需的關(guān)鍵性資料。4.3.1 試驗動物的選擇4.3.2 試驗動物的喂養(yǎng)環(huán)境4.3.3 劑量的選擇與分組4.3.4 染毒途徑4.3.5 試驗期限4.3.6 觀察指標(biāo)4.3.1 試驗動物的選擇因慢毒試驗為動物的大部分生命周期甚至終身，因此只能選用生命周期較短(23年

36、)的動物。又要對飼養(yǎng)條件、生化系統(tǒng)、繁殖、自發(fā)性疾病均有比較系統(tǒng)的了解，故傳統(tǒng)上選用大鼠（3-4周，50-70克）、小鼠（3周，10-12 克）。并要求品系明確一致（取決于被檢物的毒作用部位及毒劑量的總的敏感性，一般選對致癌物敏感的品系），雌雄各半。動物數(shù)量要求與亞慢性毒性試驗相似。4.3.2 試驗動物的喂養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)環(huán)境要求與亞慢性毒性試驗相同，如應(yīng)保證試驗動物有溫濕度適宜的生活環(huán)境及合理的營養(yǎng)。注意動物的營養(yǎng)成分可影響慢毒試驗的結(jié)果，如半合成飼料可增加致癌物的敏感性，黃酮類及大蒜素相反。4.3.3 劑量的選擇與分組試驗分零劑量組、預(yù)期無作用劑量組、閾劑量組、發(fā)生輕微但有明確毒效應(yīng)劑

37、量組和發(fā)生明顯的毒效應(yīng)甚至亞致使死水平劑量組，以求量效關(guān)系。必要時加溶劑對照組。劑量選擇參考：亞慢毒試驗結(jié)果：高劑量組為1/5-1/2閾劑量，輕微毒效應(yīng)組為1/20-1/10閾劑量，慢毒閾劑量組為1/50-1/20閾劑量，預(yù)期無作用劑量組為1/10最大無作用量、1/100閾劑量或10-50倍人群實際最大攝入量。急毒實驗結(jié)果：高劑量組為1/10LD50，慢毒閾劑量組為1/100LD50，預(yù)期無作用劑量組為1/1000LD50。美國環(huán)保局建議：0.125MTD和0.25MTD。MTD(最大耐受量):試驗組動物較對照組動物體重減輕不超過10%、無死亡、無中毒癥狀和病理損傷的最大量。4.3.4 染毒途

38、徑慢毒試驗多采用經(jīng)胃腸道與呼吸道接觸。經(jīng)胃腸道接觸一般將受試物與食物或飲水混合，由動物自然攝入。但若受試物有異味或易水解時可采用每日定時灌胃。經(jīng)呼吸道接觸，依試驗要求定每日接觸時間，如為工業(yè)毒物的試驗通常要求每日吸入4-6小時，如為環(huán)境污染物一般要求每日吸入8小時或更長時間。4.3.5 試驗期限其依試驗的要求和實驗動物種類而定。使用大、小鼠時，工業(yè)毒理學(xué)要求6個月；食品和環(huán)境毒理學(xué)一般要求1年以上至2年。若與致癌試驗結(jié)合進行，則最好長達接近動物的預(yù)期壽命，甚至終生。有人認為大鼠90天試驗即可確定慢性無作用水平；也有主張終生接觸才能全面反映受試物的慢毒效應(yīng)及求出閾劑量或無作用量。4.3.6 觀察

39、指標(biāo)應(yīng)以亞慢毒試驗的觀察指標(biāo)為基礎(chǔ)，選擇亞慢毒試驗中已呈現(xiàn)有意義的變化指標(biāo)。一般常規(guī)觀察指標(biāo)包括肝、腎功能，健康狀況、體重、血液及其它生化指標(biāo)。對死亡動物及試驗結(jié)束時應(yīng)作病檢。為減小誤差和排除陋檢，應(yīng)注意：試驗前應(yīng)對觀察指標(biāo)進行正常值檢查，剔除差異大的動物；觀察應(yīng)與對照組同步進行并作對比；檢測方法應(yīng)穩(wěn)定，并有質(zhì)量控制；應(yīng)在不同間隔（于6、12、18個月）處死部分動物檢測，以了解是否有進行性和可逆性變化。4.4 亞慢性、慢性毒性作用評價了解受試物毒性的大小及靶器官并找出敏感的毒效應(yīng)指標(biāo)，即最早出現(xiàn)在最低劑量組并與對照組比較差異有顯著性的毒效應(yīng)指標(biāo)。4.4.1 基本評價參數(shù)4.4.2 亞慢毒資料評

40、價4.4.3 慢毒資料評價4.4.4 綜合結(jié)論4.4.1 基本評價參數(shù)閾劑量是敏感毒效應(yīng)指標(biāo)出現(xiàn)改變的最小劑量（Limch)。用最低有害作用水平（ lowest observed adverse effect level，LOAEL）或最小作用量（MED）表達。最大無作用量（maximal no-effect dose）是不引起機體某種毒效應(yīng)的最大劑量。用無明顯作用水平（NOEL）或無明顯有害水平（NOAEL）表達。LOAEL或NOAEL是評價化學(xué)物對機體損害的主要指標(biāo)，但應(yīng)注明動物、試驗條件及觀察指標(biāo)。以此為基本可制定化學(xué)物的接觸極限。4.4.2 亞慢毒資料評價我國食品安全性毒理學(xué)評價程序中

41、規(guī)定：亞慢毒試驗中，最大無作用劑量小于或等于人可能攝入量的100倍，則表示毒性很強，應(yīng)放棄該化學(xué)物的使用；若最大無作用劑量在100-300倍之間，可進行慢毒試驗；若大于或等于300倍，則不必進行慢毒試驗，可直接進行毒性評價。4.4.3 慢毒資料評價如慢毒試驗中未發(fā)現(xiàn)致癌性：最大無作用劑量小于或等于人群的可能攝入量的50倍，表示毒性較強，應(yīng)放棄該化學(xué)物的使用；最大無作用劑量在50-100倍之間者，需相關(guān)專家共同評議；最大無作用劑量大于或等于100倍者，則可考慮允許使用于食品，并制訂衛(wèi)生標(biāo)準（限量）。若任何一個劑量組有致癌作用，且有量-效關(guān)系，多不允許用于食品。前述結(jié)合急毒試驗結(jié)果，慢毒作用帶（Z

42、ch=Limac/Limch）越寬，慢毒風(fēng)險越大，否則風(fēng)險越小。4.4.4 綜合結(jié)論可能出現(xiàn)于食品中的外來化學(xué)物，在各種毒性試驗中，一般都可表現(xiàn)出一定的毒性效應(yīng)。在決定此種化學(xué)物是否可用于食品時，主要根據(jù)其毒性在目前生產(chǎn)、生活條件下，是否可以得到控制。凡在目前生產(chǎn)、生活條件下，無法控制其毒害的物質(zhì)，不允許在食品中應(yīng)用。思考題1 急毒試驗中小鼠、大鼠和家兔每組樣本例數(shù)各應(yīng)為多少？2 試用寇氏（krber ）法計算LD50。3 如何用20天試驗法評價化學(xué)物的蓄積毒性？4 如何確定慢性毒性試驗的劑量和試驗周期？5 如何給食品安全性評價下綜合結(jié)論?1.1 基本概念變異：是物種在遺傳過程中出現(xiàn)的個體和各

43、代間種種不同程度的差異。突變：是遺傳物質(zhì)的一種可遺傳的變異。突變方式： 自發(fā)突變：物種在自然繁衍過程中出現(xiàn)的突變； 誘發(fā)突變：是人為造成的突變。致使突變物（誘變物、遺傳毒物）：能誘發(fā)遺傳物質(zhì)損傷而發(fā)生突變的物質(zhì)。致突變作用：引起遺傳物質(zhì)損傷，其改變隨細胞分裂而傳遞的過程。突變作用的結(jié)果：基因突變（點突變）和染色體畸變。1.2.4 細胞周期與細胞分裂細胞增殖周期是細胞從一次分裂結(jié)束到下次細胞分裂完成的這段時間。G1期（DNA合成前期）：mRNA、蛋白質(zhì)、酶合成旺盛，為DNA的復(fù)制作準備。此期約占增殖周期一半的時間。S期（DNA合成期）：進行DNA復(fù)制，為細胞分裂作準備。G2期（DNA合成后期）：

44、此期繼續(xù)合成與有絲分裂有關(guān)的RNA、蛋白質(zhì)和其它物質(zhì)。M期（有絲分裂期）：進行有絲分裂，一個細胞分裂成二個子細胞。2 致突變作用 類型基因是DNA鏈上的片段序列?；瘜W(xué)毒物引起基因突變作用的類型有：2.1 基因突變2.2 染色體畸變2.3 染色體數(shù)目異常2.1 基因突變包括三種類型:堿基置換移碼大段損傷堿基置換堿基置換是DNA鏈上某一堿基配對性能發(fā)生變化，使其在復(fù)制時DNA互補鏈配上錯誤的堿基。包括：轉(zhuǎn)換：原來的嘌呤或嘧啶被另一種嘌呤或嘧啶置換。顛換：是原來的嘌呤被嘧啶置換或嘧啶被嘌呤置換。移碼移碼是DNA中增加或減少了一對或幾對不等于3的倍數(shù)的堿基對(三聯(lián)密碼錯誤)所造成的突變。從受損部位開始

45、的堿基序列改變而形成錯誤密碼，并轉(zhuǎn)譯為不正常的氨基酸。其合成的蛋白質(zhì)性質(zhì)也就發(fā)生結(jié)構(gòu)和活性變化。大段損傷大段損傷是DNA的大段缺失或插入。它可跨越1個以上的基因。它往往是DNA斷裂后重接的結(jié)果。有時在減數(shù)分裂過程中發(fā)生錯誤聯(lián)合和不等交換所引起。2.2 染色體畸變?nèi)旧w畸變是染色體結(jié)構(gòu)異常。是因為染色體或染色體單體斷裂不發(fā)生重接或重接而不在原處所致（染色體型畸變或染色體單體型畸變）?；冾愋桶ǎ旱刮唬簲嗔押笾虚g節(jié)段倒轉(zhuǎn)180度重接。缺失：染色體丟失一個片段。重復(fù)：在一套染色體中增加染色體片段。易位：斷裂下的片段接到另一染色體上。裂隙、斷裂、環(huán)狀染色體。2.3 染色體數(shù)目異常正常動物的染色體都是

46、雙倍體（人23對）。染色體數(shù)目異?？梢员憩F(xiàn)為整倍性畸變和非整倍性畸變。整倍性畸變：染色體成對增減。非整倍性畸變：染色體奇數(shù)條增減。3 致突變作用 機制與后果3.1 以DNA為靶的損傷機制3.2 不以DNA為靶的損傷機制3.3 突變的后果3.1 以DNA為靶的損傷機制形成DNA加合物：親電子物質(zhì)可與細胞內(nèi)DNA分子中的親核原子以共價鍵結(jié)合形成加合物。平面大分子嵌入DNA鏈：以靜電吸附形式嵌入DNA單鏈堿基之間或DAN雙螺旋結(jié)構(gòu)相鄰多核苷酸鏈之間。形成DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物：DNA與蛋白質(zhì)分子以共價鍵結(jié)合成交聯(lián)物。破壞堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)。DNA分子的堿基被其類似物取代。形成二聚體而影響復(fù)制。3.2 不以

47、DNA為靶的損傷機制2.1 影響DNA合成與修復(fù)的酶：DNA合成酶。2.2 對紡錘體的損害：與微管蛋白二聚體結(jié)合，妨礙微管組裝；與微管上巰基結(jié)合，影響微管作用；破壞已組裝的微管；妨礙中心粒移動，影響有絲分裂。3.3 突變的后果體細胞突變：引起個體病變?nèi)缒[瘤、畸形、動脈粥樣硬化、糖尿病、衰老、高血壓等，但不影響下代 。生殖細胞突變：可影響下代和遺傳。根據(jù)對人類影響程度分：對機體無影響；對機體健康無影響的遺傳學(xué)變異；遺傳易感性改變；遺傳性疾??；致死性突變。4 機體對致突變作用的影響機體對突變DNA具有修復(fù)機制。機體對致突變作用的影響相當(dāng)復(fù)雜,其中重要的因素是遺傳因素，包括代謝酶遺傳多態(tài)性和修復(fù)功能

48、的個體差異。4.1 DNA損傷的修復(fù)4.2 遺傳因素對致突變作用的影響4.1 DNA損傷的修復(fù)直接修復(fù)切除修復(fù)錯配修復(fù)雙鏈斷裂修復(fù)交聯(lián)修復(fù)直接修復(fù)其一是通過光裂合酶切下DNA上紫外線損傷產(chǎn)生的嘧啶二聚體。其二是通過烷基轉(zhuǎn)移酶將O-6位烷化而易造成堿基錯配的鳥嘌呤的烷基轉(zhuǎn)給蛋白質(zhì)，使鳥嘌呤恢復(fù)正常。切除修復(fù)它是一個多步驟的修復(fù)過程。有以下兩種：核苷酸切除修復(fù)：首先在內(nèi)切酶作用下打開受損DNA的雙鏈，在解螺旋酶作用下，切除含受損的寡核苷酸鏈。隨后在修復(fù)聚合酶作用下合成新的正常DNA鏈填補留下的空隙。最后由DNA連接酶封閉，恢復(fù)原有的DNA系列。堿基切除修復(fù)：首先由DNA糖基酶作用于受損的DNA，切

49、除其受損的堿基。隨后由內(nèi)切酶將DNA切斷。再由聚合酶及連接酶作用完成修復(fù)過程。 錯配修復(fù)（mismach repair）是一種性質(zhì)截然不同的切除修復(fù)，其特征是可以識別并除去在DNA復(fù)制時錯配的堿基對如G：T和A：C。雙鏈斷裂修復(fù)它實際不是修復(fù)，而是一種耐受過程。是一種以容忍損傷繼續(xù)存在和高突變率情況來換取細胞繼續(xù)生存的耐受過程。其通過同源重組或者非同源性末端連接機制使斷裂的DNA雙鏈被修復(fù)。交聯(lián)修復(fù)其包括：無誤交聯(lián)修復(fù)：通過降解雙螺旋，使鏈內(nèi)交聯(lián)轉(zhuǎn)變?yōu)殒渻?nèi)二核苷酸加合物連接于雙鏈斷裂處，隨后連接體分解而除去二核苷酸交聯(lián)。易誤交聯(lián)修復(fù)：包括整核苷酸切除修復(fù)和通過易誤DNA聚合酶進行的修復(fù)。4.2

50、 遺傳因素對致突變作用的影響代謝酶遺傳多態(tài)性修復(fù)功能的個體差異代謝酶遺傳多態(tài)性氧化代謝酶：如CYP1A1高誘導(dǎo)型與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。酯酶：如環(huán)氧水化酶不同表型，其細胞內(nèi)的分布和作用不同，它既是毒物活化酶，也是解毒酶。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）：它是重要的解毒酶，其也存在多態(tài)性。其中GST缺乏與肺癌密切相關(guān)。修復(fù)功能的個體差異O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）：其可將烷化的嘌呤和胸嘧啶上的烷基轉(zhuǎn)移到自身胱氨酸殘基上，是DNA得以修復(fù)。其缺乏與腫瘤具有相關(guān)性。二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP）：對DNA修復(fù)和基因組穩(wěn)定性起著重要作用。 5 致突變作用研究方法5.1 致突變試驗?zāi)康募爸?/p>

51、示生物5.2 常用致突變試驗5.3 致突變應(yīng)注意的問題5.1 致突變試驗?zāi)康募爸甘旧锬康模涸u定外源化學(xué)物對生殖細胞及體細胞的突變性，對致癌、致畸和遺傳危害的潛在可能作出初步評價。指示生物：細菌、病毒、真菌、昆蟲、哺乳動物及其體外培養(yǎng)細胞和植物。5.2 常用致突變試驗細菌回復(fù)突變試驗（Ames試驗）哺乳動物細胞基因突變試驗微核試驗（MNT）染色體畸變試驗顯性致死試驗（見生殖毒性試驗）程序外DNA合成（UDS）試驗姐妹染色單體交換試驗果蠅伴性隱性致死試驗單細胞凝膠電泳（SLRL）試驗熒光原位雜交（FISH）試驗轉(zhuǎn)基因動物致突變試驗細菌回復(fù)突變試驗細菌回復(fù)突變試驗是以營養(yǎng)缺陷型的突變體為指示生物，

52、觀察受試物是否糾正或補償突變體所攜帶的突變發(fā)生改變的體外試驗。原理是利用鼠傷寒菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，因其突變喪失合成組氨酸的能力而在無組氨酸培養(yǎng)基中不能存活，若受試物可使該菌發(fā)生回復(fù)突變，則其該菌在無組氨酸培養(yǎng)基中能存活。說明受試物有致突變作用。 菌株中AT97、AT98可檢測移碼突變，AT100可檢測置換突變。哺乳動物細胞基因突變試驗它是體外培養(yǎng)哺乳動物細胞的野生型基因失活的正向突變試驗。利用培養(yǎng)的哺乳動物細胞系如小鼠淋巴細胞系（L5178y）、中國倉鼠肺細胞株（V97）和卵巢細胞株（AS52），觀察接觸受試物后特定基因座位上是否誘變產(chǎn)生突變體。微核試驗是觀察受試物是否引起動植物細胞產(chǎn)生

53、微核的試驗。原理是：細胞經(jīng)過突變后，染色體和染色單體的無著絲點片段或因紡錘絲受損而丟失，使整個染色體在細胞有絲分裂后期不能進入子代細胞的細胞核中，而在間期的子代細胞漿內(nèi)形成一個或幾個規(guī)則的次核，即微核。染色體畸變試驗染色體畸變試驗是通過鏡下觀察（設(shè)備有流式細胞儀）染色體形態(tài)和數(shù)目改變的試驗。本試驗靈敏度高。染色體形態(tài)改變可見裂隙、斷裂、斷片、無著絲粒環(huán)、雙或多著絲粒染色體、射體和染色體破碎。注意：因其改變具有時相變化，應(yīng)在培養(yǎng)中多次檢測。程序外DNA合成試驗是通過觀察培養(yǎng)細胞在細胞增殖周期內(nèi)S期以外時相DNA合成情況的試驗。當(dāng)細胞DNA受損后，DNA的修復(fù)合成可發(fā)生在S期外時相，即程序外DNA

54、合成。因此，該試驗可反映DNA受損情況。具體實驗方法可利用放射自顯影或閃爍計數(shù)法。試驗具有簡便、經(jīng)濟和快速。姐妹染色單體交換試驗姐妹染色單體交換試驗是觀察染色體同源座位上DNA復(fù)制產(chǎn)物相互交換的試驗。在DNA合成期，所有染色體均可進行復(fù)制形成兩條姐妹染色體單體。其單體交換率可能與DNA的斷裂重接有正相關(guān)，從而間接提示DNA的損傷。具體觀察是通過姐妹染色單體差別染色法：果蠅伴性隱性致死試驗果蠅伴性隱性致死試驗是利用隱性基因在伴性遺傳中具有交叉遺傳的特征而進行的試驗。當(dāng)基因發(fā)生點突變、小缺失（DNA大段損傷）、重組等各類基因突變的隱性致死效應(yīng)，將伴性遺傳傳給F1雌性動物，再由其傳給F2雄性動物。

55、因F1雌性動物為雜合子，不能表達。而F2雄性動物為半合子，將表達出來。該試驗利用黑腹果蠅試驗，其具有世代周期短、繁殖率高、飼養(yǎng)方便、經(jīng)濟、判斷終點客觀、不需活化等優(yōu)點。但染毒方式與劑量計算與哺乳動物差異較大。單細胞凝膠電泳試驗單細胞凝膠電泳試驗是用凝膠電泳的方法觀察細胞DNA受損情況的試驗。在體內(nèi)外細胞與受試物接觸后，若DNA發(fā)生斷裂，制備加有其單細胞混懸液的凝膠，在堿性條件下使細胞裂解，解旋DNA后電泳，則觀察到細胞核呈慧星狀。通過圖像分析儀計數(shù)慧星狀細胞數(shù)，或通過目鏡測微尺在熒光顯微鏡下來測量細胞核的直徑和慧星尾部的長度，來判斷DNA受損情況。熒光原位雜交試驗熒光原位雜交試驗是一種在保持組

56、織、細胞或染色體原有形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對其內(nèi)部特殊核苷酸順序進行檢測及定位的試驗。熒光原位雜交技術(shù)是用生物熒光來標(biāo)記的各類DNA和RNA進行原位雜交，即可使被觀察的特定DNA序列顯現(xiàn)熒光。該法具有操作、分析簡便、立體分辨率高、準確迅速、安全性高等優(yōu)點。轉(zhuǎn)基因動物致突變試驗轉(zhuǎn)基因動物致突變試驗是用轉(zhuǎn)基因動物致突變系統(tǒng)來檢測基因突變的試驗。轉(zhuǎn)基因動物致突變技術(shù)是利用穿梭載體于原核和真核之間往返轉(zhuǎn)移，并帶可回收靶基因載體的轉(zhuǎn)基因動物提供哺乳動物體內(nèi)基因的檢測系統(tǒng)。它可在動物整體水平研究突變的器官、組織的特異性。并可通過從動物基因中重新回收的基因進行基因突變的組織專一性和順序變化的序列分析研究。5.3

57、 致突變應(yīng)注意的問題4.3.1 體外試驗的活化系統(tǒng)4.3.2 對照4.3.3 結(jié)果判斷5.3.1 體外試驗的活化系統(tǒng)由于體外試驗缺乏體內(nèi)試驗的代謝系統(tǒng)，一些需在體內(nèi)代謝活化的致突變物質(zhì)往往被漏檢。因此，體外試驗需要建立合適的代謝活化系統(tǒng)。如可采用與物質(zhì)代謝細胞（肝細胞）同時進行培養(yǎng)或S9混合液（含代謝酶的細胞勻漿液）。5.3.2 對照試驗應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照。陽性對照：用已知能產(chǎn)生陽性反應(yīng)的物質(zhì)作對照。以證明試驗方法的可靠；驗證試驗的重復(fù)性；驗證完成技術(shù)和鑒定致突變物的能力。陰性對照：以排除其它試驗因素所造成的誤差。5.3.3 結(jié)果判斷檢查質(zhì)量控制：注意試驗程序與操作的正確性；注意體外試驗中是

58、否存在體內(nèi)并不存在的某些因素如過高或過低的pH、滲透壓及代謝活化系統(tǒng)濃度是否偏離細胞或細菌的生理條件。體外試驗結(jié)果陰性：注意提供的代謝活化系統(tǒng)對受試物的活化是否合適和充足。體內(nèi)試驗結(jié)果陰性：注意受試物是否未能到達靶部位。應(yīng)綜合分析試驗組的效應(yīng)比陰性對照組是否明顯增強、是否具有量-效關(guān)系；弱效結(jié)果是否具有重復(fù)性等。思考題1 解釋：突變、自發(fā)突變、誘發(fā)突變、轉(zhuǎn)換、顛換。2 突變可引起哪些后果？3 致突變作用有哪些研究方法？4 細菌回復(fù)突變試驗（Ames試驗）的原理是什么？1.1.1 概念與危險性分級化學(xué)致癌物是能引起動物和人類腫瘤、增加其發(fā)病率或死亡率的化合物。國際癌癥研究中心2002年根據(jù)878

59、種化學(xué)物質(zhì)的致癌證據(jù)強度分四級： 對人及動物確有致癌作用；A 對人很可能有、對動物確有致癌作用； B 對人及動物可能有致癌作用； 不能判別是否有致癌作用； 對人類可能無致癌作用。遺傳毒性致癌物遺傳毒性致癌物指作用于DNA而引起基因突變或染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量改變而致癌的化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物。包括：直接致癌物：如烷化劑、親電子物質(zhì)；間接通過代謝產(chǎn)物致癌物：如芳烴、芳胺類；無機致癌物：如鎳、鉻。非遺傳毒性致癌物非遺傳毒性致癌物是作用于遺傳物質(zhì)以外的大分子而引發(fā)腫瘤的物質(zhì)。包括：促長劑：可增強遺傳毒性致癌物的致癌作用。內(nèi)分泌調(diào)節(jié)劑：改變內(nèi)分泌平衡及細胞正常分化。免疫抑制劑：主要增強病毒誘導(dǎo)的惡化。細胞毒劑：

60、引起細胞死亡、增殖活躍及癌發(fā)展。過氧化物酶體增殖劑：促進自由基生成。固形物：細胞毒？免疫？1.2 化學(xué)致癌物的活化與滅活許多外源化學(xué)物需在體內(nèi)經(jīng)相反應(yīng)活化后才具有致癌作用。常見物質(zhì)有：多環(huán)芳烴（PAH ）N-取代芳香族化合物（N-SAC）黃曲霉素（AFB1）N-亞硝胺類（NOC）多環(huán)芳烴多環(huán)芳烴有十余種，其中以3,4-苯并(a)芘B (a) P。B (a) P經(jīng)芳烴羥化酶生成環(huán)氧化物。B (a) P環(huán)氧化物經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）作用生成GSH-S結(jié)合物，使極性增強而促進排泄；B (a) P環(huán)氧化物經(jīng)環(huán)氧水化酶（EH）作用生成相應(yīng)的醇，再經(jīng)P-450作用形成具有致癌作用的醇環(huán)氧化物（尤其是7