1、第六章 酶的分子修飾 酶的化學(xué)修飾2. 酶的分子定向進(jìn)化.什么是酶分子修飾？ 通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程稱為酶分子修飾。.第一節(jié) 酶的化學(xué)修飾廣義：凡涉及共價(jià)部分或部分共價(jià)的形成或破壞的轉(zhuǎn)變。狹義：較溫和的條件下，以可控的方式是一種蛋白質(zhì)同某些化學(xué)試劑起特異反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸或其功能基團(tuán)發(fā)生共價(jià)的化學(xué)改變。.酶的化學(xué)修飾的功能 1）催化機(jī)理的研究 通過(guò)對(duì)特定基團(tuán)側(cè)鏈的化學(xué)修飾，可比較方便的獲得有關(guān)必需基團(tuán)的性質(zhì)，配合以保護(hù)手段還可以了解活性部位的信息。 2）有目的對(duì)目標(biāo)基團(tuán)進(jìn)行基團(tuán)改造或保護(hù)，可有目的的改變酶的活性。3）改變酶的生理生化性

2、質(zhì)，如穩(wěn)定性、最適pH、抗原性、實(shí)現(xiàn)特定目的的研究或應(yīng)用目的。.一、酶化學(xué)修飾方法及修飾劑修飾劑的要求反應(yīng)條件的選擇酶修飾方法酶學(xué)性質(zhì).1、影響酶化學(xué)修飾的主要因素（1）影響酶蛋白功能基團(tuán)反應(yīng)性的因素微區(qū)的極性蛋白質(zhì)中酚基和羧基相互作用中，羧基pKa低于正常值，而酚基的pKa高于正常值。靜電效應(yīng)位阻效應(yīng).2、修飾劑的反應(yīng)性選擇吸附靜電相互作用位阻因素催化因素.二、 修飾反應(yīng)專一性的控制（1）試劑的選擇 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，?duì)專一性的要求也不同。（2）反應(yīng)條件的選擇：不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性。有利于專一性修飾蛋白質(zhì).（3）反應(yīng)的專一性利用蛋白質(zhì)分子中某些基團(tuán)的特殊性 選擇不同的反應(yīng)pH 利用某些產(chǎn)物的

3、不穩(wěn)定性親和標(biāo)記 差別標(biāo)記利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異.三、修飾程度和修飾部位的測(cè)定（1）光譜法（2）化學(xué)修飾數(shù)據(jù)的分析化學(xué)修飾的時(shí)間進(jìn)程分析確定必要基團(tuán)的性質(zhì)和數(shù)目.設(shè)計(jì)酶化學(xué)反應(yīng)時(shí)應(yīng)注意酶性質(zhì)的了解酶活性部位情況 酶催化活性主要依賴于酶的活性中心。因此，對(duì)酶活性中心的組成，例如：酶蛋白中哪些氨基酸殘基或其側(cè)鏈基團(tuán)參與了酶的活性中心是否需要輔因子，為何種輔因子等情況，需要了解，此外，還需要了解酶的分子大小、形狀、寡聚酶的亞基組成等。 .酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件 酶的穩(wěn)定性 被修飾酶對(duì)熱、對(duì)酸堿的穩(wěn)定性，作用溫度及pH范圍以及最適溫度、最適pH的情況，酶蛋白解離時(shí)的電學(xué)性質(zhì)，酶蛋白水解部位，抑制劑

4、的性質(zhì)等應(yīng)有所了解。酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性 酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)及反應(yīng)性 選擇性修飾試劑必須要與多肽鏈中某種特定的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并形成緊密共價(jià)結(jié)合。酶分子中經(jīng)常被修飾的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)有：巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫鍵等。.反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例。反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)，鹽濃度和pH條件。反應(yīng)溫度及時(shí)間。不造成蛋白的不可逆變性有利于專一性修飾要求3 反應(yīng)條件的選擇.二、 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的修飾是通過(guò)選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。.1、幾種重要的修飾反應(yīng)（1

5、）?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)試劑特點(diǎn)：含有?；Y(jié)構(gòu)，C上帶有部分正電荷。這類試劑作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；?，酰基接到親核原子上?？勺饔没鶊F(tuán)包括： 氨基，作用后形成酰胺；巰基：作用后形成巰酯；醇羥基（絲氨酸、蘇氨酸）：作用后形成酯；酚羥基（酪氨酸）：作用后形成酚酯。. 酰基化反應(yīng)中的X既可以是鹵素，也可以是某些吸電基團(tuán)，如咪唑基。.（2）烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶有活潑鹵素，由于鹵素原子的電負(fù)性，使烷基帶有部分正電荷。該類試劑作用于側(cè)鏈基團(tuán)的親核基團(tuán)，使之烷基化，烷基連接在親核原子上?？勺饔没鶊F(tuán)包括：氨基（賴氨酸、精氨酸），巰基（半胱氨酸）、羧基（天冬氨酸、谷氨酸），甲硫基（甲硫氨酸），咪唑

6、基（組氨酸）.試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性這類試劑作用于側(cè)鏈基團(tuán)，可被氧化的基團(tuán)包括巰基，甲硫基，吲哚基（色氨酸）、咪唑基、二硫鍵等。而被還原的基團(tuán)主要是二硫鍵。（3）氧化和還原反應(yīng). 連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，可用于保護(hù)巰基。.（4）芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化、硝化試劑。該類試劑作用于酪氨酸的OH鄰位。.2、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾通過(guò)選擇性的試劑或者親核試劑與酶上特定的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾是酶分子化學(xué)研究的重要方法，也是改造酶的性質(zhì)和功能的重要手段。20種氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈容易被修飾，它們一般具有親核性。從酶動(dòng)力學(xué)的角度，酶必需基團(tuán)的化學(xué)修飾的過(guò)程

7、是不可逆抑制（激活）過(guò)程。.（1）巰基的化學(xué)修飾巰基具有很強(qiáng)的親核性，采用巰基化學(xué)修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上的巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變，從而改變酶的空間構(gòu)象、特性和功能。巰基修飾可以分為以下幾種：二硫鍵交換、重金屬化合物作用、烷基化、酰基化。.二硫鍵交換E-SH+R-S-S-R-E-S-S-R+R-SHE-SH+E-S-S-R-E-S-S-E+R-SH 與-SH進(jìn)行二硫鍵交換后，-SH被修飾，試劑的另一半以單體放出。 二硫鍵交換產(chǎn)生的單體在一定波長(zhǎng)下有很大的光吸收，可用分光光度計(jì)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。.二硫鍵交換常用試劑DTNB 5,5-二硫-2-硝基苯甲酸N-乙基馬來(lái)酰肼.（2）氨基的化學(xué)修飾 氨基具有很

8、高的親核性，可用多種?；蛘咄榛噭┻M(jìn)行修飾。烷基化.?；宜狒せ酋Ｂ龋―NS）.還原烷基化一個(gè)常用的特異性修飾賴氨酸氨基的試劑磷酸吡哆醛.（3）羧基的化學(xué)修飾 修飾羧基的反應(yīng)專一性差，一般選用合適的R和R的水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸，屬烷基化反應(yīng)。水溶性碳化二亞胺.酯化氟硼化三甲基金羊鹽（CH3)3OBF4.（4）咪唑基的化學(xué)修飾通過(guò)對(duì)咪唑基上氮原子?；蛲榛揎椊M氨酸咪唑基。焦炭酸二乙酯（DPC）是最常用的試劑。.碘代乙酸也可以對(duì)咪唑基上的碳進(jìn)行親核取代.（5）胍基的化學(xué)修飾二酮 環(huán)乙二酮苯酰甲醛該反應(yīng)本質(zhì)上是羰基對(duì)氨基?；Ｔ摲磻?yīng)一般可逆，需加硼酸鹽使產(chǎn)物與之反應(yīng)

9、而穩(wěn)定下來(lái)。但苯酰甲醛時(shí)反應(yīng)不可逆，不需加硼酸鹽。.（6）二硫鍵的化學(xué)修飾氧化：過(guò)甲酸還原：巰基乙醇.DTT 二硫蘇糖醇 DTT是目前最常用的二硫鍵修飾劑和巰基保護(hù)劑。.三、酶的親和修飾 親和標(biāo)記是最有意義的一種化學(xué)修飾，這是因?yàn)樗梢允呛軐Ｒ恍缘淖饔糜诿傅幕钚圆课?。親和標(biāo)記是分步反應(yīng)，修飾劑先可逆的結(jié)合在酶的活性部位，再不可逆的修飾該部位特定基團(tuán)，一般是必需基團(tuán)，而造成不可逆失活，親和標(biāo)記修飾劑一般是底物類似物，和底物含有共同的結(jié)合于酶的基團(tuán)，親和標(biāo)記的作用符合飽和動(dòng)力學(xué)特征，可以把親和標(biāo)記過(guò)程看作是一次自殺性酶反應(yīng)。.親和試劑一般是具有化學(xué)反應(yīng)性的蛋白質(zhì)分子的底物或配體的類似物。親和標(biāo)記試

10、劑在酶上有特定的結(jié)合部位，其解離常數(shù)也易于測(cè)定，可以提供酶的結(jié)構(gòu)信息，是理論研究中一類常用的修飾劑。親和標(biāo)記試劑一般在較低濃度下有效修飾酶，改變酶的活性，特別是專一性較強(qiáng)，是藥物等的優(yōu)良候選者，有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。.1、光親和標(biāo)記 特點(diǎn)：具有光反應(yīng)基團(tuán)。這種試劑先與酶活性部位在暗條件下發(fā)生特異性結(jié)合，然后被光照激活后，產(chǎn)生一個(gè)非常活潑的功能基團(tuán)，其能與他們附近的幾乎所有基團(tuán)反應(yīng)，形成一個(gè)共價(jià)的標(biāo)記物。.2、專一性的不可逆抑制劑 親和試劑可以專一性地標(biāo)記于酶的活性部位，使酶不可逆失活，因此，稱為專一性的不可逆抑制。.（1）Ks型抑制劑：根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，具有和底物的結(jié)構(gòu)相似的結(jié)合基團(tuán)，同時(shí)也可以

11、和酶的活性部位發(fā)生特異性結(jié)合，并且能夠?qū)钚圆课粋?cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾，導(dǎo)致酶不可逆失活。 （2）Kcat型抑制劑：根據(jù)酶催化過(guò)程設(shè)計(jì)，它具有酶的底物性質(zhì)，還有一個(gè)潛在的反應(yīng)基團(tuán)在酶的催化活化后不可逆抑制酶的活性部位，因此也稱為“自殺性抑制劑”。.四、有機(jī)大分子對(duì)酶的化學(xué)修飾 利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾法，簡(jiǎn)稱為大分子結(jié)合法。.1、聚乙二醇 聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。.天然SOD：半衰期

12、6min右旋糖酐修飾后：半衰期7hPEG修飾：半衰期35h.過(guò)程：活化：修飾劑中含有的基團(tuán)需要經(jīng)過(guò)活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過(guò)分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。 分離：需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開(kāi)，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶.（1）三氯均嗪法三氯均嗪環(huán)上的氯原子很活潑，容易產(chǎn)生親核取代反應(yīng)。當(dāng)環(huán)上的一個(gè)氯原子被取代后，能夠穩(wěn)定其他的碳-氯鍵（第一個(gè)氯原子在4就能反應(yīng)，第二個(gè)氯原子在25 反

13、應(yīng)，第三個(gè)氯原子在80反應(yīng)）。.（2）疊氮法 將PEG鏈端羥基轉(zhuǎn)化成疊氮基，然后與酶反應(yīng)。PEG甲氧甲酰甲酯制備：PEG與氯醋酸酐及重氮甲烷發(fā)生反應(yīng)生成PEG甲氧甲酰甲酯。PEG酰肼的制備：反應(yīng)產(chǎn)物與肼反應(yīng)生成相應(yīng)的酰肼化合物。PEG羧甲基疊氮化物制備：PEG酰肼化合物經(jīng)亞硝酸作用生成活化PEG。.（3）琥珀酸酐法二溴琥珀酸作為PEG的活化劑。PEG活化反應(yīng)修飾反應(yīng).（4）重氮法 將修飾劑上有關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橹氐鶊F(tuán)，然后在弱堿條件下與酶分子上的酚基、咪唑基等反應(yīng)，生成修飾酶。PEG活化反應(yīng)修飾反應(yīng).2、右旋糖酐及右旋糖酐酯 右旋糖酐屬于菌多糖，是由-葡萄糖通過(guò)-1,6糖苷鍵形成的高分子糖，具有較

14、好的水溶性和生物相容性，可用作代血漿。（1）溴化氫法（2）高碘酸氧化法.3、糖肽糖肽一般是通過(guò)纖維蛋白酶或蛋白水解酶降解人纖維蛋白或-球蛋白而得。糖肽結(jié)構(gòu)上有氨基，經(jīng)活化后能與酶分子上氨基反應(yīng)而產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合。（1）異氰酸法（2）戊二醛法.4、具有生物活性的大分子物質(zhì) 肝素是一種含硫酸酯的黏多糖，由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量2000左右。肝素共價(jià)交聯(lián)酶后可增加酶的穩(wěn)定性，同時(shí)由于肝素在生物體內(nèi)還具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性。羧二亞胺法溴化氫法三均嗪法.5、蛋白質(zhì)類及其他 血漿蛋白是血漿中的天然成分，它們和其他蛋白（包括酶類）的復(fù)合物在血液中可能被視為“自體蛋白”而被接受。.6、酶

15、的化學(xué)交聯(lián) 交聯(lián)劑是具有兩個(gè)反應(yīng)活性部位的雙功能基團(tuán)，可以在相隔較近的兩個(gè)氨基酸殘基之間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。同型雙功能試劑異性雙功能試劑可被光活化試劑.五、修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)1、熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性增加修飾劑與酶多點(diǎn)交聯(lián)，固定了酶的分子構(gòu)象，增強(qiáng)了酶的熱穩(wěn)定性。增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性減少了酶熱失活。 但PEG修飾后熱穩(wěn)定性沒(méi)有明顯提高，原因：PEG與酶是單點(diǎn)交聯(lián)，相對(duì)難以產(chǎn)生固定的酶分子結(jié)構(gòu)。 . 2、抗原性 部分可消除。比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。3、最適pH值 部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修

16、飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。 .4、酶學(xué)性質(zhì)的變化 絕大多數(shù)酶經(jīng)過(guò)修飾后，最大反應(yīng)速度沒(méi)有改變，但有些酶在修飾后，米氏常數(shù)會(huì)增大。5、對(duì)組織的分布能力變化 對(duì)組織的分布能力有所改變，能在血液中被靶器官選擇性地吸收。.第二節(jié) 酶的分子定向進(jìn)化 蛋白質(zhì)工程：利用基因工程手段對(duì)酶的蛋白質(zhì)分子改造，以期獲得性質(zhì)和功能更加完善的蛋白質(zhì)分子。酶分子的合理設(shè)計(jì)(rational design)：利用各種生物化學(xué)、晶體學(xué)、光譜學(xué)等方法對(duì)天然酶或其突變體進(jìn)行研究，從而獲得酶分子特征、空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系以及氨基酸殘基功能等方面的信息，以此為依據(jù)對(duì)酶分子進(jìn)行改造。如：化學(xué)突變、定

17、點(diǎn)突變等酶分子的非合理設(shè)計(jì)：不需要準(zhǔn)確的酶分子結(jié)構(gòu)信息而通過(guò)隨機(jī)突變、基因重組、定向篩選等方法進(jìn)行改造。如:定向進(jìn)化、雜合進(jìn)化。.定向進(jìn)化示意圖隨機(jī)突變+定向選擇目標(biāo)突變體細(xì)菌誘發(fā)突變的因素50 0C培養(yǎng)突變體庫(kù)選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長(zhǎng)溫度為370C最適生長(zhǎng)溫度提高了！.自然進(jìn)化是在整個(gè)有機(jī)體繁殖和存活的過(guò)程中自發(fā)出現(xiàn)的一個(gè)非常緩慢的過(guò)程。自然選擇使進(jìn)化向有利于生物適應(yīng)生存環(huán)境的方向發(fā)展。環(huán)境的多樣性和適應(yīng)方式的多樣性決定了進(jìn)化方向的多樣性。 我們可以在實(shí)驗(yàn)室中模仿自然進(jìn)化的關(guān)鍵步驟突變、重組和篩選,在較短時(shí)間內(nèi)完成漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化過(guò)程,有效地改造蛋白質(zhì),使之適于人類的需要。.酶

18、具有進(jìn)化潛力的原因：生物體環(huán)境與實(shí)際運(yùn)用環(huán)境不同希望具有更高的活性和穩(wěn)定性非生物體內(nèi)涉及的蛋白性質(zhì).PCR的基本原理DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍D

19、NA變性形成2條單鏈模板DNA95.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)9550引物1引物2DNA引物.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開(kāi)始.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaq.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束.PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)

20、增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) .二、 定向進(jìn)化的策略1、以易錯(cuò)PCR技術(shù)為代表的無(wú)性進(jìn)化 易錯(cuò)PCR(error pronePCR)是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配,導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變。然而,經(jīng)一次突變的基因很難獲得滿意的結(jié)果，由此發(fā)展出連續(xù)易錯(cuò)PCR策略。即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變,使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部，故屬于無(wú)性進(jìn)化。.化學(xué)誘變劑介導(dǎo)的隨機(jī)誘變 體外隨機(jī)誘變也可在65下直接用羥胺處理帶有目的基

21、因片段的質(zhì)粒，然后用限制性內(nèi)切酶切下突變了的基因片段，再克隆到表達(dá)載體中進(jìn)行功能的篩選。.由致突變菌株產(chǎn)生隨機(jī)突變 美國(guó)Strategen公司構(gòu)建了一株DNA修復(fù)途徑缺陷的大腸桿菌突變株XL1 RED,它體內(nèi)的DNA突變率比野生型高五千倍。將帶有要突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到XL1 RED菌株內(nèi)復(fù)制過(guò)夜,在此過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生隨機(jī)突變。每?jī)汕€(gè)堿基中通常約有一個(gè)堿基置換。將帶有突變過(guò)的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行篩選。.2、以DNA改組技術(shù)為代表的有性進(jìn)化（1） DNA改組 1994年, Stemmer等首先使用DNA改組完成體外重組。DNA改組是將一群密切相關(guān)的序列(如多種同源而有差異的基因或一組突變基

22、因文庫(kù))在DNaseI的作用下隨機(jī)酶切成小片段,這些小片段之間有部分的堿基序列重疊,它們通過(guò)自身引導(dǎo)PCR延伸,并重新組裝成全長(zhǎng)的基因,這一過(guò)程被稱為再組裝PCR。該過(guò)程所產(chǎn)生的相關(guān)序列間的交換歸因于模板的轉(zhuǎn)換。DNA改組過(guò)程中也可能引入新的點(diǎn)突變。因此,僅DNA改組就可以有效地從單一基因序列開(kāi)始進(jìn)行蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化。.DNA shuffling.體外定向進(jìn)化.改組具有以下有用的特征:它可以利用現(xiàn)存的有利突變,快速積累不同的有利突變。重組可伴隨點(diǎn)突變同時(shí)發(fā)生?？梢詣h除個(gè)體中的有害突變和中性突變。.（2）體外隨機(jī)引導(dǎo)重組1998年, Arnold提出了一種有效的新方法隨機(jī)引導(dǎo)重組(RPR)。 R

23、PR的原理是:用隨機(jī)序列的引物來(lái)產(chǎn)生互補(bǔ)于模板序列不同部分的大量的DNA小片段。由于堿基的錯(cuò)誤摻入和錯(cuò)誤引導(dǎo),這些DNA的小片段中也因之而含有少量的點(diǎn)突變。DNA小片段之間可以相互同源引導(dǎo)和重組。在DNA聚合酶作用下,經(jīng)反復(fù)的熱循環(huán)可重新組裝成全長(zhǎng)的基因,克隆到表達(dá)載體上,隨后篩選。 .與DNA改組相比，RPR技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):RPR可直接利用單鏈DNA或NA作模板，所需親代DNA比DNA改組所需的量少1020倍。 DNA改組利用DNaseI隨機(jī)切割雙鏈DNA模板,在DNA片段重新組裝成全長(zhǎng)序列之前, DNaseI必須去除干凈。一般說(shuō)來(lái),RPR技術(shù)使基因的重新組裝更容易。合成的隨機(jī)引物長(zhǎng)度一致

24、并缺乏序列的偏向性,保證了點(diǎn)突變和交換在全長(zhǎng)的后代基因中的隨機(jī)性。隨機(jī)引導(dǎo)的DNA合成不受DNA模板長(zhǎng)度的影響,這給小肽的改造提供了機(jī)會(huì)。.（3）交錯(cuò)延伸技術(shù) 1998年，Arnold等人又建立了一種新的體外重組方法交錯(cuò)延伸技術(shù):用PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)擬重組的模板序列時(shí),在熱循環(huán)中大大縮短退火與聚合酶催化延伸的時(shí)間。在每一循環(huán)中,不斷延長(zhǎng)的片段根據(jù)序列的互補(bǔ)性與不同模板退火,并進(jìn)一步延伸。反復(fù)重復(fù)直到全長(zhǎng)序列形成。由于模板的轉(zhuǎn)換,大多數(shù)多核苷酸含有不同親本的序列信息。該技術(shù)已成功地重組了由易錯(cuò)PCR產(chǎn)生的5個(gè)熱穩(wěn)定的枯草桿菌蛋白酶的突變體,得到了熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高的重組酶。.（4）SCRATCH

25、技術(shù)SCRATCH技術(shù)是將DNA改組技術(shù)與增加片段化雜合酶法（ITCHY）相結(jié)合的技術(shù)。Stefan等用E.coli的甘氨酰胺核苷酸甲醛轉(zhuǎn)移酶基因和人甘氨酰胺核苷酸甲醛轉(zhuǎn)移酶基因分別構(gòu)建pDIM GPX質(zhì)粒，接著采用能增加斷點(diǎn)的核苷酸類似物的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建其文庫(kù)，然后轉(zhuǎn)化到E.coli DH5進(jìn)行PCR擴(kuò)增和改組，再轉(zhuǎn)化到營(yíng)養(yǎng)缺陷型E.coli TX680F進(jìn)行活性雜合子篩選，并對(duì)其DNA序列進(jìn)行分析，主要特點(diǎn)：不依賴基因序列的同源性而產(chǎn)生多個(gè)DNA雜交位點(diǎn)。.（5）臨時(shí)模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng) RACHITT技術(shù)是與DNA shuffling概念上明顯不同的、改進(jìn)的基因家族重組技術(shù).它不包

26、括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯(cuò)延伸反應(yīng),而是將隨機(jī)切割的基因片段雜交到一個(gè)臨時(shí)DNA模板上進(jìn)行排序、修剪、空隙填補(bǔ)和連接.其中的懸垂切割步驟使短片段(比DNase消化片段還短)得以重組,明顯提高了重組頻率；如果在片段重組前后采用錯(cuò)誤傾向PCR還可引入額外點(diǎn)突變。. CoCo等首次報(bào)道此法改造二苯并噻吩單加氧酶,產(chǎn)生的嵌合文庫(kù)平均每個(gè)基因含14個(gè)交叉,重組水平比DNA shuffling類方法(14個(gè)交叉)高出幾倍；并且可在短至5bp的序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生交叉。這種高頻率、高密度的交叉水平是DNA shuffling所難以達(dá)到的。.（6）酵母增強(qiáng)組合文庫(kù) CLERY是一個(gè)真核基因家族shuffling策略.

27、其原理是將體外DNA shuffling程序與接下來(lái)的酵母體內(nèi)重組締合起來(lái),構(gòu)建高豐度低親本水平的重組文庫(kù):直接以含目的基因的質(zhì)粒作為體外shuffling的模板; shuffling后基因產(chǎn)物與線性化的酵母表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞啟動(dòng)體內(nèi)重組事件，同時(shí)表達(dá)功能性重組子直接用于篩選。.3、通過(guò)基因嵌合獲得改性的雜合酶 雜合酶是把來(lái)自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元（二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、功能域）或整個(gè)酶分子進(jìn)行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的優(yōu)化酶雜合體。.4、核苷酸類似物在分子定向進(jìn)化中的應(yīng)用 許多核苷酸類似物可與天然DNA/RNA中的相應(yīng)堿基配對(duì)，并且由于這種特有的性質(zhì)被稱為通用堿基。.漸增切割法產(chǎn)生雜

28、和酶Benkovic研究組建立了漸增切割法產(chǎn)生雜和酶(incremental truncation for the creation of hybrid enzymes)及Thio ITCHY (- 硫代磷酸核苷酸介導(dǎo)的ITCHY)方法來(lái)產(chǎn)生不依賴于序列同源性的重組文庫(kù)。 ITCHY 的基本原理是：控制核酸外切酶的切割速度不大于10堿基/min，然后間隔很短時(shí)間連續(xù)取樣終止反應(yīng),以獲得一組依次有一個(gè)堿基缺失的片段庫(kù)；然后將基因的一組隨機(jī)長(zhǎng)度的5端片段與基因的一組隨機(jī)長(zhǎng)度的3端片段隨機(jī)融合產(chǎn)生雜合基因文庫(kù)。 . 但由于該方案冗長(zhǎng)繁瑣，Lutz等又提出了Thio ITCHY方法：首先將待重組的兩基

29、因串聯(lián)在同一載體上,然后通過(guò)PCR反應(yīng)或單鏈模板引伸反應(yīng)將-硫代磷酸核苷酸隨機(jī)引入產(chǎn)物中,由于其抗核酸外切酶的切割,接下來(lái)的切割反應(yīng)會(huì)在此處隨機(jī)終止,連接切割產(chǎn)物即產(chǎn)生隨機(jī)交叉文庫(kù).該法操作便利,同時(shí)也可引入隨機(jī)點(diǎn)突變。此外， ITCHY /Thio ITCHY不依賴序列同源性,可在非序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生活性融合子，迭代ITCHY或?qū)ζ湮膸?kù)進(jìn)行shuffling還可以創(chuàng)造多個(gè)交叉。.三、基因文庫(kù)的構(gòu)建與篩選1、構(gòu)建理想的基因文庫(kù)要考慮的因素（1）基因文庫(kù)的質(zhì)量 具體反映在文庫(kù)的代表性和突變基因片段的序列的完整性。文庫(kù)的代表性：指文庫(kù)中包含的DNA分子是否能完整地反映出源基因的全部可能的變化和改變，

30、它是體現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)量的最重要指標(biāo)。突變基因片段的序列完整性 （2）文庫(kù)篩選可選擇的方法.2、突變體基因的構(gòu)建策略（1）DNA隨機(jī)酶切片段拼接（2）單鏈DNA隨機(jī)拼接（3）限制性酶切片段隨機(jī)拼接.(1) DNA隨機(jī)酶切片段連接 將兩個(gè)高度同源的基因經(jīng)DNAase I 酶隨機(jī)剪切得到大量的酶切片段，接著采取“無(wú)引物”P(pán)CR擴(kuò)增法將同源片段隨機(jī)重組，然后通過(guò)特異性引物PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。重組-擴(kuò)增-篩選.（2）單鏈DNA隨機(jī)拼接 單鏈DNA為模板鏈，以此制備片斷化得DNA片段，然后進(jìn)行同源片段隨機(jī)拼接重組。.（3）限制性酶切片段隨機(jī)拼接 采用特定的限制性酶切片段對(duì)DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生的都是特異的限制性酶

31、切片段，不存在親代基因自身同源酶切片段隨機(jī)拼接現(xiàn)象。.3、構(gòu)建突變基因文庫(kù)的載體系統(tǒng)噬菌體載體系統(tǒng)：片段裝載量大，適合長(zhǎng)期保存，篩選方法有限。質(zhì)粒載體系統(tǒng)：適合大部分基因突變，可進(jìn)行功能性篩選，但容量小，轉(zhuǎn)化效率偏低。.4、文庫(kù)的篩選 建立有效的搜索蛋白質(zhì)文庫(kù)的方法是影響定向進(jìn)化成功與否的關(guān)鍵。 突變體基因文庫(kù)中包含性能改進(jìn)的酶基因，必須構(gòu)建大容量，多樣化的至少106以上庫(kù)容量的突變文庫(kù)。 當(dāng)突變體酶可賦予宿主細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的優(yōu)勢(shì)時(shí),很容易搜尋含有106以上個(gè)蛋白質(zhì)突變體的文庫(kù)。然而,這類情況并不多見(jiàn)。當(dāng)感興趣的功能可產(chǎn)生可見(jiàn)的信號(hào)時(shí),簡(jiǎn)單的肉眼可見(jiàn)的篩選方法被廣泛地應(yīng)用。例如,菌落分泌出有活

32、性的蛋白酶可在含有酪蛋白的瓊脂平板上產(chǎn)生清晰的水解圈,其大小與水解活性成正比。 . 另外,易被觀察的菌落表型也可用于快速篩選。盡管根據(jù)顏色或水解圈形成的篩選方法快速高效,但也有明顯的局限性。它是非定量的,而且經(jīng)常對(duì)性狀的微小變化不靈敏。高通量96 孔板適合自動(dòng)定量篩選,能鑒定出酶對(duì)底物的特異性、熱穩(wěn)定性、對(duì)映體選擇性及其他特定性狀等。.（1）篩選與優(yōu)選策略screeningSelection：典型的策略是構(gòu)建代謝缺失型的宿主菌株.（2）基于表型觀察的篩選 目前，陽(yáng)性克隆的篩選一般都依賴于克隆的表型（營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗生素抗性）篩選，這是一種定性的篩選方法，而DNA隨機(jī)拼接需要在突變體基因文庫(kù)中篩選

33、出性狀更優(yōu)的突變酶，因此很多情況下實(shí)際上是一種定量的篩選過(guò)程，需要將基因表達(dá)產(chǎn)物的活性和轉(zhuǎn)化子的表型定量聯(lián)系起來(lái)。.（3） 基于基因編碼蛋白質(zhì)的檢測(cè)篩選噬菌體表面展示技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng).噬菌體表面展示技術(shù) 噬菌體表面展示技術(shù)：是將外源蛋白質(zhì)或多肽的基因表達(dá)產(chǎn)物與噬菌體衣殼蛋白融合,并在其表面展示,同時(shí)將其遺傳密碼信息整合到個(gè)體噬菌體的基因組中。這個(gè)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是直接將可現(xiàn)的表達(dá)型與其基因型聯(lián)系在一起,再利用其配體的特異性親和力,將所感興趣的蛋白質(zhì)或多肽挑選出來(lái)。.優(yōu)點(diǎn)特異、有效地從龐大的重組噬菌體群體中富集到極稀少的表面展示蛋白與配基結(jié)合的重組噬菌體克隆。篩選時(shí)，獲得編碼這一表

34、型的目的基因?？伤苄浴?酵母雙雜交系統(tǒng) 將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因），若X和Y沒(méi)有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。 .酵母雙雜交模型DNA-BindingDomainBait ProteinPrey ProteinTranscriptionActivat

35、ingRegionReporter GeneDNA-Binding Site.模型.文庫(kù)篩選的步驟將待測(cè)基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結(jié)合域融合構(gòu)建誘餌質(zhì)粒將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報(bào)告基因啟動(dòng)子的酵母細(xì)胞株中，選擇被轉(zhuǎn)化的酵母再將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中通過(guò)報(bào)告基因的功能篩選相互作用的蛋白. 酵母單雜交系統(tǒng)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由一個(gè)DNA特異性結(jié)合功能域和一個(gè)或多個(gè)其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域組成。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域

36、可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過(guò)程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為文庫(kù)蛋白編碼基因，只要其表達(dá)的蛋白能與目的基因相互作用，同樣可通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，啟動(dòng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。 .酵母單雜交的基本操作過(guò)程 (1)設(shè)計(jì)含目的基因(稱為誘餌)和下游報(bào)告基因的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。 (2)將文庫(kù)蛋白的編碼基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人同一酵母中。(3)若文庫(kù)蛋白與目的基因相互作用，可通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)將文庫(kù)蛋白的編碼基因篩選出來(lái)。在這里作為誘餌的目的基因就是啟動(dòng)子DNA片段，文庫(kù)基因所編碼的蛋白就是啟動(dòng)子基因結(jié)合蛋白。.（4）高通量篩選技術(shù) 核糖體展示技術(shù)與mRNA篩選技術(shù)同屬于體外篩選技術(shù)。.包括:模板的構(gòu)建、體外轉(zhuǎn)錄和翻譯親和篩選.步驟 運(yùn)用PCR技術(shù)構(gòu)建核糖體展示文庫(kù)：選擇無(wú)細(xì)胞系系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯,因?yàn)閙RNA末端缺少終止密碼子,核糖體停留在mRNA的末端而形成ARM復(fù)合體通過(guò)特異性抗原或者標(biāo)簽的特異性結(jié)合進(jìn)行篩選,篩選出與其有強(qiáng)特異性的mRNA將所篩選