1、發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)*第1頁(yè)，共48頁(yè)。常用發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)簡(jiǎn)介顯微鏡技術(shù) (成像imaging);組織切片技術(shù) (經(jīng)典解剖形態(tài)學(xué)morphology);生化分子生物學(xué);原位雜交技術(shù) (in situ hybridization);顯微注射;報(bào)告基因技術(shù);細(xì)胞標(biāo)記技術(shù);*第2頁(yè)，共48頁(yè)。顯微鏡技術(shù)目的：觀察胚胎個(gè)體分類(lèi)： 光學(xué)(optical)顯微鏡: 體視顯微鏡: 組織分離用 熒光顯微鏡：*第3頁(yè)，共48頁(yè)。顯微鏡技術(shù)激光共聚焦顯微鏡 (laser confocal)：熒光標(biāo)記，對(duì)胚胎或細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或mRNA的分布進(jìn)行定性或定量研究；圖像采集的效果很好；細(xì)胞或組織的三維重塑 (rec

2、onstructing)*第4頁(yè)，共48頁(yè)。組織切片技術(shù)目的：觀察胚胎的內(nèi)部組織學(xué)結(jié)構(gòu)分類(lèi)： 石蠟組織切片：石蠟包埋，切片機(jī)切片 冷凍切片：低溫包埋劑包埋，低溫切片機(jī)切片，對(duì)樣品中核酸的保存較好，但切片的質(zhì)量差。*第5頁(yè)，共48頁(yè)。分子生物學(xué)技術(shù)目的：檢測(cè)目的基因或蛋白質(zhì)在某一發(fā)育時(shí)期或特定組織中的表達(dá)分類(lèi)： Polymerase chain reaction (PCR): DNA amplification Real-time quantitative PCR: RNA 定量 RT-PCR/Northern blotting: mRNA expression Western blotting

3、: protein expression 免疫共沉淀 (Co-IP): protein-protein interaction*第6頁(yè)，共48頁(yè)。Northern Blotting Analysis*第7頁(yè)，共48頁(yè)。Southern Blotting Analysis*第8頁(yè)，共48頁(yè)。Real-time PCR 儀*第9頁(yè)，共48頁(yè)。原位雜交技術(shù)目的：檢測(cè)某一特定基因mRNA在某胚胎和組織中的分布情況分類(lèi)： 放射性標(biāo)記探針：放射自顯影 非放射性標(biāo)記探針： 地高辛(DIG)-免疫組化 熒光素-熒光免疫組化 (FISH)*第10頁(yè)，共48頁(yè)。原位探測(cè)基因表達(dá) Gene expressing g

4、uiding development When and where particular genes are active Intact embryos or sections of embryosIn situ hybrid: probes-radioactive isotope, fluorescence tag or an enzymeDectection: autoradiography, fluorescence microscope, enzyme-substrate reaction*第11頁(yè)，共48頁(yè)。原位探測(cè)基因表達(dá)*第12頁(yè)，共48頁(yè)。原位探測(cè)基因表達(dá)Distributio

5、n of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian egg. In situ hybridization with a radioactive probe. (yellow signals)*第13頁(yè)，共48頁(yè)。原位探測(cè)基因表達(dá)*第14頁(yè)，共48頁(yè)。利用原位雜交技術(shù)研究基因表達(dá)的時(shí)空譜mRNA的檢測(cè)*第15頁(yè)，共48頁(yè)。FISH 探測(cè)基因表達(dá)*第16頁(yè)，共48頁(yè)。報(bào)道基因 (reporter gene) 技術(shù)目的：用于啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的分析研究。采用一些產(chǎn)物易于檢測(cè)的基因(報(bào)道基因)與待研究的表達(dá)調(diào)控序列串聯(lián)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入胚胎體內(nèi)，分

6、析報(bào)道基因產(chǎn)物的表達(dá)來(lái)研究目的片斷的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。常用報(bào)道基因分類(lèi)： 綠色熒光蛋白 (GFP): 分布用熒光顯微鏡觀察 lacZ基因: 編碼 -半乳糖苷酶, 用特異底物顯色研究其產(chǎn)物分布 熒光素酶 (luciferase): 常用體外基因表達(dá)活性分析，近年開(kāi)始體內(nèi)研究*第17頁(yè)，共48頁(yè)。啟動(dòng)子活性檢測(cè)法表達(dá)載體的構(gòu)建：*第18頁(yè)，共48頁(yè)。利用大分子間的相互作用克隆新的基因鑒定可與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列分離靶蛋白質(zhì)，（可采用gel-shift assay)克隆靶蛋白的表達(dá)基因。利用DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用*第19頁(yè)，共48頁(yè)。分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法利用蛋白質(zhì)之間的相互作用酵母雙雜交法

7、*第20頁(yè)，共48頁(yè)。顯微注射及細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)目的：將外源DNA、RNA或標(biāo)記物等導(dǎo)入早期胚胎細(xì)胞中，如運(yùn)用細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)對(duì)胚胎早期卵裂球分化命運(yùn)圖譜的研究。在小鼠和果蠅中常用于轉(zhuǎn)基因分析。細(xì)胞標(biāo)記物分類(lèi)： 早期：活體染料如尼羅藍(lán)或中性紅，不能標(biāo)記胚胎內(nèi)部組織 現(xiàn)在：細(xì)胞外-親脂性熒光染料如DiI/Dio，不適于組織切片 細(xì)胞內(nèi)-熒光標(biāo)記葡聚糖和HRP，需顯微注射，通過(guò)熒光顯微鏡或組織化學(xué)方法進(jìn)行定位。 示蹤基因：GFP和LacZ基因*第21頁(yè)，共48頁(yè)。染料細(xì)胞標(biāo)記*第22頁(yè)，共48頁(yè)。熒光細(xì)胞標(biāo)記*第23頁(yè)，共48頁(yè)。細(xì)胞移植*第24頁(yè)，共48頁(yè)。DNA/蛋白芯片目的：高通量篩選不同胚胎細(xì)胞或

8、組織中基因/蛋白表達(dá)圖譜，獲得不同時(shí)期或組織差異表達(dá)的基因或蛋白。 DNA chip Protein chip microRNA chip分類(lèi)：*第25頁(yè)，共48頁(yè)。*第26頁(yè)，共48頁(yè)。應(yīng)用DNA microarrays 研究基因表達(dá) High output screening genes expressed differently in different tissues or at different stages in development*第27頁(yè)，共48頁(yè)?；蚪M時(shí)代：人類(lèi)基因組計(jì)劃控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測(cè)方法*第28頁(yè)，共48頁(yè)。后基因組時(shí)代功能基因組時(shí)代空間結(jié)構(gòu)

9、？胞內(nèi)分布及靶位？影響器官？基因類(lèi)型？底物？影響途徑？*第29頁(yè)，共48頁(yè)。發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù) 發(fā)育生物學(xué)基本任務(wù)之一：研究基因在胚胎發(fā)育中的作用正向遺傳學(xué)技術(shù)：大規(guī)模隨機(jī)誘變，產(chǎn)生發(fā)育異常的突變個(gè)體，然后再尋找突變的基因。 1. 大規(guī)模誘變篩選; 2. 插入誘變篩選; 3. 突變基因的克隆;從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因*第30頁(yè)，共48頁(yè)。從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因 自然群體中的突變體； 化學(xué)誘變劑處理，如亞硝基乙脲乙亞硝基脲 (N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)； 外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、轉(zhuǎn)座

10、子利用等； X射線或 r射線照射獲得突變體的方法*第31頁(yè)，共48頁(yè)。自發(fā)突變 (spontaneous mutation)Recessive mutation (純合體狀態(tài)) /Dominant (雜合體狀態(tài)) /semi-dominant*第32頁(yè)，共48頁(yè)。自發(fā)突變 (spontaneouse mutation)semi-dominant mutation (半顯性突變)*第33頁(yè)，共48頁(yè)。斑馬魚(yú)上ENU化學(xué)突變研究的成就(1996)從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因化學(xué)誘變法*第34頁(yè)，共48頁(yè)。大規(guī)模誘變篩選通過(guò)射線或化學(xué)誘變劑處理父本個(gè)體，在其生殖系細(xì)胞中產(chǎn)生隨機(jī)突變，然

11、后與wild-type母本個(gè)體雜交，F(xiàn)1個(gè)體中可能攜帶有基因突變。F1與野生型，F(xiàn)2 (50% 雜合突變體)群體內(nèi)雜交，F(xiàn)3 (25%)可出現(xiàn)純合突變個(gè)體，發(fā)育異常*第35頁(yè)，共48頁(yè)。DNA插入誘變法*第36頁(yè)，共48頁(yè)。反轉(zhuǎn)錄病毒插入引起的突變的鑒定DNA插入誘變法*第37頁(yè)，共48頁(yè)。大規(guī)模誘變篩選突變后的表型改變： 致死性 功能喪失：最常見(jiàn)。突變后的蛋白質(zhì)比野生型活性差；某一蛋白質(zhì)完全失活的突變?yōu)闊o(wú)效突變 (null mutation) 功能獲得：如某些受體突變后活化*第38頁(yè)，共48頁(yè)。插入誘變篩選利用轉(zhuǎn)座子(transposon)或病毒載體做誘變劑。果蠅中為P-因子，可以隨即插入基

12、因組中，并可以在基因組中移動(dòng)，包括特殊序列和轉(zhuǎn)座酶，后代生殖細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座酶就會(huì)誘導(dǎo)P-因子在基因中隨即轉(zhuǎn)座造成基因突變。*第39頁(yè)，共48頁(yè)。突變基因的克隆突變體獲得后，克隆引起該突變的基因 插入突變：利用P-因子序列作為探針，從突變體文庫(kù)中篩選出含P-因子的克隆，從而確定其插入點(diǎn)及被阻斷的基因。 化學(xué)誘變或射線突變：定位克隆 (positional cloning)根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因分離的。通過(guò)分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來(lái)確定突變基因的染色體位置。常用的分子標(biāo)記包括單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)。*第40頁(yè)，共48頁(yè)。Positional cloning: 1) 確

13、定突變基因的染色體定位2) 獲取該片斷的基因組序列：數(shù)據(jù)庫(kù)3) 生物信息學(xué)確定該片段可能含有的基因，結(jié)合其可能的功能和該突變體的表型，確定候選基因4) 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：功能異常，野生型rescue, RNAi*第41頁(yè)，共48頁(yè)。發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù)反向遺傳學(xué)技術(shù)：通過(guò)功能喪失 (loss of function) 或功能獲得 (gain of function) 實(shí)驗(yàn)，研究胚胎個(gè)體所產(chǎn)生的表型而分析目的基因的功能。 基因修飾 1. 基因敲除; 2. 條件基因敲除; 3. 轉(zhuǎn)基因;*第42頁(yè)，共48頁(yè)。Constructing knockout mice獲得攜帶有特定基因突變個(gè)體的技術(shù)，研究基因在發(fā)育中功

14、能的重要方法。1) 構(gòu)建用于基因重組的突變基因結(jié)構(gòu)2) 重組基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞 (ES)3) 注射ES入胚胎中以獲得雜合性小鼠4) 小鼠雜交獲得純合體小鼠并進(jìn)行表型分析。*第43頁(yè)，共48頁(yè)。Conditional knockout僅使靶基因在特定的組織或發(fā)育時(shí)期失活。Cre-lox 系統(tǒng) 1) Cre編碼一種重組酶，可識(shí)別并結(jié)合位點(diǎn)并切除位于兩個(gè)LoxP 位點(diǎn)之間的序列。2) 兩個(gè)品系：靶基因兩側(cè)都加入LoxP 位點(diǎn); 轉(zhuǎn)入由組織特異性啟動(dòng)子控制的cre基因3) 小鼠雜交， cre基因會(huì)在特異性組織中表達(dá)，切除靶基因，使之失活。*第44頁(yè)，共48頁(yè)。Transgenic technique1

15、) 將外源基因注射到受精卵的細(xì)胞核中， 缺點(diǎn)是無(wú)法控制外源基因的插入情況， 只能通過(guò)后代檢查DNA。2) 將外源基因轉(zhuǎn)化到ES中，同gene knockout3) 小鼠雜交。*第45頁(yè)，共48頁(yè)。發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù)反向遺傳學(xué)技術(shù)： 通過(guò)抑制性因子抑制目的基因的功能 1. RNA干擾; 2. 嗎啉代寡聚核苷酸 (MO): 利用反義寡聚核苷酸抑制特定mRNA (5-UTR) 的翻譯而阻斷目的基因功能的方法。主要應(yīng)用在斑馬魚(yú)和爪蟾研究中，但現(xiàn)在也用于miRNA研究中。 *第46頁(yè)，共48頁(yè)。RNAi 技術(shù)1) 雙鏈RNA抑制含其同源序列基因的表達(dá)，抑制基因表達(dá)的新方法2) 線蟲(chóng)中：直接導(dǎo)入dsRNA; 脊椎動(dòng)物中siRNA (21-23 nt)*第47頁(yè)，共48頁(yè)。發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù)反向遺傳學(xué)技術(shù)： 其它手段