1、 第十一章 微生物與現(xiàn)代生物制藥工業(yè)微生物制藥的開創(chuàng)可追溯到20世紀(jì)40年代初，世界上第一個(gè)有效的抗菌物質(zhì)青霉素的研究開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)。在英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明（Fleming）發(fā)現(xiàn)了點(diǎn)青霉能產(chǎn)生一種活性抗菌成分并命名為青霉素（Penicillin）的10年后，牛津大學(xué)病理學(xué)教授Florey和他的助手Chain組織了20多位不同學(xué)科的學(xué)者進(jìn)行攻關(guān)。經(jīng)過一年多時(shí)間的努力，首次制得青霉素結(jié)晶并在1941年應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，奠定了青霉素的治療學(xué)基礎(chǔ)。1942年，美國(guó)Merck制藥公司在Florey和Chain的幫助下，開始工業(yè)化生產(chǎn)青霉素并大規(guī)模用于臨床試驗(yàn)，為挽救在第二次世界大戰(zhàn)中戰(zhàn)傷受細(xì)菌感染而瀕臨死

2、亡的傷員生命, 發(fā)揮了奇特的決定性的重大作用。1943年又發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉菌（Pchrysogenum）, 經(jīng)選育后表現(xiàn)出更高的青霉素產(chǎn)生能力，使青霉素的產(chǎn)量大大提高。同年，Chain又確定了青霉素的分子結(jié)構(gòu)。至此，第一個(gè)利用微生物發(fā)酵制備抗生素的工業(yè)化獲得了成功，開創(chuàng)了抗生素黃金時(shí)代的到來(lái)，被譽(yù)為二次大戰(zhàn)中三大發(fā)現(xiàn)之一，而Fleming、Florey和Chain三位科學(xué)家同時(shí)獲得了1945年度諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)。青霉素在臨床上的抗感染奇異療效，引起世人的震驚轟動(dòng)，也大大激發(fā)了各國(guó)微生物學(xué)者的研究熱情。繼青霉素之后，從微生物中大規(guī)模進(jìn)行其他抗生素的篩選，是由美國(guó)科學(xué)家瓦克斯曼（Waksman）及其

3、合作者開始的。瓦克斯曼根據(jù)自己多年的研究工作，逐步建立并提出一整套分離培養(yǎng)放線菌、提取抗生素及測(cè)定其活性的篩選實(shí)驗(yàn)技術(shù)。使他在1943年發(fā)現(xiàn)了鏈霉素，并在1944年1月首次對(duì)外宣布了這種新抗生素作為抗結(jié)核病藥品應(yīng)用于臨床取得了令人振奮的治療效果。在以后的近20年內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了眾多的抗生素品種。如1947年發(fā)現(xiàn)了氯霉素（第一個(gè)廣譜抗生素）；1948年Dugger發(fā)現(xiàn)了金霉素，以后又得到土霉素和毒性較低的四環(huán)素；1952年發(fā)現(xiàn)了紅霉素；1953年發(fā)現(xiàn)了新生霉素；1957年，Sensi發(fā)現(xiàn)了利福霉素（經(jīng)結(jié)構(gòu)改造得到利福平），同年由梅澤濱夫發(fā)現(xiàn)了對(duì)耐藥菌有效的卡那霉素；1963年Weinstein發(fā)現(xiàn)了

4、毒性較低的艮他霉素(慶大霉素)等。自60年代起，抗腫瘤抗生素（柔紅霉素、絲裂霉素C、博萊霉素）、抗蟲抗生素（鹽霉素、莫能霉素、阿弗米丁）、農(nóng)用抗生素（春雷霉素、有效霉素、井岡霉素）和抗病毒抗生素等也不斷被發(fā)現(xiàn)。目前，在臨床上應(yīng)用的大多數(shù)天然抗生素都是在5060年代發(fā)現(xiàn)的。由于青霉素等天然抗生素的大量廣泛使用，使臨床應(yīng)用上出現(xiàn)過敏反應(yīng)和耐藥性菌，因此，從60年代開始，科學(xué)家們對(duì)原有抗生素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，尋求具有更好臨床效果的抗生素衍生物，使抗生素的研究進(jìn)入了半合成抗生素的時(shí)代。如60年代初，英國(guó)Beecham公司由青霉素母核6APA合成了苯乙青霉素，接著又合成了耐酶的甲氧苯青霉素、可供口服的苯唑青

5、霉素和廣譜氨芐青霉素。接著，Glanxo公司也由頭孢菌素C的母核7ACA先后合成了頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢噻肟和頭孢拉定等抗菌性較強(qiáng)的半合成頭孢菌素。后來(lái)又發(fā)展到由青霉素G的6-APA母核經(jīng)化學(xué)擴(kuò)環(huán)得到的7ADCA為母核，再經(jīng)酶促合成獲得可供口服的頭孢氨芐、頭孢克羅等半合成頭孢菌素，并使該類抗生素從窄譜的第一代逐漸發(fā)展到廣譜的第三代，臨床應(yīng)用的品種增加到50多個(gè)。由于40和50年代抗生素大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的成功，從而建立了一整套液體深層通氣發(fā)酵工程技術(shù)，這就為其他的微生物藥物的發(fā)酵生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。這些微生物藥物是應(yīng)用生物化學(xué)和微生物學(xué)的理論、方法和研究成果，從微生物菌體或其發(fā)酵液中經(jīng)分離、純

6、化得到的某些生理活性物質(zhì)。除抗生素類藥物外，還包括氨基酸類藥物、核苷酸類藥物、維生素類藥物、酶類藥物、多肽蛋白質(zhì)類藥物、甾體類激素和生物制品等。這類以微生物初級(jí)代謝產(chǎn)物和微生物菌體為主的微生物藥物，在6070年代得到蓬勃發(fā)展并取得巨大的成果。在抗生素深入研究的基礎(chǔ)上另一類由微生物產(chǎn)生的除抗感染、抗腫瘤以外的其他生理活性物質(zhì)，如特異性酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑和抗氧化劑等的研究報(bào)道層出不窮，這類物質(zhì)也是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，但其活性已超出了抑制某些生物生命活動(dòng)的范圍。由于這類物質(zhì)具有廣泛的生理活性而已經(jīng)或正在被開發(fā)成為各種藥物用于臨床。從已經(jīng)取得的研究成果來(lái)看，在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中已發(fā)現(xiàn)

7、的生理活性物質(zhì)，不僅是構(gòu)成微生物藥物的最新部分，而且已是主要部分。隨著細(xì)胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，更進(jìn)一步為微生物制藥提供了新型的融合子和工程菌，它們能極大地提高生產(chǎn)效率或能夠生產(chǎn)原來(lái)微生物所不能產(chǎn)生的藥物。如用于預(yù)防或治療心腦血管疾病、糖尿病、肝炎、腫瘤的藥物以及抗感染、抗衰老的新型藥物。基因工程藥物主要是生理活性多肽類和蛋白質(zhì)類藥物，如胰島素、生長(zhǎng)激素、干擾素、組織纖溶酶原激活劑、白細(xì)胞介素、促紅細(xì)胞生成素、集落刺激因子等，此外還有各種基因工程疫苗。實(shí)際上，應(yīng)用DNA重組技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)所獲得的工程菌和新型微生物菌種來(lái)開發(fā)各類新型藥物，已經(jīng)成為微生物制藥研究的重點(diǎn)和發(fā)展方向之一。生

8、物制藥的三大來(lái)源是微生物、植物和動(dòng)物，而植物和動(dòng)物的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，收獲量有限，因此，開發(fā)新型生物藥物的重點(diǎn)會(huì)逐漸轉(zhuǎn)向微生物。應(yīng)用微生物技術(shù)研究開發(fā)新藥, 改造和替代傳統(tǒng)制藥工業(yè)技術(shù)，加快醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模和速度，是目前醫(yī)藥工業(yè)的一個(gè)重要發(fā)展方向。 第一節(jié) 微生物來(lái)源抗生素的研究與生產(chǎn)抗生素的來(lái)源可以是微生物、植物和動(dòng)物，但抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是來(lái)自微生物的大量發(fā)酵法。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為傳統(tǒng)概念的抗生素仍應(yīng)只限于微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此抗生素可定義為：抗生素是在低微濃度下即可對(duì)它種生物的生命活動(dòng)有特異性抑制或影響作用的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物及其衍生物?？股厥且活愖钪匾驮谂R床上用量最大的抗感

9、染藥物。它用于治療由病原微生物，包括病毒、細(xì)菌、真菌、原蟲和寄生蟲所引起的各種疾病，也用于某些癌癥的治療。此外，抗生素還應(yīng)用于禽畜和植物病害的防治、食物防腐以及工業(yè)防霉等?？梢娍股貙?duì)人類的生活與生產(chǎn)以及對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的作用十分重要。在50年代至60年代，是從微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中不斷發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)各種天然抗生素的黃金時(shí)代，而隨后開創(chuàng)的從已有抗生素采用酶法或化學(xué)法進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造來(lái)生產(chǎn)各種療效更高、毒副作用更低和更為有效的半合成抗生素，則是又一個(gè)黃金時(shí)代。隨著對(duì)抗生素認(rèn)識(shí)的加深和研究工作的深入開展，許多新型抗生素不斷被發(fā)現(xiàn)，其中有不少已被應(yīng)用于臨床。目前，抗生素的生理活性和作用已超出了抗微生物感染和抗腫瘤

10、的范圍，某些抗生素還具有特異性酶抑制作用、免疫調(diào)節(jié)作用和受體拮抗作用等廣泛的生理活性作用。 、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然抗生素(一) 主要天然抗生素及其產(chǎn)生菌當(dāng)前在臨床上實(shí)際應(yīng)用和工業(yè)生產(chǎn)的天然抗生素中，以放線菌所產(chǎn)生的抗生素為第一位（表81），其次是真菌中的半知菌產(chǎn)生的抗生素（表8 2），再其次是由細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素（表83）。 表8 1 放線菌產(chǎn)生的主要抗生素 抗生素 產(chǎn)生菌鏈霉素（streptomycins）灰色鏈霉菌（Sgriseus）卡那霉素（kanamycins）卡那霉素鏈霉菌（Skanamyceticus）慶大霉素（gentamycins）絳紅小單孢菌 ( M. purpurea )棘孢

11、小單孢菌 ( Mechinospora )金霉素（chlortetracycline）金色鏈霉菌（Saureofaciens）紅霉素（erythromycin）紅色鏈霉菌（Serythreus）柱晶白霉素（leucomycins）北里鏈霉菌（Sritasatoensis）麥迪霉素（mydemycin）生米卡鏈霉菌 ( Smycarfaciens nov.sp.)螺旋霉素（spiramycins）生二素鏈霉菌（Sambofaciens）制霉菌素（nystatin）諾卡氏鏈霉菌（Snoursei）兩性霉素B（amphotericin B）結(jié)節(jié)鏈霉菌（Streptomyces nodosus）諾卡霉

12、素（nacardicins）均勻諾卡氏菌（Nocardia uniformi）硫霉素（thienamycin）卡特利鏈霉菌 (Scatteya )氯霉素（chloramphenicol）委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Sveneznelae）新生霉素（novobiocin）渾球鏈霉菌（S. sphaeroides）四環(huán)素（tetracycline）金霉素鏈霉菌（Saureofaciens）土霉素（oxytetracycine）龜裂鏈霉菌（Srimosus）巴龍霉素（paromomycin）巴龍霉素型龜裂鏈霉菌（S. rimosus var paromonomycincus）利福霉素（rifamycin）地中海

13、諾卡氏菌（Nocardia meditrerranei）博萊霉素（bleomycins）輪枝鏈霉菌（Sreticillus）絲裂霉素C（mitomycin C）頭狀鏈霉菌 ( Scaespitocus )放線菌素C（actinomycin C）金羊毛鏈霉菌 ( SChrysomallus )林可霉素（lincomycin）林可鏈霉菌 ( S. lincolnensis )表8 2 真菌產(chǎn)生的主要抗生素抗生素產(chǎn)生菌青霉素（不包括青霉素N）（penicillin）點(diǎn)青霉（Penicillium notatum）產(chǎn)黃青霉 ( Pencillnum chrysogenum ) 青霉素N（penicil

14、lin N）頂孢頭孢子菌（Cephalosporium acremonium） 頭孢菌素C（cephalosporin C）頂孢頭孢子菌 去乙酰氧頭孢菌素C（deacetoxycephalosporin C）頂孢頭孢子菌 去乙酰頭孢菌素 C（deacetylocephalosporin C）頂孢頭孢子菌 灰黃霉素（grisefulvin）灰黃霉素青霉 ( Penicillium griseofulvin ) 變曲霉素（pecilocin）宛氏擬青霉 ( Paecilomyces varioti ) 表8 3 細(xì)菌產(chǎn)生的主要抗生素抗生素產(chǎn)生菌 桿菌肽（bacitracin）枯草芽孢桿菌（Baci

15、llus subtilis）短桿菌肽（gramicidin）短芽孢桿菌 ( Bacillus brevies )多黏菌素（polymyxin）多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxin）短桿菌酪肽（tyrocidin）短芽孢桿菌 ( Bacillus brevies )(二) 新抗生素產(chǎn)生菌的分離與篩選1. 放線菌的分離大多數(shù)放線菌的分離并不采用含豐富營(yíng)養(yǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，而是采用較貧瘠或復(fù)雜底物（如幾丁質(zhì)）的瓊脂平板培養(yǎng)基。如可采用精氨酸甘油培養(yǎng)基、AV瓊脂、Benedict瓊脂、膠狀幾丁瓊脂等培養(yǎng)基進(jìn)行平板分離。在分離培養(yǎng)基中，通常都加入抗真菌劑如制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。

16、此外，為了富集和分離某些特殊種類的放線菌，可選擇性地添加某些抗生素。放線菌的分離有非選擇性分離和選擇性分離兩種，前者是對(duì)土樣中所有放線菌都進(jìn)行分離，后者是在分離之前，先對(duì)土樣進(jìn)行預(yù)處理（如在不同溫度下進(jìn)行熱處理），只留下具有特定特性的放線菌。分離方法可采用平板劃線分離法、玻璃涂棒連續(xù)涂布法、十倍稀釋法和接種環(huán)快速稀釋法等。總的目的是使以混雜的狀態(tài)生長(zhǎng)繁殖在一起的各類微生物單個(gè)分開并選擇性地生長(zhǎng)，從而獲得放線菌的純培養(yǎng)。2. 放線菌的次代培養(yǎng)及純化成功地分離出各種不同放線菌的關(guān)鍵, 是上述所采集的含菌樣品的本身及所采用的合適分離培養(yǎng)基。而當(dāng)菌落形成后，先用肉眼識(shí)別不同的生長(zhǎng)形態(tài)，從而初步地加以鑒

17、定，再通過顯微鏡進(jìn)行鏡檢。進(jìn)一步了解其菌絲和孢子絲的形成情況，這對(duì)于成功地分離獲得放線菌純培養(yǎng)也是很重要的。次代培養(yǎng)及純化操作是將分離平板上所形成的菌落, 用無(wú)菌接種針或鉤挑取單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接到適宜的瓊脂斜面上，或者點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)，以供進(jìn)一步分離和篩選用。3. 新抗生素產(chǎn)生菌的篩選從大量分離獲得的純培養(yǎng)微生物中，采用合理的方法盡快鑒別出少數(shù)有應(yīng)用價(jià)值的抗生素產(chǎn)生菌的試驗(yàn)過程，即為篩選。一般根據(jù)篩選目的，選擇合適的篩選方法，例如選用有利于目的菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基及選用合適的試驗(yàn)菌作為篩選模型。在篩選抗細(xì)菌或抗真菌的新抗生素時(shí)，一般應(yīng)先盡量選用無(wú)毒性而對(duì)某些致病菌具有代表性的微生物作為試驗(yàn)菌，

18、以防止在篩選工作中感染病原菌的危險(xiǎn)。例如常用金黃色葡萄球菌209P代表革蘭氏陽(yáng)性病原球菌作為試驗(yàn)菌，即篩選模型；用大腸桿菌代表革蘭氏陰性腸道致病細(xì)菌作為試驗(yàn)菌；用青霉菌代表致病性絲狀真菌作為試驗(yàn)菌等。新抗生素產(chǎn)生菌的常用篩選方法有下列幾種：(1) 瓊脂塊移置法將已分離純化的放線菌逐個(gè)點(diǎn)接于合適的平板培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)形成菌落后，用打孔器將菌落連同瓊脂塊切取后分別移置于已接種有試驗(yàn)菌的平板上，在合適溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察瓊脂塊周圍有無(wú)抑菌圈形成。(2) 培養(yǎng)液擴(kuò)散法將待篩選的純化菌株接種于一定量的液體培養(yǎng)基中，置搖床于適宜的溫度下振蕩培養(yǎng)36 d。用直徑為5mm的濾紙片沾取培養(yǎng)液的上清液或菌絲

19、體的丙酮浸提液，分別置于接種有試驗(yàn)菌的平板上，培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察有否抑菌圈產(chǎn)生。(3) 抗腫瘤抗生素的篩選法篩選抗腫瘤抗生素的方法很多，較有效的方法是人腫瘤細(xì)胞或動(dòng)物腫瘤模型法，但因該法繁復(fù)，耗時(shí)耗動(dòng)物和耗人力多，故作為初篩一般仍常用體外微生物噬菌體模型法。噬菌體模型法可分為誘導(dǎo)噬菌體法和抗噬菌體法兩種。前者是將沾有待篩培養(yǎng)液的圓濾紙置于混有溶原菌和指示菌的平板上，凡能誘導(dǎo)溶原菌釋放出噬菌體者，濾紙片周圍出現(xiàn)清晰噬菌斑。后者則是將沾培養(yǎng)液的濾紙片置于混有噬菌體及其敏感細(xì)菌的平板上，有抗噬菌體作用者，濾紙片周圍有明顯的細(xì)菌生長(zhǎng)圈。(4) 抗病毒抗生素的篩選法篩選抗病毒抗生素除可采用前述篩選抗腫瘤

20、抗生素類似的方法外，還可采用體內(nèi)篩選法。該法是采用病毒感染動(dòng)物，然后進(jìn)行試驗(yàn)治療，觀察動(dòng)物存活期或生存期以判斷其療效。4. 新抗生素的早期鑒別為了盡早了解篩選到的抗生素是新的還是舊的抗生素，是那一類新或舊的抗生素，必須對(duì)上述篩選獲得的陽(yáng)性菌株進(jìn)行早期鑒別，以便淘汰不需要的菌株。鑒別時(shí)，可先進(jìn)行菌株形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特性等試驗(yàn)，觀察并分析有否可能是哪種新老抗生素的產(chǎn)生菌。接著可將產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的抗生素進(jìn)行層析或電泳分析，并將獲得的各種圖譜與已知抗生素圖譜進(jìn)行比較鑒別和判斷。經(jīng)過分離篩選和早期鑒別，有價(jià)值的新抗生素產(chǎn)生菌應(yīng)進(jìn)行菌種選育和發(fā)酵條件優(yōu)化提高抗生素產(chǎn)量，并妥善保藏。新抗生素還必須

21、通過藥理和臨床試驗(yàn)，以便為實(shí)際應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。（三）抗生素的生物效價(jià)測(cè)定法抗生素的醫(yī)療作用主要是它的抗菌活力，而采用微生物檢定法正是以抗生素的抗菌活力為指標(biāo)來(lái)衡量抗生素生物效價(jià)的一種方法。其測(cè)定原理于臨床要求相一致，能直接反映抗生素的醫(yī)療價(jià)值。微生物檢定法測(cè)定抗生素生物效價(jià)，一般可分為稀釋法、比較法和瓊脂擴(kuò)散法。以瓊脂擴(kuò)散法（亦稱管碟法）應(yīng)用最廣泛。該法的一般操作步驟是：先將固體培養(yǎng)基融化并倒制平板，待凝固后，在上面再倒一層混有試驗(yàn)菌的融化培養(yǎng)基。凝固后，在表面放置不銹鋼管子，向管子中加入抗生素稀釋液，適溫培養(yǎng)一定時(shí)間。經(jīng)培養(yǎng)后，由于抗生素向培養(yǎng)基中擴(kuò)散，凡抑菌濃度所達(dá)之處，試驗(yàn)菌不能生長(zhǎng)而

22、呈透明抑菌圈。量取抑菌圈直徑并進(jìn)行效價(jià)計(jì)算，具體方法請(qǐng)參照中國(guó)藥典。（四）內(nèi)酰胺類抗生素的發(fā)酵生產(chǎn) 內(nèi)酰胺類抗生素是一類最重要的抗生素，在醫(yī)用抗生素中一直處于優(yōu)勢(shì)地位，在銷量和發(fā)展上一直呈上升趨勢(shì)。其主要特征是在分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)具抗菌活力的內(nèi)酰胺環(huán)狀結(jié)構(gòu)。青霉素和頭孢菌素是天然內(nèi)酰胺類抗生素的兩個(gè)典型代表。1. 青霉素（1）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)青霉素的母核是6氨基青霉烷酸（6Amino Penicillanic Acid, 6APA），由四元內(nèi)酰胺環(huán)、五元二氫噻唑環(huán)這兩個(gè)稠駢雜環(huán)組成，可以看作由半胱氨基酸和纈氨酸結(jié)合而成。側(cè)鏈R不同，所形成的青霉素也不同，如R為苯甲基（芐基）時(shí)，為青霉素G即芐基青霉素

23、（圖8 1）。 圖11 1 青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu) R側(cè)鏈； *不對(duì)稱碳原子 在不添加側(cè)鏈前體的自然發(fā)酵液中，含有青霉素F、G、K、V、X和雙氫F等混合物，但只有青霉素G和青霉素V在臨床上有療效?，F(xiàn)行的青霉素發(fā)酵液中，G的含量最高，抗菌作用最強(qiáng)。青霉素G是一種有機(jī)酸、難溶于水，不穩(wěn)定。但其Na+、K+鹽穩(wěn)定，易溶于水。 青霉素G優(yōu)點(diǎn)是使用安全，毒性小，低濃度抑菌、高濃度殺菌、對(duì)大多數(shù)G+球菌和桿菌、螺旋體及放線菌的抗菌作用強(qiáng)。其缺點(diǎn)是對(duì)酸不穩(wěn)定，不能口服、排泄快；對(duì)G-菌無(wú)效，大量應(yīng)用后易誘發(fā)耐藥性菌株；某些病人會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)（因產(chǎn)品中含微量青霉噻唑酸蛋白）。上述缺點(diǎn)可通過研制各類半合成新青霉素和各

24、種制劑加以克服。（2）青霉素產(chǎn)生菌1929年由Fleming發(fā)現(xiàn)并分離獲得的青霉素產(chǎn)生菌是點(diǎn)青霉菌，又稱音符型青霉菌（Penicillium notatum），其青霉素產(chǎn)量很低，表面培養(yǎng)的效價(jià)也只有幾十個(gè)單位，不符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。1943年分離到一株橄欖型青霉菌即產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium.Chrysogenum）NRRL1995，適合于液體深層發(fā)酵，效價(jià)約為100 U/ml。該菌株經(jīng)X射線和紫外線誘變處理后得到一變異株WisQ176，青霉素產(chǎn)量最高達(dá)1500 U/ml，比原始株提高約15倍，但發(fā)酵時(shí)產(chǎn)色素，影響產(chǎn)品質(zhì)量。后來(lái)再將WisQ176通過一系列的誘變處理，獲得不產(chǎn)生色素的變

25、異株5120。目前工業(yè)生產(chǎn)上采用的生產(chǎn)菌種均為該變種經(jīng)不同改良途徑得到的變異株，有形成綠色和黃色孢子的兩種生產(chǎn)菌株。通過采用理化因素不斷進(jìn)行誘變選育，當(dāng)前青霉素發(fā)酵生產(chǎn)的效價(jià)已超過50000 U/ml的高水平。目前，又采用原生質(zhì)體誘變、原生質(zhì)體融合及基因工程等現(xiàn)代育種技術(shù)進(jìn)一步定向選育優(yōu)良高產(chǎn)的菌種，并已取得顯著成效。 產(chǎn)黃青霉菌的個(gè)體形態(tài)：青霉穗形似毛筆，從氣生菌絲形成大梗和小梗，于小梗上著生分生孢子。分生孢子呈鏈狀排列，橢園或園柱形。菌落形態(tài)為園形，邊緣整齊或鋸齒狀，外觀平坦或皺褶，孢子呈黃綠色，綠色或藍(lán)綠色，成熟后變?yōu)辄S棕色或紅棕色。（3）青霉素的發(fā)酵 工業(yè)生產(chǎn)上所用的產(chǎn)黃青霉菌孢子的制

26、備過程是：將長(zhǎng)期保藏的冷凍管孢子移接于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，成熟后再移植于固體培養(yǎng)基（大米和小米）上，于25培養(yǎng)約7天，收集成熟孢子進(jìn)行真空干燥，低溫保存?zhèn)渖a(chǎn)用。 為制備大量種子（菌絲體）供大規(guī)模發(fā)酵用，一般采用二級(jí)或三級(jí)種子培養(yǎng)。一級(jí)種子培養(yǎng)在小型種子罐中進(jìn)行，主要是使接入的生產(chǎn)孢子萌發(fā)形成菌絲并增殖為大量菌絲體。二級(jí)種子培養(yǎng)在較大的種子罐中進(jìn)行，主要目的是進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)使獲得足量的供發(fā)酵用的菌絲體。種子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)較豐富，碳源多采用葡萄糖、蔗糖或乳糖，氮源采用玉米漿、尿素等，還有起pH緩沖作用的碳酸鈣和各種必需的無(wú)機(jī)鹽類。在自然pH條件下，保持最適生長(zhǎng)溫度2627和充分的通氣、攪拌，分別培養(yǎng)約

27、56 h和24 h，可達(dá)到上述種子擴(kuò)大培養(yǎng)之目的。 進(jìn)入大罐發(fā)酵時(shí)除了繼續(xù)大量繁殖菌絲體外，主要是發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。為了獲得較高的青霉素發(fā)酵產(chǎn)率，需要控制并優(yōu)化的主要環(huán)境因素和生理因素有：發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH、溶解氧、碳氮源、補(bǔ)料、側(cè)鏈前體添加、菌絲濃度與生長(zhǎng)速度、菌絲形態(tài)等。（4）青霉素的提取 發(fā)酵液預(yù)處理：發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，其中對(duì)青霉素提取影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子Ca+、Mg+、Fe+等和蛋白?？捎貌菟徕}除Ca+和蛋白，用三聚磷酸納除Ca+、Mg+，用黃血鹽除Fe+，變性除蛋白。過濾：通過調(diào)pH、加去乳化劑、助濾劑等方法盡量除去蛋白以改善過濾性能，并經(jīng)兩次過濾得青霉素濾液。 萃?。焊鶕?jù)青霉素游

28、離酸易溶于有機(jī)溶劑而青霉素鹽易溶于水的特性，采用溶媒萃取法，進(jìn)行反復(fù)轉(zhuǎn)移而達(dá)到提純和濃縮之目的。整個(gè)萃取過程在低溫下進(jìn)行，需添加去乳化劑防止蛋白引起的乳化。 結(jié)晶：在醋酸丁酯萃取液中加入醋酸鉀（或鈉）乙醇液，使析出青霉素鉀鹽或鈉鹽的結(jié)晶。 2. 頭孢菌素(1) 頭孢菌素C的結(jié)構(gòu)頭孢菌素C的化學(xué)結(jié)構(gòu)與青霉素相似，也具有-內(nèi)酰胺環(huán)，其母核為7-氨基頭孢霉烷酸（7ACA）。不同之處在于青霉素母核的二氫噻唑五元環(huán)擴(kuò)大為 二氫噻嗪六元環(huán)，側(cè)鏈為D氨基己二酸，含有乙酰氧基取代基（圖8 2）。 圖11 2 頭孢菌素C的化學(xué)結(jié)構(gòu)（2）頭孢菌素C的性質(zhì)與特點(diǎn)頭孢菌素C與青霉素不同，對(duì)酸性和重金屬離子較穩(wěn)定。在p

29、H11時(shí)，才迅速喪失其生物活性；對(duì)青霉素酶不敏感，抗革蘭氏陰性細(xì)菌能力較強(qiáng)；具有抗耐藥金黃色葡菌球菌（革蘭氏陽(yáng)性）的作用；對(duì)細(xì)菌的作用是殺菌，對(duì)動(dòng)物和人毒性非常低；頭孢菌素C的抗菌活性較低，只有芐青霉素的1/200；頭孢菌素C雖沒有臨床應(yīng)用價(jià)值，但通過酶法和化學(xué)改造，可以制備出比半合成青霉素更高效的衍生物，即半合成頭孢菌素類抗生素。（3）頭孢菌素C產(chǎn)生菌 1948年布魯特治氏（Brotzas）分離到頂孢頭孢菌（Cephalosporium acremonium），后來(lái)從發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)其中含有三種完全不同的抗生素：頭孢菌素N、頭孢菌素P和頭孢菌素C。這三種天然頭孢菌素都不具備臨床使用價(jià)值。但由于頭

30、孢菌素C的化學(xué)結(jié)構(gòu)、母核與青霉素相似，而與青霉素相比具有耐酸性強(qiáng)、毒性低，對(duì)青霉素酶不敏感，抗革蘭氏陰性菌能力強(qiáng)，且具有抗耐青霉素的金黃色葡萄球菌等優(yōu)點(diǎn)而引起重視。原始的Bratzas頂孢頭孢菌菌株產(chǎn)量很低，后經(jīng)誘變選育獲得M 8650母株，再經(jīng)埃莉.禮萊公司（Eli.Lilly）進(jìn)一步誘變選育獲得菌株CW 19，產(chǎn)量比母株提高了三倍，而且發(fā)酵液中頭孢菌素C與副產(chǎn)物青霉素N (造成提取和純化的困難及成本的增加）之間的比例也有明顯的改進(jìn)。 其它有關(guān)菌種選育的報(bào)道有：意大利報(bào)道，通過選育獲得一個(gè)頭孢菌素C產(chǎn)量高而青霉素N產(chǎn)量低的新菌種名為Cephalosporium SP.F12（ATCC2033

31、9）, 發(fā)酵130 h可得頭孢菌素C 45005000 g/ml，且副產(chǎn)物PCN產(chǎn)量低； 1976年，日本某公司將一高產(chǎn)菌株N-16親株以紫外線處理后，獲得一變異株IS5，能利用硫酸鹽合成頭孢菌素C，改變過去一直用甲硫氨酸作硫源的工藝，且產(chǎn)量比親株提高2倍; 日本某公司將LM5（甲硫氨酸和亮氨酸雙缺陷型）與AP78（精氨酸、苯丙氨酸雙缺）進(jìn)行雜交，獲得頭孢菌素C高產(chǎn)菌株2M16，產(chǎn)量高達(dá)8200 g/ml。(4) 頭孢菌素C的發(fā)酵 頭孢菌素C的發(fā)酵控制要點(diǎn)可歸納為下列幾點(diǎn)： 解除碳源阻遏作用： 在較高葡萄糖濃度下頭孢菌素C的產(chǎn)率下降，而青霉素N積累增加，表明葡萄糖會(huì)通過阻遏擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)生而阻遏頭

32、孢菌素C的生物合成。通過控制碳源的流加補(bǔ)料發(fā)酵，或用代謝速度較慢的植物油作碳源，可以較有效地避免這種碳源阻遏作用，顯著提高頭孢菌素C的產(chǎn)率。 硫源的補(bǔ)給： 頭孢菌素C分子中含有硫原子，故發(fā)酵時(shí)除需要一般的碳源和氮源外，還須在培養(yǎng)液中補(bǔ)給硫源。頭孢菌素C的產(chǎn)量與蛋氨酸和硫酸鹽的量成正比，蛋氨酸不僅能提供硫，而且還有誘導(dǎo)調(diào)控作用。此外半胱氨酸能滲入頭孢菌素C結(jié)構(gòu)中去。 防止頭孢菌素C的水解： 發(fā)酵液中存在著乙酰酯酶，能將頭孢菌素C水解成抗菌活性很弱且影響產(chǎn)物分離提純的脫乙酰頭孢菌素C。對(duì)于某些菌株，保持一定的碳源濃度有助于防止產(chǎn)物的水解。此外，盡量避免發(fā)酵溫度和pH的異常升高。這對(duì)于減少脫乙酰頭孢

33、菌素C的生成也有一定作用。 維持較高的溶氧濃度： 據(jù)報(bào)道當(dāng)溶氧濃度低于25飽和濃度時(shí)，頭孢菌素C的產(chǎn)率將顯著降低。故在頭孢菌素C發(fā)酵過程中，要求較高的氧傳遞率，以維持較高的溶氧濃度，一般要求發(fā)酵液中攪拌輸入功率在4 kw/m3。此外，要嚴(yán)格控制油的流加，使溶氧始終保持在25飽和度以上。 促進(jìn)菌體的形態(tài)分化： 在頭孢菌素C深層發(fā)酵過程中，頂孢頭孢菌有四種細(xì)胞型：菌絲型、萌芽型、節(jié)孢子型和分生孢子型。在快速生長(zhǎng)期菌體以細(xì)長(zhǎng)的絲狀為主，隨著營(yíng)養(yǎng)的消耗和生長(zhǎng)速率的下降，菌絲開始膨脹、斷裂、形成單細(xì)胞的節(jié)孢子，這種節(jié)孢子可以生成芽管，發(fā)育成為新的菌絲。在菌絲型向節(jié)孢子型轉(zhuǎn)化時(shí)期，頭孢菌素C大量產(chǎn)生，其合

34、成量與節(jié)孢子數(shù)量成正比。當(dāng)加入蛋氨酸和限制碳源的數(shù)量時(shí)，可以促進(jìn)這種形態(tài)分化，從而促進(jìn)產(chǎn)物的生物合成。 適時(shí)把握發(fā)酵終點(diǎn)： 在發(fā)酵過程中，頭孢菌素C是不穩(wěn)定的化合物，隨著其濃度的提高，非酶降解作用和乙酰酯酶的水解作用逐漸加大。另一方面，降解產(chǎn)物及脫乙酰頭孢菌素C含量的增加，又給產(chǎn)物的提取純化帶來(lái)不利影響。故應(yīng)從產(chǎn)率、產(chǎn)物組成、生產(chǎn)成本和效益等綜合因素考慮，適時(shí)把握發(fā)酵終點(diǎn)。(5) 頭孢菌素C的提取 一般采用溶劑法萃取。先用酰化劑，如氯乙酰丙酸酐或?qū)ο趸郊柞Ｂ葘?cè)鏈上的NH2?；?，轉(zhuǎn)化成N酰化頭孢菌素C，再用溶劑（乙酸乙酯、丁醇）萃取后做成鈉鹽，或用某些有機(jī)堿（如喹啉）做成難溶性復(fù)鹽沉淀。（五

35、）氨基糖苷類抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)氨基糖苷類抗生素是一類分子中含有一個(gè)環(huán)己醇配基，以糖苷鍵與氨基糖相結(jié)合的抗生素，又稱氨基環(huán)己醇類抗生素。其中鏈霉素是瓦克斯曼在1943年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)氨基糖苷類抗生素(圖8 3)，隨后相繼從微生物代謝產(chǎn)物中分離出多達(dá)200余種的這類天然抗生素，其中有巴龍、卡那、慶大、新霉素等重要的抗生素。該類抗生素是控制細(xì)菌（革蘭氏陽(yáng)性和陰性）感染的廣譜抗生素，并具有較強(qiáng)的抗菌活性，是臨床上重要的抗感染藥物。 圖11 3 鏈霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)1. 鏈霉素 鏈霉素在低濃度時(shí)有抑菌作用，高濃度時(shí)則有殺菌作用。臨床應(yīng)用鏈霉素主要是治療結(jié)核桿菌和某些細(xì)菌引起的疾病。 鏈霉素生產(chǎn)菌種主要有三個(gè)：

36、灰色鏈霉菌; 比基尼鏈霉菌（Streptomyces bikiniensis）; 灰肉鏈霉菌（Streptomyces griseocarneus）。其他產(chǎn)生鏈霉素的菌種還有很多。 灰色鏈霉菌的孢子絲直而短，不呈螺旋狀，分生孢子由斷裂生成。菌落34mm，隆起狀，梅花型或饅頭型，氣生菌絲和孢子均呈白色，菌落背面產(chǎn)生淡棕色色素。鏈霉素生產(chǎn)菌種的退化表現(xiàn)為菌落變成光禿形或半光禿形，氣生菌絲減少，鏈霉素產(chǎn)量下降。鏈霉素發(fā)酵的控制要點(diǎn)： 碳源以葡萄糖最合適（工業(yè)葡萄糖或葡萄糖廢母液）。菌種的蛋白酶活力較高。氮源可用有機(jī)氮（黃豆餅粉、玉米漿等）和無(wú)機(jī)氮。游離氨基酸有促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)和鏈霉素生物合成的作用； 葡

37、萄糖代謝速率受氧傳遞程度和磷酸鹽濃度的調(diào)節(jié)，高濃度磷酸鹽加速葡萄糖的利用，大量長(zhǎng)菌，但抑制鏈霉素的合成。通氧不足，葡萄糖降解速度加快，積累丙酮酸和乳酸。因此鏈霉素發(fā)酵需在高氧傳遞水平和適當(dāng)?shù)偷牧姿猁}濃度條件下進(jìn)行； 適當(dāng)?shù)蜐舛鹊匿@氮，控制適量Fe+濃度以及pH適當(dāng)偏堿性等，為鏈霉素生物合成創(chuàng)造有利條件。 2. 慶大霉素 慶大霉素又名艮他霉素, 是1963年由美國(guó)先令公司W(wǎng)einstein等發(fā)現(xiàn)的，1965年開始應(yīng)用于臨床。慶大霉素的抗菌活性強(qiáng)（C1 C2、G1），對(duì)銅綠假單胞菌、腸道桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌感染引起的多種疾病療效顯著，已被廣泛用于臨床。 慶大霉素的產(chǎn)生菌主要是絳紅小單孢菌和棘狀小單

38、孢菌，后者的孢子表面有鈍刺。我國(guó)于1967年分離到這兩個(gè)菌種。絳紅小單孢菌F543（菌絲深紫色，單孢子），棘狀小單孢菌F1977（菌絲淺橙或橙色，單孢子表面棘狀）。1969鑒定投產(chǎn)并定名為慶大霉素。 在慶大霉素的發(fā)酵代謝產(chǎn)物中，含有許多不同的組分，因此如何控制慶大霉素成品的組分使之能符合臨床治療上的需要是一個(gè)很重要的問題。慶大霉素發(fā)酵工藝要點(diǎn)： 發(fā)酵培養(yǎng)基由淀粉、葡萄糖、黃豆餅粉、蛋白胨、豆油、淀粉酶等組成；發(fā)酵溫度前期控制在36 ，以后維持在34 ,分別于發(fā)酵1820小時(shí)和44小時(shí)左右補(bǔ)全料次，30小時(shí)左右補(bǔ)氯化鈉0.2，魚胨1。如需提取維生素12，則需添加氯化鈷。通氣量為1：1。3. 新霉

39、素 新霉素(neomycin)也是瓦克斯曼等人于1949年發(fā)現(xiàn)并已在臨床上應(yīng)用的第二個(gè)氨基糖苷類抗生素，新霉素在低濃度下就能抑制包括結(jié)核桿菌在內(nèi)的許多革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌，對(duì)銅綠假單胞菌和變形桿菌的抑制能力較差，對(duì)真菌、原蟲、病毒無(wú)效。 新霉素產(chǎn)生菌為弗氏鏈霉菌（S. fradiae）, 其形態(tài)特征為：營(yíng)養(yǎng)菌絲呈黃橙色，氣生菌絲呈白色或粉紅色，孢子絲直、有鉤、緊圈，分生孢子呈桿狀至卵圓。新霉素發(fā)酵工藝要點(diǎn)： 種子培養(yǎng)基由淀粉、葡萄糖、花生餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨組成。調(diào)pH7.5，再加入碳酸鈣, 35 培養(yǎng)3040小時(shí)； 發(fā)酵培養(yǎng)基以秈米粉酶解液及葡萄糖為主要碳源，以花生餅粉、黃豆

40、餅粉、液胨、酵母粉、硫酸銨為主要氮源，于35發(fā)酵約10天； 還原糖（維持在1.01.5）作為控制加糖量的參數(shù)。當(dāng)氨氮低于15mg100ml時(shí)應(yīng)及時(shí)添加硫銨（每次0.05左右），補(bǔ)料宜少量多次。發(fā)酵中途(約110小時(shí))補(bǔ)加酵母粉次。4.卡那霉素卡那霉素是1975年由日本梅澤教授發(fā)現(xiàn)的多組分氨基糖苷類抗生素，是一種廣譜抗生素，其抗菌譜與慶大霉素相似，但活性比慶大霉素小46倍，對(duì)耐鏈霉素的結(jié)核桿菌也有抑制作用。卡那霉素產(chǎn)生菌是卡那鏈霉菌。我國(guó)生產(chǎn)所用的菌種是1965年從云南西雙版納土壤中分離得到的?？擎溍咕臓I(yíng)養(yǎng)菌絲呈黃色或秸稈色，氣生菌絲呈白色、為黃色和微綠色，孢子絲直或柔曲。 卡那霉素發(fā)酵工藝

41、要點(diǎn)： 酵培養(yǎng)基為淀粉、葡萄糖、黃豆餅粉、麥芽粉、淀粉酶、硝酸鈉、硫酸鋅等； 隔24 h補(bǔ)水次，共約次（總量為發(fā)酵液的2028）； 種子培養(yǎng)于27 培養(yǎng)4050 h，通氣量；。發(fā)酵則為2728 ，100110 h，邐氣量：0.8。（六）四環(huán)類抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán)類抗生素是母核為四并苯的一族化合物，其中由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的品種主要有四環(huán)素、土霉素、金霉素和去甲基金霉素(圖8 4)。四環(huán)類抗生素屬?gòu)V譜抗生素，能抑制多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌，某些立克次氏體、較大的病毒和一部分原蟲，早已普遍應(yīng)用于醫(yī)療上，世界各地均有大規(guī)模生產(chǎn)。 圖11 4 四環(huán)類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu) 四環(huán)素； 土霉素； 金霉素； 去甲基金

42、霉素金霉素和四環(huán)素產(chǎn)生菌都是金色鏈霉菌。金色鏈霉菌在馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)時(shí)，營(yíng)養(yǎng)菌絲分泌金黃色色素，氣生菌絲無(wú)色，孢子由白色 棕灰色 灰黑色，孢子鏈狀、圓形或橢圓形。1948年杜蓋爾(Dugger)首次分離到該菌，金霉素發(fā)酵單位只有165U/ml。后來(lái)發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中加入抑氯劑后，該菌也能產(chǎn)生95左右的四環(huán)素。經(jīng)過不斷的菌種選育和工藝優(yōu)化。目前四環(huán)素的發(fā)酵單位已達(dá)到30000U/ml左右。除金色鏈霉菌外，生綠鏈霉菌(S. viridifaciens)和佐山鏈霉菌(S. sayamaensis)等也能產(chǎn)四環(huán)素。 土霉素產(chǎn)生菌為龜裂鏈霉菌，于1950年首次篩選出來(lái)。龜裂鏈霉菌菌落灰白色，后期生皺褶，

43、呈龜裂狀。菌絲呈樹枝狀分枝，白色，孢子灰白色，柱形。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的菌種選育和工藝條件的優(yōu)化，發(fā)酵單位也已達(dá)到30000U/ml的水平。另發(fā)現(xiàn)淡黃色鏈霉菌（S. gilbus ）和圈環(huán)鏈霉菌（S. armillatus）也能產(chǎn)生土霉素。 四環(huán)類抗生素的種子擴(kuò)大培養(yǎng)依發(fā)酵規(guī)模分為一級(jí)種子和二級(jí)種子。培養(yǎng)基要求氮源豐富，以利菌絲大量增殖，一般以蛋白胨，花生餅粉、淀粉為主料。一級(jí)種子接入孢子懸浮液后，于3032通氣攪拌培養(yǎng)約24 h即可。 發(fā)酵培養(yǎng)基常用碳源為淀粉，葡萄糖、糖蜜及油脂等，氮源常用：花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿、脲素、硫胺等,各種無(wú)機(jī)鹽類適量加入。四環(huán)素發(fā)酵需添加抑氯劑溴化鈉和2巰基苯駢噻唑

44、，另再加微量硫氰化芐（BTG），可使四環(huán)素比例提高。發(fā)酵溫度一般采用2832，生物合成四環(huán)素的最適pH為5.86.0，前期長(zhǎng)菌最適pH為6.06.8。(七) 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是以一個(gè)大內(nèi)酯環(huán)（其大小有12、14、16、17、18、和20元等）為母核，通過糖苷鍵與13個(gè)糖分子(中性糖和氨基糖)相連接的一類抗生素(圖85)。自從1950年Brockmann報(bào)道了第一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯抗生素苦霉素以來(lái)，至今已發(fā)現(xiàn)了幾百種，已經(jīng)確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的也已有100多種，是三大類抗生素之一。紅霉素最早被用于臨床，隨后碳霉素、酒霉素、竹桃霉素、螺旋霉素、柱晶霉素、麥迪霉素等相繼被廣泛用于臨床。 大環(huán)內(nèi)酯類

45、抗生素能夠抑制許多革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌，但其抑菌活性依不同類型而差異較大，其中十六元大環(huán)內(nèi)酯抗生素的活性最強(qiáng)。許多品種對(duì)耐青霉素的葡萄球菌和支原體有效，某些品種對(duì)螺旋體、立克次氏體和巨大病毒有效，個(gè)別品種還具有抗原蟲的作用，而多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素對(duì)許多致病真菌（酵母菌、霉菌及皮膚癬菌）有不同的抑制和殺滅作用。已發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的微生物中，絕大部分是鏈霉菌屬, 小部分是小單孢菌屬。 圖11 5 紅霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)1. 紅霉素紅霉素是1952年從紅色鏈霉菌培養(yǎng)液中分離出來(lái)的一種堿性抗生素。紅霉素的毒性和副作用極為少見，也很少出現(xiàn)過敏反應(yīng)，它是治療耐青霉素及其它廣譜抗生素的病原菌感染首選藥物，

46、而且對(duì)葡萄球菌引起的各種感染具有一定特效。 紅色鏈霉菌生長(zhǎng)擴(kuò)展，有不同規(guī)則的邊緣，菌絲深入培養(yǎng)基內(nèi)，菌絲初始白色，后變?yōu)槲ⅫS色,菌落周圍白色乳狀，氣生菌絲細(xì)，有分枝。 有研究結(jié)果表明，紅霉素高產(chǎn)菌株對(duì)正丙醇的利用率比低產(chǎn)菌株高45倍，且對(duì)正丙醇的利用速度和紅霉素的生成速度都較快，能使約45的正丙醇結(jié)合到紅霉內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中，而低產(chǎn)菌株只能結(jié)合15。這對(duì)選育紅霉素高產(chǎn)菌株的工作很有參考價(jià)值。此外，也曾報(bào)道菌株表現(xiàn)出一定的培養(yǎng)特征，如孢子顏色由白色到粉紅色，或在瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生米色至淡橙色色素等，似乎也與紅霉素的生物合成有關(guān)。 紅霉素的發(fā)酵工藝要點(diǎn)： 發(fā)酵培養(yǎng)基成分由淀粉、葡萄糖、黃豆餅粉、玉米漿、硫酸

47、銨、磷酸二氫鉀和碳酸鈣組成。發(fā)酵過程加入丙酸成丙醇作為前體以提高紅霉素的產(chǎn)量。 培養(yǎng)條件的控制：發(fā)酵通氣量一般為：0.81.2，發(fā)酵溫度為31，pH維持在6.67.2。發(fā)酵過程還原糖控制在1.21.5，每隔h補(bǔ)加次葡萄糖。有機(jī)氮一般每天補(bǔ)次，前體般在2436 h后補(bǔ)入，每隔24 h加一次，全程45次（總量0.70.8）。若發(fā)酵后期采用滴加氨水工藝，有利于提高發(fā)酵單位。2. 柱晶白霉素、麥迪霉素和螺旋霉素 柱晶白霉素、 麥迪霉素和 螺旋霉素是目前已投入工業(yè)化生產(chǎn)并廣泛用于臨床的三種重要的十六元大環(huán)內(nèi)酯抗生素，它們的產(chǎn)生菌分別為北里鏈霉菌. 生米加鏈霉菌和生二素鏈霉菌。二、半合成抗生素的酶促生產(chǎn)

48、半合成抗生素研究的目的在于通過酶法或化學(xué)法修飾原抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，改進(jìn)天然抗生素的性能，包括克服耐藥性、增強(qiáng)抗菌活性、擴(kuò)展抗菌譜、改善藥代動(dòng)力學(xué)性能、降低毒副反應(yīng)、增強(qiáng)穩(wěn)定性以及適應(yīng)制劑要求等諸方面，從而創(chuàng)制出具有新特點(diǎn)的半合成抗生素?？v觀各年代新上市的醫(yī)用抗生素，其中半合成與合成的抗生素所占的比例在逐年上升。例如，在50年代僅約占10，60年代就增至50，到了80年代已高達(dá)90。而自1990年至今，上市的19個(gè)新品種全都是合成和半合成的抗生素。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)獲得的各種天然抗生素，則為半合成抗生素提供了重要的原料藥，而半合成抗生素的研究開發(fā)又成為新型抗生素來(lái)源的最重要途徑之一?？梢哉J(rèn)為，

49、如果沒有半合成抗生素的出現(xiàn)，很難想象會(huì)有微生物藥物的今天。(一) 半合成新青霉素的酶促生產(chǎn) 青霉素的?；鶄?cè)鏈雖不具決定抗菌活力構(gòu)效，但它卻對(duì)青霉素的抗菌強(qiáng)度、抗菌譜的范圍、對(duì)青霉素酶的穩(wěn)定性強(qiáng)弱、對(duì)血液中有效濃度的持久性、對(duì)酸穩(wěn)定性以及溶解度等理化性質(zhì)起著非常重要的作用。因此，可通過對(duì)?；鶄?cè)鏈的改造，獲得性質(zhì)更優(yōu)，療效更高的半合成青霉素。半合成法制新青霉素的步驟為： 由微生物發(fā)酵法獲得青霉素G或V；采用酶法水解青霉素G或V制備青霉素6APA母核；采用酶法將?；鶄?cè)鏈聯(lián)結(jié)到6APA母核上。1. 青霉素?；?青霉素?；福╬enicillin acylase）能水解青霉素成為6APA。該酶可分為三

50、型酶：型為細(xì)菌產(chǎn)生，適宜于水解青霉素G；型為放線菌或真菌產(chǎn)生，適于酶水解青霉素V； 型為假單胞菌產(chǎn)生，適于氨芐青霉素水解。青霉素?；付际强赡婷?，一般在堿性條件下催化青霉素水解成6APA母核和?；鶄?cè)鏈，而在酸性條件下又可催化6APA與?；鶄?cè)鏈的縮合即?；▓D8 6）。不同來(lái)源的微生物酶其催化條件（pH、溫度）是不同的（圖8 7）。圖11 6 青霉素?；复呋馀c?；磻?yīng) 圖11 7 各種來(lái)源微生物?；傅牟煌呋瘲l件 2. 酶法制備6-APA母核 酶法催化青霉素水解制備6APA母核的方式可直接采用細(xì)菌的細(xì)胞、真菌的孢子或菌絲體、粗酶或純酶?，F(xiàn)在大多采用固定化活細(xì)胞或固定化酶法來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。

51、(1) 菌體懸浮法（大腸桿菌?；笧槔┡囵B(yǎng)大腸桿菌并誘導(dǎo)產(chǎn)酶 殺滅活菌體 分離收集菌體 菌體（約10）懸浮于2%青霉素G溶液中 水解反應(yīng)（pH8.0, 40） 分離除去菌體（可重復(fù)用） 得水解液 加明礬除去蛋白質(zhì) 減壓濃縮 加乙酸丁酯萃取苯乙酸 調(diào)pH4結(jié)晶析出6APA（產(chǎn)率一般為70% 80%）。 (2) 固定化酶法將菌體破碎 提純釋放出的?；?吸附或結(jié)合在一種固體載體（如葡聚糖凝膠）上 固相酶裝入柱反應(yīng)器 用12青霉素溶液進(jìn)行循環(huán)反應(yīng) 分離水解產(chǎn)物6APA 精制。 (3) 固定化活細(xì)胞法培養(yǎng)好的菌體細(xì)胞不經(jīng)過破碎和提純酶的過程而直接固定化（如采用包埋法），?；副４嬖谕暾麅?nèi)，直接作用

52、青霉素溶液，水解后分離產(chǎn)物。該法優(yōu)點(diǎn)是省去分離純化酶，酶活損失小，酶在細(xì)胞內(nèi)較穩(wěn)定。缺點(diǎn)是由此法生產(chǎn)的青霉素產(chǎn)品中含有少量青霉噻唑酸蛋白，易引起過敏反應(yīng)。4. 酶法制半合成青霉素 （1）菌體懸浮法 方法與前類同。利用微生物產(chǎn)生的青霉素?；复呋饔玫目赡嫘裕?APA母核在酸性條件下與側(cè)鏈羧酸結(jié)合成新青霉素。例如: 在3537.pH6.06.5磷酸緩沖液中、6APA與-氨基苯乙酸甲酯在E.coli?；复呋拢s合生成氨芐青霉素, 轉(zhuǎn)化率在60%以上（圖8 8）。若將側(cè)鏈供體改為-氨基對(duì)羥基苯乙酸甲脂，則在酰化酶催化下，縮合生成羥氨芐青霉素。圖11 8 酶法制備氨芐青霉素 不同微生物來(lái)源的青霉

53、素?；笇?duì)不同結(jié)構(gòu)底物的親和力不同，據(jù)此可簡(jiǎn)化工藝，降低成本。例如改用黑素假單胞菌產(chǎn)生的 = 3 * ROMAN III型?；?，則青霉素G水解成6APA與苯乙酸后，兩者不必分離，就可直接將-氨基苯乙酸甲酯加到混合裂解液中，此時(shí)，該酶只催化合成氨芐青霉素，而不產(chǎn)生青霉素G。 由于微生物菌體有時(shí)會(huì)產(chǎn)生青霉素酶破壞合成的新青霉素，故采用?；敢话阈杓尤肭嗝顾孛敢种苿┼?二氮雜菲或硫脲，也可選育缺失青霉素酶的變異株。(2) 固定化酶或固定化細(xì)胞法 固定化酶或固定化活細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用，使利用微生物產(chǎn)生青霉素?；竵?lái)合成新青霉素的生產(chǎn)獲得了新的發(fā)展。例如將由環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)生的青霉素?；柑崛『?，先用琥珀酸

54、酸酐?；倥cDEAE葡聚糖凝膠結(jié)合形成固定化酶，此固定化?；赣糜诎逼S青霉素的酶促合成可連續(xù)使用10次；又如將巨大芽孢桿菌或色素桿菌變種的活細(xì)胞吸附在DEAE纖維素上制成固定化細(xì)胞，裝填于柱反應(yīng)器后可用于連續(xù)反應(yīng)生產(chǎn)氨芐青霉素。5. 半合成青霉素的研究與發(fā)展動(dòng)向 目前在臨床上應(yīng)用的青霉素類抗生素只有青霉素G和V是天然產(chǎn)物,其余都是半合成的。半合成新青霉素的研究與發(fā)展動(dòng)向主要有下面幾個(gè)方面：(1) 增加對(duì)青霉素結(jié)合蛋白的親和力，以擴(kuò)展抗菌譜和提高抗菌活性。例如BRL44454是引入了2氨基噻唑肟基的新型青霉素,它對(duì)青霉素結(jié)合蛋白PBP2（G菌）有較高的親和力,抗耐藥金葡菌活性強(qiáng)，是廣譜的新青霉

55、素。(2) 增強(qiáng)對(duì)內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性。例如Temocillin、Formidacillin和BRL44154等半合成新青霉素對(duì)各種內(nèi)酰胺酶均較穩(wěn)定。(3) 應(yīng)用前藥原理，改善青霉素的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和在體內(nèi)的吸收。例如BRL20330的血藥濃度比原藥（Temocillin）明顯提高，半衰期延長(zhǎng)達(dá)6 h，且具有長(zhǎng)效作用。又如Lenampicillin口服吸收良好，在體內(nèi)抗菌作用比氨芐青霉素強(qiáng)24倍，血藥濃度明顯提高，半衰期明顯延長(zhǎng)。(4) 根據(jù)菌酶各個(gè)擊破的原理，研究開發(fā)青霉素與內(nèi)酰胺酶抑制劑的合劑。例如羥氨芐青霉素加克拉維酸、氨芐青霉素加青霉烷砜、哌拉西林加他佐巴坦（Tazobactan）、阿莫西

56、林加BRL42715等，并不斷尋找具有特色的高效內(nèi)酰胺酶抑制劑。(二) 半合成頭孢菌素的酶促生產(chǎn)頭孢菌素C的抗菌活力與青霉素G相比是很低的。試驗(yàn)表明若以青霉素G的側(cè)鏈苯乙酰基取代頭孢菌素C的側(cè)鏈，則抗菌作用比頭孢菌素C大100倍。因此設(shè)法除去頭孢菌素C的側(cè)鏈，制取其母核7氨基頭孢霉烷酸（7Aminocephalosporanic Acid , 簡(jiǎn)稱7ACA），然后在母核上再接入新的側(cè)鏈，是獲得具有更高療效半合成頭孢菌素的有效途徑。1. 母核7ACA的酶解制備和直接發(fā)酵生產(chǎn) 7ACA母核過去一直采用化學(xué)脫?；▉喯跛崧确ɑ蚬桴シǎ┯深^孢菌素裂解制備。年代未，開始了酶法水解制備ACA新工藝，即采用

57、假單胞菌產(chǎn)生的?；复呋^孢菌素直接水解生成ACA母核，但轉(zhuǎn)化率較低。后來(lái)小松等人分別將假單胞菌83和缺陷假單胞菌22產(chǎn)生的酰化酶基因克隆到頭孢菌素產(chǎn)生菌中，使該菌在產(chǎn)生頭孢菌素的同時(shí)，將部分頭孢菌素脫酰基生成ACA，從而開創(chuàng)了直接發(fā)酵法生產(chǎn)ACA的種可能途徑。2. 母核7-ADCA的酶解法制備 用化學(xué)擴(kuò)環(huán)法可以將青霉素G或V轉(zhuǎn)變?yōu)轭^孢菌素（五環(huán)擴(kuò)展為六環(huán)），且酰化酶更易催化此類頭孢菌素水解。水解產(chǎn)物為青霉素G或V的側(cè)鏈產(chǎn)物苯乙酸或苯氯乙酸和母核7氨基3去乙酰氧基頭孢菌素（7Aminodeacetoxycephalosporanic Acid,簡(jiǎn)稱7ADCA）。 能產(chǎn)生頭孢菌素?；傅奈⑸镉?/p>

58、巨大芽孢桿菌、粘分節(jié)孢子桿菌、天南星歐文氏菌等多種菌類。一般采用固定化?；阜ㄟM(jìn)行水解反應(yīng)，其過程大致為：培養(yǎng)巨大芽孢桿菌 提取?；?次乙酰塑料或硅藻土吸附酶 洗滌、裝填柱式反應(yīng)器 底物上柱反應(yīng) 收集流出液 制取7ADCA母核。3. 酶法制取半合成新頭孢菌素（1）固定化酶法該法與半合成青霉素的制取方法相似。以-乙酸甲酯噻吩與7ACA縮合為頭孢菌素為例 ，其大致過程為：吸附有?；福ň薮笱挎邨U菌產(chǎn)生）的次乙酰塑料（或硅藻土鋁鹽）載體 裝入反應(yīng)柱 含側(cè)鏈和7ACA的緩沖液通過反應(yīng)柱 收集流出液（約857ACA被酶?；?制取結(jié)晶頭孢菌素I號(hào)（即先鋒霉素號(hào)）。 (2) 固定化細(xì)胞法以-氨基苯乙酸

59、甲酯?；?ADCA母核上，合成頭孢氨芐（即先鋒霉素號(hào)）為例（圖8 9）：將色素桿菌變種或巨大芽孢桿菌或大腸桿菌的活細(xì)胞與DEAE纖維素結(jié)合并吸附于羥基磷灰石上，也可將活細(xì)胞包埋于三醋酸纖維素中實(shí)現(xiàn)固定化，反應(yīng)底物與固定化細(xì)胞進(jìn)行酶促合成反應(yīng)，從而制得頭孢氨芐（先鋒號(hào)）。 圖11 9 頭孢氨芐（先鋒號(hào)）的酶促合成 (母核為7-ADCA )4. 半合成頭孢菌素的研究與發(fā)展動(dòng)向 80年代末，頭孢菌素已由第一代發(fā)展到第三代，如頭孢噻肟（CTX）、頭孢哌酮（CPZ）、頭孢三嗪（CRO）、頭孢他啶（CAZ）等，與早期品種相比，具有抗菌譜廣、抗菌活性高，對(duì)內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定以及在藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)方面大大改善的特

60、點(diǎn)。但現(xiàn)有第三代頭孢菌素在抗菌性能方面仍存在著一些缺點(diǎn)，主要是：(1) 抗革蘭氏陽(yáng)性菌的作用較差；（2）對(duì)銅綠假單胞菌及厭氧菌的作用仍不理想；（3）半衰期不夠長(zhǎng)，劑量較大；（4）一般都需注射給藥；（5）成本較高，價(jià)格昂貴；（6）有時(shí)會(huì)引起凝血功能障礙。 針對(duì)上述缺點(diǎn)，從80年代初以來(lái)，研究開發(fā)了很多新的半合成頭孢菌素。近年來(lái)研究的主要?jiǎng)酉驗(yàn)椋?1) 進(jìn)一步擴(kuò)展抗菌譜, 研制新一代高效衍生物。例如Ceftazidime是氨噻肟唑類衍生物, 對(duì)銅綠假單胞菌有高效, 人們稱之為第四代頭孢菌素。(2) 進(jìn)一步發(fā)展長(zhǎng)效頭孢菌素, 目的在于降低劑量, 節(jié)約治療費(fèi)用。例如頭孢曲松、Monocid、SKF88