1、項目類別 申報學(xué)科代碼 1科學(xué)部編號 CC03030310 國家自然科學(xué)基金 申 請 書 項目名稱： MSC 對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的試驗爭論 申 請 者： 所在單位： 郵政編碼： xxx 410 xxx 通訊地址： 重慶市 xx 電 話： xxx 傳 真： 申請日期： 2022 年 12 月 國 家 自 然 科 學(xué) 基 金 委 員 會 一九九七年制 第 1 頁,共 23 頁填 報 說 明 一,填寫申請書前,請先查閱國家自然科學(xué)基金有關(guān)項目申請辦 法及規(guī)定；申請書各項內(nèi)容,要實事求是,逐條認(rèn)真填寫；表達(dá)要明 確,嚴(yán)謹(jǐn),字跡要清晰易辨；外來語要同時用原文和中文表達(dá)；第一 次顯現(xiàn)的縮寫詞

2、,須注出全稱； 二,申請書為十六開本, 復(fù)印時用 B5 復(fù)印紙, 于左側(cè)裝訂成冊； 第三頁起各欄空格不夠時, 請自行加頁；一式六份（至少一份為原件） , 由所在單位審查簽署看法后, 按申報學(xué)科投送國家自然科學(xué)基金委員 會對口科學(xué)部；地區(qū)科學(xué)基金項目,申請書另報送?。ㄗ灾螀^(qū)）科委 一份原件； 三,封面右上角“科學(xué)部編號”由對口科學(xué)部填寫,項目類別和 申報學(xué)科代碼 1 由申請者填寫； 四,以下人員不得作為申請項目的負(fù)責(zé)人提出申請,但可作為項 目組成員參加爭論： 在讀（含在職）爭論生 已離退休的科研人員 申請單位的兼職科研人員 五,申請者和項目組中具有高級 專業(yè)技術(shù)職務(wù)的主要成員申請 （含參加）的項

3、目數(shù),連同在研的國家自然科學(xué)基金項目數(shù)（不含重 點項目,重大項目） ,不得超過兩項； 六,同一項目組爭論內(nèi)容相 近的項目,只答應(yīng)報送一個學(xué)科； 七,申請者可因同類項目競 爭等緣由,提出不宜評議本項目的專 家名單（姓名與單位, 3 人以內(nèi)）,密封于信封中,釘在申請書原件封 面,或另專函相關(guān)學(xué)科,供科學(xué)部選擇同行評議人時參考；科學(xué)部將 對此信息保密； 八,國家自然科學(xué)基金委員會通訊地址：北京市海淀區(qū)花園北路 35 號東門 郵政編碼： xxx 第 2 頁,共 23 頁一,簡表 1 研 摘 通 過 MS C體 外 培 養(yǎng) , 轉(zhuǎn) 化 為 神 經(jīng) 干 細(xì) 胞 , 進(jìn) 而 基 因 轉(zhuǎn) 染 , 體 內(nèi) 移

4、植 , 誘 導(dǎo) 分 化 等 方 法 探 索 對 先 天 性 巨 結(jié) 腸 癥 動 物 無 神 經(jīng) 節(jié) 細(xì) 胞 段 進(jìn) 行 神 經(jīng) 支 配 重 建 的 途 徑 和 效 果 ； 本 研 究 的 完 成 將 采 究 要 用 細(xì) 胞 工 程 原 理 和 方 法 代 手 術(shù) 方 法 從 根 本 替 , 內(nèi) 容 上 改 進(jìn) 先 天 性 巨 結(jié) 腸 癥 的 治 療 及 預(yù) 后 , 豐 富 臨 床 神 經(jīng) 生 物 學(xué) 的 發(fā) 展 ； 和 意 義 主題詞 1. 主題詞數(shù)量不多于三個； 2. 主題詞之間空一格（英文用 /分隔）； 中文 MS C神 經(jīng) 干 細(xì) 胞 先 天 性 巨 結(jié) 腸 癥 英文 mesenchym

5、al stem cell / neuronal stem cell / aganglionic bowel 簡 表 填 寫 要 求 一,簡表內(nèi)容將輸入運算機(jī),必需逐項認(rèn)真填寫,接受國家公布的標(biāo)準(zhǔn)簡化漢字；簡表中全部代碼以最新 發(fā)布的國家自然科學(xué)基金申請項目分類目錄及代碼為準(zhǔn)填寫；高技術(shù)探究課題主題號按高技術(shù) 新概念新構(gòu)思探究課題項目指南中主題號填寫,申請其重點項目時項目類別也填寫 B,并在申請書 封面右上角加注“高技術(shù)探究課題重點項目” ； 二,凡選擇性欄目,將相應(yīng)提示符 A ,B 等之一填入該欄的右下角； 三,部分欄目填寫要求： 項目名稱 應(yīng)精確反映爭論內(nèi)容和范疇,最多不超過 25 個漢字

6、包括標(biāo)點符號） ； 基礎(chǔ)爭論 指以熟識自然現(xiàn)象,探究自然規(guī)律為目的,不直接考慮應(yīng)用目標(biāo)的爭論活動； 應(yīng)用基礎(chǔ)爭論 指有廣泛應(yīng)用前景,但以獵取新原理,新技術(shù),新方法為主要目的的爭論； 申報學(xué)科 申請項目所屬的最基礎(chǔ)學(xué)科；如涉及多學(xué)科可填寫兩個,先填為主學(xué)科； 申請金額 以萬元為單位,用阿拉伯?dāng)?shù)字表示,留意小數(shù)點； 起止年月 起始時間從申請的次年 1 月算起；終止時間為完成年度的 12 月； 所用試驗室 系指爭論項目將利用的試驗室,僅填寫國家計委批準(zhǔn)的國家重點試驗室或部門批準(zhǔn)的 開放試驗室； 所在單位名稱及代碼 按單位公章填寫全稱；例如“中國科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械爭論所”不得填 “中科院西安光機(jī)所

7、” 或“西安光機(jī)所” ；全稱中的數(shù)字, 一律寫中文, 例如： 中國航天工業(yè)總公司第七一所；首次申請國家自然科學(xué)基金的單位,尚未 編入單位代碼,其代碼暫不填寫； 參加單位數(shù) 指爭論項目組主要成員所在單位數(shù), 包括主持單位和合作單位 合作者所在單位 ,以阿 拉伯?dāng)?shù)字表示； 項目組主要成員 指在項目組內(nèi)對學(xué)術(shù)思想,技術(shù)路線的制訂與理論分析及對項目的完成起重要作 用的人員,本人應(yīng)在申請書上親自簽名；本欄雙線右側(cè)內(nèi)容不輸入運算機(jī)； 爭論內(nèi)容和意義 摘要與主題詞均錄入軟盤； 第 3 頁,共 23 頁 2 第 4 頁,共 23 頁二,立論依據(jù) （包括項目的爭論意義,國內(nèi)外爭論現(xiàn)狀分析,并附主要參考文獻(xiàn)及出處

8、） 對基礎(chǔ)爭論,著重結(jié)合國際科學(xué)進(jìn)展趨勢,論述項目的科學(xué)意義； 對應(yīng)用基礎(chǔ)爭論, 著重結(jié)合學(xué)科前沿,圍繞國民經(jīng)濟(jì)和社會進(jìn)展中的重要科技問題, 論 述其應(yīng)用前景； 先天性巨結(jié)腸癥 （ Hirschsprungs disea,seHD）是小兒外科領(lǐng)域內(nèi)的一種常見性疾病, 發(fā)病率為 1/20221/5000 ；對 HD 臨床及基礎(chǔ)爭論始終是小兒外科爭論的熱點之一； 此疾病 的發(fā)生是由于多種緣由使胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞在消化道移行受阻,結(jié)腸壁肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺 如,病變結(jié)腸痙攣收縮,腸內(nèi)容物排出受阻,近端腸管繼發(fā)性擴(kuò)張形成巨結(jié)腸,影響兒童 健康成長； 自發(fā)覺 HD 的病因以來, HD 的治療主要依靠手術(shù)切除遠(yuǎn)

9、端無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段, 術(shù)方式較多, 由于各種術(shù)式固有缺陷, 目前仍存在各種并發(fā)癥, 影響 HD 患兒術(shù)后復(fù)原 手 ； 尋求更為有效及安全的針對 HD 的治療方法,始終是國內(nèi)外小兒外科工作者努力的方向； 在臨床及科研工作中我們留意到細(xì)胞療法（ cell therapy ）近年來已成為治療多種疾病 的新策略,在替代,修復(fù)或加強(qiáng)受損的組織或器官的生物學(xué)功能方面有巨大作用；細(xì)胞療 法中應(yīng)用的靶細(xì)胞之一,神經(jīng)干細(xì)胞,目前已成為爭論熱點；傳統(tǒng)的發(fā)生生物學(xué)認(rèn)為人體 神經(jīng)細(xì)胞一經(jīng)受損就永久不能再生新的神經(jīng)元；然而隨著神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)覺,受損神經(jīng)細(xì) 胞不能復(fù)原的觀點正在發(fā)生變化；神經(jīng)干細(xì)胞是一種終身具有自我更新才能

10、的細(xì)胞,其子 細(xì)胞能分化產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的各類細(xì)胞,干細(xì)胞通過不對稱分裂產(chǎn)生一個祖細(xì)胞和另一個干 細(xì)胞,祖細(xì)胞具有有限的自我更新才能,并自發(fā)分化產(chǎn)生成神經(jīng)元細(xì)胞和成膠質(zhì)細(xì)胞等, 從而生成神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；已有爭論說明神經(jīng)干細(xì)胞具有潛在多向分化才能,能在 確定條件下定向分化,具有較強(qiáng)的增殖才能,移植入成體神經(jīng)組織后易于存活,目前神經(jīng) 干細(xì)胞在損耗神經(jīng)組織,細(xì)胞的修復(fù)方面已顯示出良好的應(yīng)用前景 2 ； HD 病由于胚胎早期神經(jīng)嵴細(xì)胞移行受阻的結(jié)果, 以往我們對 HD 的爭論中也發(fā)覺 HD 病變腸段不僅存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞反常, 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也表現(xiàn)出反常, 進(jìn)一步支持了 HD 病因 系胚胎早期神經(jīng)嵴細(xì)胞移

11、行反常的結(jié)果； 對于這種病變腸段無神經(jīng)節(jié)的反常神經(jīng)支配可否 通過神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植修復(fù)呢？ 結(jié)論是確定的, Natarajan 等在體外試驗中觀看到正 常鼠的神經(jīng)嵴細(xì)胞可在體外修復(fù)培養(yǎng)中的 RET.K 突變鼠 一種 HD 動物模型 病變腸段神經(jīng) 支配,且前瞻性地指出了神經(jīng)嵴細(xì)胞移植可能成為今后先天性巨結(jié)腸癥的治療手段 3 ； 目前的問題是在臨床實踐中診斷的 HD 患兒均在產(chǎn)生后,此刻神經(jīng)嵴細(xì)胞分化成熟, 3-1 第 5 頁,共 23 頁且此類患兒病變腸段不僅有神經(jīng)節(jié)反常,尚有腸道平滑肌,結(jié)締組織的增生等細(xì)胞外基 質(zhì)變化,單純的神經(jīng)嵴細(xì)胞移植一方面神經(jīng)嵴細(xì)胞來源受限,另一方面能否在體內(nèi)改造 病變

12、腸段的病理變化,仍需進(jìn)一步爭論 ； 近年來干細(xì)胞的基因修飾治療進(jìn)展較快, 國外有人發(fā)覺將表達(dá)神經(jīng)養(yǎng)分因子的神經(jīng) 干細(xì)胞直接種植于受傷的腦組織中,能促進(jìn)神經(jīng)功能的復(fù)原；神經(jīng)干細(xì)胞在受到堿性成 纖維細(xì)胞因子（ FGF-2）和上皮細(xì)胞生長因子（ EGF）刺激時可分化出神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞, EGF 可保護(hù)神經(jīng)干細(xì)胞的生 成, FGF-2 對干細(xì)胞的分化起重要作用；有很多神經(jīng)因子（如 血小板生長因子,轉(zhuǎn)化生長因子等）對神經(jīng)干細(xì)胞的分化起著協(xié)同作用；誘導(dǎo)分化劑維 3 甲酸對神經(jīng)干細(xì)胞也有誘導(dǎo)分化作用 ；對于 HD 病變腸段不僅有神經(jīng)節(jié)反常,尚有腸道 平滑肌,結(jié)締組織的增生等變化的現(xiàn)象,我們留意到纖溶酶原激活

13、因子（ PA）能激活纖 溶酶原,水解纖維蛋白, 及細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白 fibronectin, Fn ,層粘連蛋白 （ laminin , Ln ）,基質(zhì)金屬蛋白酶（ matrix metalloproteinase enzyme, MMP ）能分解四周組織細(xì)胞外 基質(zhì),如將 PA, MMP 的 cDNA 轉(zhuǎn)染修飾神經(jīng)干細(xì)胞將有可能對 HD 病變段的病理變化 進(jìn)行改造,有利于神經(jīng)干細(xì)胞生長,發(fā)育；通過探究影響神經(jīng)干細(xì)胞移植,生長,分化 的分子機(jī)制,結(jié)合基因工程技術(shù),將可為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療成功制造條件； 鑒于神經(jīng)干細(xì)胞的多向分化潛能, 在大腦, 脊髓中的損耗修復(fù)爭論中令人鼓勵的發(fā) 現(xiàn),自體

14、造血干細(xì)胞等分化為神經(jīng)干細(xì)胞可能性的提出 4 （此將為神經(jīng)干細(xì)胞自體移植 供應(yīng)一個很好的來源） ,以及神經(jīng)干細(xì)胞目前被認(rèn)為是一種更優(yōu)于成纖維細(xì)胞的基因治療 的載體細(xì)胞 5 ,針對上面的問題我們提出如下 假說 ：如同神經(jīng)干細(xì)胞移植在復(fù)原受損大腦, 脊髓神經(jīng)功能上具有良好的應(yīng)用前景一樣,通過各種人工方法修飾后,神經(jīng)干細(xì)胞移植 有復(fù)原 HD 病變腸段的正常神經(jīng)支配的可能； 細(xì)胞移植雖然已被認(rèn)為對于修復(fù)神經(jīng)組織是有效的治療方法,但目前使用的細(xì)胞 多取自胚胎,這樣一方面細(xì)胞來源有限,另一方面存在異體免疫排斥作用；神經(jīng)干細(xì)胞 可以在體外大量增殖,但目前主要在海馬和室管膜下層發(fā)覺有神經(jīng)干細(xì)胞分布,這樣造 成

15、了神經(jīng)干細(xì)胞來源困難；骨髓中有兩類干細(xì)胞,即造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞 （ mesenchymal stem cell, MSC ）；前者的移植已成功用于臨床治療白血病,但其移植需 要獲得足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞, 并且造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增存在困難； MSC 易于從骨髓中分 3-2 第 6 頁,共 23 頁離,體外擴(kuò)增簡潔,長期培養(yǎng)過程中能保持多向分化潛能；近期美國學(xué)者 Woodbury 等在 體外試驗中成功地將源于成年大鼠及人骨髓 MSC 轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì) , 并進(jìn)而分化為神經(jīng) 胞 6 元 ；此爭論結(jié)果很好地解決了神經(jīng)干細(xì)胞來源困難的問題, 為今后神經(jīng)干細(xì)移植治療多 種神經(jīng)系統(tǒng)疾病打下了基礎(chǔ)； 總之,

16、隨著當(dāng)今干細(xì)胞爭論的深化,探究通過 MSC 轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞復(fù)原小兒外 科常見疾?。ㄏ忍煨跃藿Y(jié)腸癥）正常神經(jīng)支配的方法具有重要現(xiàn)實性及可能性； 美國 . 時代 . 周刊曾將人類胚胎干細(xì)胞（ ES 細(xì)胞）和胚胎生殖細(xì)胞（ EG 細(xì)胞）建系 爭論成功列為 20 世紀(jì)末世界十大科技成就之首, 并認(rèn)為 ES 細(xì)胞和人類基因組將同時成 為新世紀(jì)最具進(jìn)展和應(yīng)用前景的領(lǐng)域；由此激發(fā)了人們對 ES 細(xì)胞,骨髓干細(xì)胞,神經(jīng) 干細(xì)胞定向分化的爭論；將 MSC, 神經(jīng)干細(xì)胞定向分化,移植的爭論引入到 HD 這一小兒 外科常見病的治療爭論中,探究 MSC,神經(jīng)干細(xì)胞克隆,定向分化,移植對于 HD 治療 方法,可為發(fā)育

17、生物學(xué)積存寶貴的資料；接受細(xì)胞工程原理和方法,通過 MSC,神經(jīng)干 細(xì)胞移植重建 HD 病變段的正常神經(jīng)支配方法的爭論成功,在臨床上將可以讓 HD 患兒 免于手術(shù),使 HD 的治療發(fā)生根本性的改觀；該課題的完成除能為兒童的健康成長做出 巨大貢獻(xiàn),并能帶動本地區(qū)整個小兒外科水平的進(jìn)展,提高本地區(qū)小兒外科在國內(nèi)及國 際上的位置,為祖國西部大開發(fā)戰(zhàn)略的順當(dāng)進(jìn)行貢獻(xiàn)力氣； 參考文獻(xiàn) 1 陳雷玲,胡廷澤,朗詩明,等； 320 例先天性巨結(jié)腸癥的診斷與治療分析；華西醫(yī) 科高校學(xué)報, 2022, 312 ： 274-27 2 Kathryn S. Embryonic stem cells used to r

18、emyelinate injured rat spinal cord neurons. Lancet, 2022, 355 9218: 1890 3 McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation 233-249 factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2022, 113: 4 Natarajan D, Grigoriou M, Marcos-Gutierrez CV, e

19、t al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Development, 1999,126:157-168 5 劉平, 盧亦成, 朱誠； 中樞神經(jīng)干細(xì)胞； 中華神經(jīng)外科雜志； 2022,16（ 3）：196-1986 Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Ault rat and human bone marrow stromal cel

20、ls differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2022, 614: 364-370 第 7 頁,共 23 頁3-3 三,爭論方案 1. 爭論目標(biāo),爭論內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題 爭論目標(biāo)： 探究建立針對先天性巨結(jié)腸癥的 爭論內(nèi)容： MSC 的分別,體外克??； MSC ,神經(jīng)干細(xì)胞移植治療方法； MSC 向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化； 多種人工修飾條件下的神經(jīng)干細(xì)胞在 經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段移植,定向分化； HD 動物模型 （ lethal spotted rat, ls/ls ）無神 鑒定神經(jīng)干細(xì)胞移植后 HD 動物模型的消化道神經(jīng)系統(tǒng)外形及機(jī)能； 擬解決的關(guān)鍵問題：

21、MSC 向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化； 神經(jīng)干細(xì)胞的基因修飾； 神經(jīng)干細(xì)胞移植,定向分化的分子機(jī)制； 4 第 8 頁,共 23 頁2. 擬實行的爭論方法,技術(shù)路線,試驗方案及可行性分析 爭論方法： 無血清培養(yǎng),單細(xì)胞克隆技術(shù)； mRNA 差異消減顯示技術(shù)； 原位雜交； RT-PCR,免疫組化技術(shù),透射電鏡技術(shù)； 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)； 技術(shù)路線： 建立 HD 動物模型 MSC 的分別及體外培養(yǎng) MSC 向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng),克?。?V-MYC , EGF 等多種基因轉(zhuǎn)染,修飾） 神經(jīng)干細(xì)胞移植到 HD 動物無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段 誘導(dǎo)分化（維甲酸等） mRNA 差異消減顯示技術(shù)顯示神經(jīng)干細(xì)胞移植分化的

22、分子機(jī)制 觀看無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)外形及功能 獲得通過 MSC ,神經(jīng)干細(xì)胞移植對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的方法第 9 頁,共 23 頁5-1 試驗方案： 第一部分：建立 HD 動物大鼠 參照文獻(xiàn)進(jìn)行大鼠選育, 腸造瘺處理； 源于 Wistar-Imamichi AR 系,HD 大鼠均結(jié) 其次部分： MSC 分別培養(yǎng),向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化 1. MSC 分別培養(yǎng) 切取鼠一側(cè)股骨, 暴露骨髓腔, 用注射器抽取細(xì)胞培 養(yǎng)液（ DMEM/20 FBS）,反復(fù)多次沖洗出骨髓細(xì)胞,用吸管反復(fù)抽吸 后, Ficoll 分別液離心分別出有核細(xì)細(xì)胞,移入 T-75 培養(yǎng)瓶,過夜培 養(yǎng),其次日將懸浮細(xì)胞移

23、去（貼壁細(xì)胞為較純的基質(zhì)干細(xì)胞） , 3-4 天 更換培養(yǎng)液,當(dāng)細(xì)胞融合時用胰島素 /EDTA （trypsin/EDTA ）處理,收 獲貼壁細(xì)胞為 MSC MSC 鑒定選用 CD29 , CD90 ,CD106 等標(biāo)記 ； 2. MSC 向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)在 MSC 培養(yǎng)液中加入脊索中胚層 浸出液, 脊索中胚層條件培養(yǎng)液, 因子等； 星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液, 多種神經(jīng)生長 3. 鑒定 A. 光鏡及電鏡下觀看轉(zhuǎn)化細(xì)胞外形轉(zhuǎn)變； : nestin, B. 免疫組化或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的表面標(biāo)志 波形蛋白, RC 抗原； 第三部分：神經(jīng)干細(xì)胞分別提取,體外培養(yǎng),基因轉(zhuǎn)染 1. 神經(jīng)干細(xì)胞

24、的分別和傳代 分別取鼠紋狀體和孕鼠皮層組織, 吸管吹 打機(jī)械分別制成單細(xì)胞懸液,利用 DMEM/F121:1 加 B27 及 bFGF 無 血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng),詳細(xì)參見文獻(xiàn)； 2. 體外基因轉(zhuǎn)染 因轉(zhuǎn)染技術(shù),將 對于以上兩種來源的神經(jīng)干細(xì)胞接受脂質(zhì)體介導(dǎo)基 V-MYC ,EGF ,及 FGF-2 , PA, MMP cDNA 重組逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞,包括雙基因及單基因轉(zhuǎn)染的多種形式； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCXE 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子生物學(xué)國家重點試驗 室供應(yīng)； E. coli 質(zhì)粒 DNA 大量制備,純化和酶切參照 Sambrook 等的 文獻(xiàn)方法進(jìn)行；按 Lipofecta

25、mine TM 試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗； 5-2 第 10 頁,共 23 頁第四部分：神經(jīng)干細(xì)胞在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的移植,定向分化及檢測 1. 神經(jīng)干細(xì)胞在 HD 動物模型體內(nèi)移植 按多種組合形式, 利用毛細(xì) 顯微注射器將經(jīng)多種形式基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞注射到 HD 無神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞段；參考文獻(xiàn)報道進(jìn)行,將注射細(xì)胞濃度定為 ； 2. 移植后的神經(jīng)干細(xì)胞在 HD 動物體內(nèi)的分化誘導(dǎo) 維甲酸等分化誘導(dǎo) 劑處理,藥物濃度選擇參考文獻(xiàn)； 3. 移植后的神經(jīng)干細(xì)胞對 HD 動物模型無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)的影 響檢測 A 試驗動物的處理：將試驗組鼠（包括對比組）分別于不同時期斷頸 處死,如移植后 4 周, 1

26、6 周, 32 周；取移植處腸組織進(jìn)行檢測, 分別按進(jìn)行檢測的項目要求對樣本進(jìn)行處理； 光鏡及電鏡檢測移植處組織外形學(xué)變化； 免疫組化技術(shù)：檢測神經(jīng)細(xì)胞特異性烯醇化酶（ NSE）, -100, GAFP 等表達(dá)； 原位雜交, RT-PCR 檢測：轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)（ V-MYC ,EGF 等）, 原位雜交所需探針, RT-PCR 引物可分別購自中山, GIBIC 公司, 按說明進(jìn)行試驗操作； 功能鑒定：直腸測壓技術(shù),生物化學(xué)方法檢測 r-氨基丁酸, P 物質(zhì) 等的合成； 4. 神經(jīng)干細(xì)胞移植, 分化的分子機(jī)制 參照文獻(xiàn)利用 mRNA 差異消減 顯示技術(shù)顯示以上多種形式神經(jīng)干細(xì)胞移植, 分化的差異基

27、因, 進(jìn)而進(jìn) 行分級分段克??； A. 神經(jīng)干細(xì)胞移植處腸段及相同部位正常腸神經(jīng)組織 RNA 的純化： 利用腸道組織的剝片技術(shù)獵取腸神經(jīng)組織,馬上置放于液氮中, -70 儲存；氯仿法提取 測定； RNA ,DNase I 處理,紫外分光度計定量 B. RT-PCR 差異消減顯示： 對分別將神經(jīng)干細(xì)胞移植處腸段及相同部 位正常腸神經(jīng)組織分別擴(kuò)增出 , , cDNA ,運用 5 端帽子引物與 3 端 錨定引物,對 cDNA 進(jìn)行大量擴(kuò)增,正常腸神經(jīng)組織用生物素標(biāo) 記的 dATP 和 dNTPs 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增, 產(chǎn)物進(jìn)行消減雜交, 用連親 5-3 第 11 頁,共 23 頁和素去除共有產(chǎn)物, 剩

28、下的產(chǎn)物由帶有 -32 PdATP 的 dNTPs 進(jìn) 行 PCR,在重復(fù)差異顯示,回收差異條帶并克隆； （0.4ul RNA , ； 1 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液, 15umol/L dNTP, 10umol/L 簡并引物, 65 C ； ； 5min ,37 C 溫育 10min ,加 200U/ulMoMuLV 反轉(zhuǎn)錄酶, 37 C 溫 ； 育 50min ,95 C 溫育 5min,PCR,消減雜交,過柱子, PCR,消 減雜交, TA 克隆盒進(jìn)行 DNA 克隆,按說明進(jìn)行,及進(jìn)行測序, 基因鑒定等） ； 5. 結(jié)合步驟 3 的檢測結(jié)果再進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染 同第三部份的 體外基因轉(zhuǎn)染； 6.

29、 獲得神經(jīng)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染, 移植, 分化, 重建 HD 正常神經(jīng)支配的方案 重復(fù)步驟 1； 2； 3；4,反復(fù)調(diào)整； 第五部分：統(tǒng)計分析 各試驗組間的數(shù)據(jù)以 均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示,用 F 檢驗, t 檢驗,多因素方 差分析進(jìn)行多組及組間統(tǒng)計學(xué)處理, 可行性分析： P 值小于 為差異顯著； 1 MSC 分別,體外培養(yǎng),本課題組已經(jīng)完成； 2 本課題組已前期進(jìn)行了 MSC 轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的試驗, 同時成功進(jìn)行了體內(nèi) 神經(jīng)干細(xì)胞的分別并獲得了國家自然科學(xué)基金支助（編號 30070382）； 3 神經(jīng)干細(xì)胞移植為當(dāng)今各國神經(jīng)細(xì)胞工程爭論重點,大量的爭論文獻(xiàn)報道了 神經(jīng)干細(xì)胞分別,培養(yǎng)的方法； 4 較其它

30、一些干細(xì)胞爭論不同,神經(jīng)干細(xì)胞有明確的免疫標(biāo)記； 5 在臨床及爭論中對大量先天性巨結(jié)腸癥進(jìn)行了觀看,有多篇相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表； 6 課題組已成功進(jìn)行了神經(jīng)干細(xì)胞的分別培養(yǎng)與鑒定, 及成人骨髓 MSC 體外擴(kuò) 增和定向誘導(dǎo)分化為骨和軟骨細(xì)胞； 第 12 頁,共 23 頁5-4 3本項目的創(chuàng)新之處 （ 1） 以往對神經(jīng)干細(xì)胞移植的爭論主要局于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓損耗修復(fù)方 面,雖然有類似于神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)嵴細(xì)胞修復(fù)腸神經(jīng)節(jié)缺如的文章報道, 但神經(jīng)干細(xì)胞移植修復(fù)腸神經(jīng)節(jié)缺如尚未見報道； （ 2） 首次提出 MSC 轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞后, 移植分化修復(fù) HD 正常神經(jīng)支配可能； 4. 年度爭論方案及推測進(jìn)展 （

31、 1） 2022 年 1 月 2022 年 12 月 MSC 分別,體外培養(yǎng),及向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn) 構(gòu)建 HD 動物模型及初步完成 化； （ 2） 2022 年 1 月 2022 年 12 月 HD 動物模型的無神經(jīng)節(jié) 完成神經(jīng)干細(xì)胞的各種基因轉(zhuǎn)染試驗,初步完成 細(xì)胞段的神經(jīng)干細(xì)胞注射及檢測； （ 3） 2022 年 1 月2022 年 6 月 進(jìn)一步完成 HD 動物模型的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的神經(jīng)干細(xì)胞注射及檢測,獲 （ 4） 得 MSC 轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞后移植分化重建 HD 正常神經(jīng)支配的方法； 2022 年 6 月2022 年 12 月 數(shù)據(jù)處理,完成論文； 5. 預(yù)期爭論成果 以論文發(fā)表作為爭論

32、成果； 第 13 頁,共 23 頁 6 四,爭論基礎(chǔ) 1. 與本項目有關(guān)的爭論工作積存和已取得的爭論工作成果 （ 1） 本 項目的提出源于課題組對先天性巨結(jié)腸癥長期的臨床及基礎(chǔ)爭論, 既往主要將 留意力集中在手術(shù)方法的改進(jìn), 病理生理學(xué)變化觀看上, 已有多篇相關(guān)文章發(fā)表； （ 2） 本 課題組對多個年齡組的正常個體及先天性巨結(jié)腸癥患者進(jìn)行了神經(jīng)節(jié)發(fā)育觀 測,并對人巨細(xì)胞病毒與先天性巨結(jié)腸癥的關(guān)系進(jìn)行了爭論； （ 3） 對 數(shù)百例先天性巨結(jié)腸癥患者進(jìn)行了診治,有較豐富的臨床體會； （ 4） 已 成功地建立了神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)； （ 5） 本 課題組成員已進(jìn)行了 MSC 轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的試驗,并獲

33、得了國家自然科學(xué) 基金資助（編號 30070382）； （ 6） 本 課題組較嫻熟地把握了基因轉(zhuǎn)染技術(shù),成效優(yōu)良； 2. 已具備的試驗條件,尚缺少的試驗條件和擬解決的途徑（包括利用國家重點試驗室和 部門開放試驗室的方案與落實情形） 本爭論室所在的重慶醫(yī)科高校兒科爭論所為原四川省重點試驗室, 現(xiàn)已重新評定為 重慶直轄市重點試驗室,目前正在申報國家級及訓(xùn)練部重點試驗室,是博士授權(quán)點并 可培養(yǎng)博士后人員；有高級職稱人員 100 多人；兒科爭論所專業(yè)門類齊全,技術(shù)力氣 雄厚,設(shè)備完善,具有包括中心試驗室在內(nèi)的涉及分子生物學(xué),分子遺傳學(xué),細(xì)胞生 物學(xué),組織病理學(xué),生物化學(xué),免疫學(xué),微生物學(xué)以及急救醫(yī)學(xué),

34、小兒腫瘤試驗外科 學(xué)等專業(yè)試驗室,爭論室十余個,能承擔(dān)國家重點科研課題及博士后爭論工作；多年 來,已完成包括國家自然科學(xué)基金資助項目在內(nèi)的部,委,省,市級科研課題上百項, 并獲多項各級嘉獎； 主要設(shè)備及試驗條件包括： 掃描,透射電鏡 高壓液相色譜儀 顯微成像系統(tǒng) 石蠟,冷凍,恒冷,超薄切片機(jī) 熒光,相差,倒置,自動照相顯微鏡 PCR 儀 第 14 頁,共 23 頁7-1 細(xì)胞培養(yǎng)全套設(shè)備 熒光分光光度計 紫外分光光度計 LKB 電泳儀器 DNA 測序分析儀等可通過測序公 低溫超速離心機(jī) 超低溫 冰箱,低溫冰柜 超聲細(xì) 胞粉碎儀 去離子水發(fā)生 器 分子生物學(xué)試驗常用 設(shè)備 動物試驗檢測保護(hù) 設(shè)施

35、 二氧化碳孵箱 其他 幫忙設(shè)備 其它本次試驗需要,但缺少的設(shè)備,如 司解決或聯(lián)系國家干細(xì)胞爭論重點試驗室解決； 第 15 頁,共 23 頁7-2 申請者和項目組主要成員的學(xué)歷和爭論工作簡歷, 近期已發(fā)表與本項目有關(guān)的 主要論著目錄 * 和獲得學(xué)術(shù)嘉獎情形及在本項目中承擔(dān)的任務(wù)；青年科學(xué)基金申請者仍 應(yīng)注明學(xué)位論文名稱及導(dǎo)師姓名與工作單位 * 論文：作者題目刊名年份卷（期） 頁碼 專著：作者書名出版者年份 第 16 頁,共 23 頁8-1 8-3 五,經(jīng)費預(yù)算 支 出 科 目 金 額 計 算 根 據(jù) 及 理 由 （萬元） 1. 合 計 1科研業(yè)務(wù)費 資料費 學(xué) 資料檢索及查新等 術(shù)溝通費 發(fā)表論

36、文等 成果鑒定費 2試驗材料費 試驗動物及飼養(yǎng) 生Wistar-Imamichi AR 系選育 等 cDNA 的構(gòu)建 物試劑及化學(xué)試劑 nestin ,及 V-MYC , EGF , FGF-2 多種消耗性材料費 引物合成 cDNA 測序 多種生長因子 3項目組織費 第 17 頁,共 23 頁注 : 預(yù)算支出科目按以下次序填寫 : 1. 科研業(yè)務(wù)費 2. 試驗材料費 3. 儀器設(shè)備費 4. 試驗室改裝費 5. 協(xié)作費 6. 項目組織實施費；開支范疇詳見國家自然科學(xué)基金資助項目財務(wù)治理方法其次章； 9 六,申請者正在承擔(dān)的其它爭論項目 （攀登方案, 863 方案,攻關(guān)任務(wù)和各部委,省市任務(wù)等項目

37、的名稱及編號,任務(wù)來源, 起止年月,負(fù)責(zé)或參加以及與本申請項目的關(guān)系等情形） 七,申請者承擔(dān)（負(fù)責(zé)或參加）國家自然科學(xué)基金資助項目的情形 批準(zhǔn)號 項目名稱 起止年月 負(fù)責(zé)或參加 進(jìn)展或完成情形 第 18 頁,共 23 頁 10 對申請者負(fù)責(zé)的前一個已結(jié)題科學(xué)基金資助項目 繼爭論進(jìn)展及與本申請項目的關(guān)系加以詳細(xì)說明； （項目名稱及批準(zhǔn)號） 完成情形, 后 另附該已結(jié)題項目 爭論工作總結(jié)摘要 （ 300 字）及已發(fā)表主要相關(guān)論文首頁復(fù)印件（限三篇） ； 八,申請者承諾 我保證上述填報內(nèi)容的真實性； 假如獲得資助, 我與本項目組成員將嚴(yán)格遵守國家自然 科學(xué)基金委員會的有關(guān)規(guī)定,切實保證爭論工作時間,按方案認(rèn)真開展?fàn)幷摴ぷ?按時報 送有關(guān)材料； 申請者（簽章） 年 月 日 11 第 20 頁,共 23 頁九,舉薦看法 （不具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的申請者, 須有兩名具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的同行專家舉薦； 舉薦時,請認(rèn)真負(fù)責(zé)地介紹申請者及其項目組成員的業(yè)務(wù)基礎(chǔ),爭論才能,科研態(tài)度及研 究條件等；項目組成員不能做舉薦者） 舉薦者（簽章） 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長 所在單位： 舉薦者（簽章） 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長 所在單位： 12 第 21 頁,共 23 頁十,申請者所在單位及合作單位的審查與保證 1. 申請者所在單位學(xué)