1、深部真菌感染的非培養(yǎng)(piyng)診斷進(jìn)展北京大學(xué)第一醫(yī)院北京大學(xué)真菌和真菌病研究(ynji)中心余 進(jìn)共六十一頁(yè)AIDS插管等侵襲性治療腫瘤和免疫抑制治療骨髓和實(shí)體器官移植廣譜抗生素治療 侵襲(qnx)性真菌感染率上升共六十一頁(yè)+600%+300%+300%Martin et al, NEJM 2003;348:1546深部真菌感染(gnrn)不斷增加共六十一頁(yè)國(guó)內(nèi)深部真菌(zhnjn)感染不容忽視劉正印等，中華(Zhnghu)醫(yī)學(xué)雜志2003年3月第83卷第5期共六十一頁(yè)國(guó)內(nèi)情況(qngkung)我院血液科(2004.5-2005.5共118例患者(hunzh)確診和臨床診斷有7例,發(fā)生率

2、為5.9%以血液病為主的深部真菌感染高?；颊咧?，發(fā)生感染的危險(xiǎn)因素有2種及2種以上廣譜抗生素應(yīng)用、念珠菌菌落定植和應(yīng)用尿管，其中廣譜抗生素應(yīng)用是最主要的危險(xiǎn)因素 共六十一頁(yè)深部真菌(zhnjn)感染條件致病性真菌念珠菌病曲霉病隱球菌(qijn)病其他共六十一頁(yè)對(duì)于(duy)侵襲性真菌感染診斷滯后(zh hu)治療手段有限基礎(chǔ)疾病病死率很高念珠菌血癥若不治療死亡率可以達(dá)到45-76%侵襲性曲霉病死亡率高達(dá)55-70%共六十一頁(yè)診斷(zhndun)方法顯微鏡檢查(jinch)培養(yǎng)血清學(xué)分子生物學(xué)共六十一頁(yè)鏡檢和培養(yǎng)(piyng)方法敏感性低 血培養(yǎng)：在腫瘤和血液病病人中，50%尸檢證實(shí)深部念珠菌感

3、染的病例血培養(yǎng)陰性。培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性?xún)H表示存在某種真菌，區(qū)分定植和感染困難培養(yǎng)時(shí)間(shjin)長(zhǎng)有些標(biāo)本采集困難共六十一頁(yè)非培養(yǎng)(piyng)方法優(yōu)點(diǎn)快速報(bào)告(bogo)結(jié)果敏感性提高取材簡(jiǎn)便多以真菌在致病狀態(tài)產(chǎn)生的物質(zhì)為檢測(cè)標(biāo)志物，結(jié)果陽(yáng)性提示有致病性定量檢測(cè)可判斷感染嚴(yán)重程度及療效評(píng)估共六十一頁(yè)非培養(yǎng)診斷(zhndun)的方法簡(jiǎn)介真菌細(xì)胞壁成分（1-3） - - D-葡聚糖檢測(cè)（G試驗(yàn)(shyn)） 真菌抗原檢查半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原（GM試驗(yàn)) 甘露聚糖(mannan)抗原隱球菌莢膜多糖抗原（乳膠凝集試驗(yàn)）真菌特異的代謝產(chǎn)物D-阿拉伯糖醇真菌 DNA 的檢測(cè)共六十

4、一頁(yè)深部真菌(zhnjn)感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)EORTC/MSG2008修訂版宿主(szh)因素臨床特征病原學(xué)真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理學(xué)檢查血清學(xué)檢查方法（間接證據(jù)）CSF隱球菌抗原陽(yáng)性確診GM-test, G-test臨床診斷Clinical Infectious Diseases 2008; 46共六十一頁(yè)（1-3） - - D-葡聚糖檢測(cè)(jin c)共六十一頁(yè)（1-3） - - D-葡聚糖檢測(cè)(jin c)b1,6glucansb1,3PPL bilayerchitinergosterolb1,3 glucansynthasemannoproteins真菌細(xì)胞壁成份，占50%以上其他微生物、

5、動(dòng)物(dngw)及人的細(xì)胞不含該成份用于侵襲性真菌感染的早期診斷共六十一頁(yè) 方法(fngf)：G試驗(yàn)-葡聚糖可特異性激活鱟（Limulus）變形細(xì)胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱(chēng)G試驗(yàn)。Beta-D-glucan 通過(guò)激活G因子（ Factor G）引起凝集內(nèi)毒素通過(guò)激活C因子（Factor C）引起凝集試劑盒: 祛除(qch)Factor C Glucan 特異共六十一頁(yè)BG檢測(cè)(jin c)的特點(diǎn) 可檢測(cè)多種致病真菌感染念珠菌,曲霉,肺孢子菌,鐮刀(lindo)菌,地霉,組織胞漿菌,毛孢子菌等不能用于檢測(cè)隱球菌和接合菌感染陽(yáng)性結(jié)果代表存在侵襲性真菌感染真菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期釋放量最大 ,可

6、被體內(nèi)葡聚糖酶降解(glucanase)每周檢測(cè)2次共六十一頁(yè)BG檢測(cè)(jin c)用于念珠菌血癥 敏感度為62%-100%，特異度為64%-88%不同種念珠菌感染對(duì)葡聚糖檢測(cè)無(wú)明顯影響白念珠菌,光滑(gung hu)念珠菌, 熱帶念珠菌,克柔念珠菌,季也蒙念珠菌和葡萄牙念珠菌近平滑念珠菌BG水平較低Clin.Infect. Dis. 2005.41:654659.J. Clin. Microbiol. 2005.43:59575962J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013共六十一頁(yè)BG檢測(cè)(jin c)用于念珠菌血癥 BG檢測(cè)敏感度明顯(mngxin)高于M

7、annan檢測(cè)79.6%vs42%陽(yáng)性早于血培養(yǎng)陽(yáng)性和臨床癥狀出現(xiàn)對(duì)于念珠菌血癥, BG檢測(cè)是首選檢查Clin.Infect. Dis. 2005.41:654659.J. Clin. Microbiol. 2005.43:59575962J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013共六十一頁(yè)-（1-3）-D-葡聚糖(BG)檢測(cè)(jin c)用于侵襲性曲霉感染（IPA)敏感度為55%-100%特異度為52%-100%對(duì)于(duy)確診IPA，陽(yáng)性率為85.7-100%高度可疑IPA，陽(yáng)性率為52.4-66%Med. Mycol. 2006.44:51635172J.

8、 Clin. Microbiol. 2008.46:10091013J. Clin. Microbiol. 2005.43:299305共六十一頁(yè)BG檢測(cè)( 陽(yáng)性界值為60pg/mL)和GM（陽(yáng)性界值為1.0）比較(bjio)二者在體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)相似，敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均相同，分別為87.5%、89.6%、70%和96.3%二者聯(lián)合可以提高特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，對(duì)敏感度和陰性預(yù)測(cè)值沒(méi)有影響J Clin Microbiol, 2005, 43:299-305. 侵襲性曲霉感染（IPA) BG檢測(cè)(jin c)與半乳甘露聚糖(GM)檢測(cè)共六十一頁(yè)BG檢測(cè)(jin c)與半乳甘露

9、聚糖(GM)檢測(cè)BG檢測(cè)與GM檢測(cè)敏感度67%vs38%特異度90%vs100%感染曲霉(qmi)種類(lèi)的影響抗真菌藥物應(yīng)用的影響抗生素應(yīng)用的影響共六十一頁(yè)BG檢測(cè)(jin c)對(duì)于(duy)煙曲霉和非煙曲霉感染無(wú)差別OrganismSensitivity,%Specificity,%PPV*,%NPV*,%A. fumigatus n=69618875 79A. non-fumigatus n=3964886488J. Clin. Microbiol. 2008.published online共六十一頁(yè)GM檢測(cè)(jin c)煙曲霉(qmi)感染的敏感性明顯低于非煙曲霉(qmi)感染Organ

10、ismSensitivity,%Specificity,%PPV*,%NPV*,%A. fumigatus n=6913999066A. non-fumigatus n=3949999586J. Clin. Microbiol. 2008.published online共六十一頁(yè)抗真菌治療對(duì)GM檢測(cè)(jin c)的影響抗真菌治療(zhlio)使GM檢測(cè)敏感性下降確診IPA的造血干細(xì)胞移植未接受抗真菌治療，GM試驗(yàn)的敏感度為87.5%接受抗真菌治療，敏感度為20%應(yīng)用卡泊芬凈后，GM值會(huì)出現(xiàn)升高BG檢測(cè)的敏感性與抗真菌治療無(wú)明顯關(guān)系Clin.Infect. Dis. 2005.40:17621

11、769.Clin.Infect. Dis. 2005.41:654659.共六十一頁(yè)抗生素治療對(duì)BG檢測(cè)(jin c)和GM檢測(cè)的影響B(tài)G檢測(cè)假陽(yáng)性(yngxng)與應(yīng)用內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素?zé)o關(guān)Antimicrob. Agents Chemother. 2006.50:34503453.GM檢測(cè)哌拉西林/他唑巴坦導(dǎo)致假陽(yáng)性共六十一頁(yè)IPA的診斷(zhndun)方法BG檢測(cè)(jin c)GM檢測(cè)煙曲霉可能陽(yáng)性率低二者聯(lián)合可以提高檢測(cè)的陽(yáng)性率共六十一頁(yè)BG檢測(cè)(jin c)用于肺孢子菌檢測(cè)BG是肺孢子菌包囊壁的組成成分可釋放入血液(xuy)可用于肺孢子菌檢測(cè)共六十一頁(yè)BG檢測(cè)(jin c)57名PCP患

12、者238名非PCP患者敏感度92%，特異(ty)度86%陽(yáng)性預(yù)測(cè)值0.61，陰性預(yù)測(cè)值0.96界值31.1pg/mLCHEST 2007;131:1173-1180共六十一頁(yè)BG檢測(cè)(jin c)用于PCP診斷敏感度好臨床一致性好數(shù)值升高明顯，甚至(shnzh)高于念珠菌感染PCP( 1,299- 1,151 pg/ml; median, 945 pg/ml)念珠菌血癥 ( 700- 779 pg/ml; median, 447 pg/ml).J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013共六十一頁(yè)（1-3） - - D-葡聚糖(BG)檢測(cè)(jin c)方法Fungi

13、tec-G (Japan)界值為20pg/mL Fungitell(US)界值為60pg/ mL或80pg/mL GKT-5M Set動(dòng)態(tài)(dngti)真菌檢測(cè)試劑盒 (國(guó)內(nèi)金山川公司) 界值為20pg/mL 或50pg/mL 共六十一頁(yè)Fungitec-GTM 20pg/mL41名確診IA患者中有37名陽(yáng)性59名無(wú)真菌感染的腫瘤或結(jié)締組織病的對(duì)照中，無(wú)一例(yl)陽(yáng)性 J Clin Microbiol, 1995, 33:3115-3118 202名發(fā)熱患者敏感度和特異度分別為90%和100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為59%，陰性預(yù)測(cè)值為97% Lancet, 1995,345:17-20.共六十一頁(yè)F

14、ungitellTM 60pg/mL ，80pg/mL60pg/mL 敏感度70%，特異(ty)度87%80pg/mL敏感度64%，特異度92% Clin Infect Dis, 2005, 41:654-659.共六十一頁(yè)GKT-5M Set動(dòng)態(tài)真菌(zhnjn)檢測(cè)試劑盒 對(duì)于侵襲(qnx)性念珠菌感染以健康人做對(duì)照敏感度88.9%, 特異度90.2%陽(yáng)性預(yù)測(cè)值50%, 陰性預(yù)測(cè)值98.7%界值定為13.7pg/ml中國(guó)真菌學(xué)雜志，2007，2（4）：202-206共六十一頁(yè)GKT-5M Set動(dòng)態(tài)真菌(zhnjn)檢測(cè)試劑盒 北京大學(xué)第一醫(yī)院2008年4月至2008年8月住院患者臨床懷疑

15、侵襲性真菌感染(gnrn)的患者98例 50pg/mLBG50pg/mL15例，IFI組7例敏感度63.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值46.7% BG50pg/mL83例，對(duì)照組79例特異度90.8%，陰性預(yù)測(cè)值為95.2% 共六十一頁(yè)假陽(yáng)性(yngxng)問(wèn)題 污染（無(wú)熱源的試管、槍頭和蒸餾水等）血液透析、腹膜透析紗布或其他醫(yī)療(ylio)物品（外科手術(shù)）某些品牌的靜脈制劑（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）抗腫瘤多糖（香菇多糖）某些細(xì)菌敗血癥患者（尤其是鏈球菌敗血癥）假陽(yáng)性與應(yīng)用內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素?zé)o關(guān)對(duì)策: 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)葡聚糖的變化共六十一頁(yè)總結(jié)(zngji)BG檢測(cè)可以早期、快速診斷侵襲性真菌感染，可用于真菌感

16、染早期篩查適用于念珠菌,曲霉,肺孢子菌,鐮刀菌,地霉,組織胞漿菌,毛孢子菌等不能用于檢測(cè)隱球菌和接合菌感染敏感度為64-93%，特異性為90%（國(guó)內(nèi)）與GM試驗(yàn)聯(lián)合可提高陽(yáng)性率2次或2次以上陽(yáng)性可降低假陽(yáng)性率高?；颊?hunzh)建議每周檢測(cè)1-2次共六十一頁(yè)半乳甘露(gnl)聚糖抗原檢測(cè)（GM試驗(yàn)）共六十一頁(yè)GM抗原檢測(cè)(jin c)原理曲霉(qmi)galactomannan antigen 大鼠EBA-2單克隆抗體雙抗夾心法共六十一頁(yè)GM試驗(yàn)(shyn)敏感度為0.71，特異度為0.89血液系統(tǒng)惡性病中，其敏感度和特異度分別(fnbi)為0.7和0.92骨髓移植患者中，其敏感度和特異度分

17、別為0.82和0.86實(shí)體器官移植患者中，敏感度下降到0.22，特異度為0.84成人敏感度和特異度分別為0.62和0.87兒童敏感度和特異度分別為0.89和0.85 ,文章較少（僅有2篇），但是呈現(xiàn)出較高的敏感度和特異度。共六十一頁(yè)假陽(yáng)性(yngxng)哌拉西林/他唑巴坦Gluconate與其它的細(xì)菌或真菌成分有交叉(jioch)反應(yīng) 皮炎芽生菌、黑孢霉、擬青霉、產(chǎn)黃青霉、馬爾尼菲青霉、粉紅單端孢、頭狀地霉等腸道中定植的曲霉釋放GM進(jìn)入血液循環(huán) 谷類(lèi)食物中的GM抗原共六十一頁(yè)曲霉感染檢測(cè)的影響(yngxing)因素半乳甘露聚糖在血中存在時(shí)間短，建議： 高危人群每周至少檢測(cè)2次 結(jié)合影象學(xué)、培養(yǎng)

18、結(jié)果(ji gu)綜合分析診斷結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)界值的確定抗真菌治療情況共六十一頁(yè)GM試驗(yàn)(shyn)試劑盒推薦界值為1.5時(shí)靈敏度為64.7%, 特異度為93.5%連續(xù)(linx)2次1.5為陽(yáng)性靈敏度為63.6%，特異度為85.7% 臨床皮膚科雜志，2005，34（12）：816-817中華內(nèi)科雜志，2006，42（12）：992-995共六十一頁(yè)GM試驗(yàn)(shyn)對(duì)于46例造血干細(xì)胞移植后患者的167份血樣進(jìn)行GM抗原的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)以單次測(cè)定大于1.0，或者連續(xù)(linx)2次大于0.8為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)的靈敏度和特異度均較高，根據(jù)上述界值，該試驗(yàn)的靈敏度為81.8%，特異度為93.3%。 中華

19、醫(yī)學(xué)雜志，2007，28（2）：83-86 共六十一頁(yè)GM界值FDA將界值定為0.5界值從1.5降到0.5敏感度從76.3%升到97.4%- 21%特異(ty)度從97.5%降到90.5%- 7%連續(xù)2次I0.5,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值更好Clin Infect Dis. 2007 共六十一頁(yè)抗真菌治療(zhlio)的影響確診侵襲性曲霉病的造血干細(xì)胞移植未接受抗真菌治療，GM試驗(yàn)(shyn)的敏感度為87.5%接受抗真菌治療，敏感度為20%治療開(kāi)始后半乳甘露聚糖的測(cè)定值會(huì)下降，未見(jiàn)下降意味著治療失敗應(yīng)用卡泊芬凈后，半乳甘露聚糖值會(huì)出現(xiàn)升高共六十一頁(yè)GM in BAL不同人群對(duì)結(jié)果的解釋不同血液系統(tǒng)惡性病、

20、造血(zo xu)干細(xì)胞移植BAL中GM值的升高能夠提高IPA診斷的靈敏度實(shí)體器官移植（肺移植除外）特異度為92.9%,PPV為62.5%無(wú)免疫抑制的ICU患者敏感度為88%，特異度為87%免疫正常的患者和肺移植患者假陽(yáng)性高（菌落定植）對(duì)于無(wú)免疫抑制的患者建議同時(shí)檢測(cè)血液和BAL的GM共六十一頁(yè)隱球菌乳膠凝集(nngj)試驗(yàn)共六十一頁(yè)隱球菌(qijn)LA檢測(cè)莢膜抗原(kngyun)共六十一頁(yè)隱球菌(qijn)乳膠凝集試驗(yàn)多克隆(k ln)IgG抗體敏感性可達(dá)99%共六十一頁(yè)假陰性前帶效應(yīng)解決(jiju)方法：稀釋假陽(yáng)性(yngxng)與類(lèi)風(fēng)濕因子、絲孢酵母菌、DF-1菌感染血清有交叉反應(yīng)解決

21、方法：采用單抗、標(biāo)本前處理共六十一頁(yè)隱球菌(qijn)性腦膜炎涂片墨汁染色法檢出隱球菌的陽(yáng)性率分別為64.86%乳膠凝集(nngj)試驗(yàn)檢測(cè)患者血清和腦脊液中隱球菌莢膜多糖抗原的陽(yáng)性率分別為91.67%, 100%第二屆全國(guó)深部真菌感染學(xué)術(shù)會(huì)議 ，2007.3.15-3.18，杭州 共六十一頁(yè)分子生物學(xué)方法(fngf)共六十一頁(yè)分子生物學(xué)方法(fngf)以PCR和分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)(jch)巢式PCRPCR-ELISAReal-time PCR反向線(xiàn)點(diǎn)雜交生物芯片共六十一頁(yè)P(yáng)CR方法(fngf) 敏感度、特異度差異較大 4%-100%, 7.9%-100%差異原因1 真菌DNA的提取效率2 引物質(zhì)量3 PCR反應(yīng)種類(lèi)（普通PCR，巢式PCR或者實(shí)時(shí)定 量PCR）4 研究人群的大小，基礎(chǔ)疾病5 樣本種類(lèi)（血漿、血清(xuqng)、全血或者支氣管肺泡灌 洗液）缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方法共六十一頁(yè)DNA檢測(cè)(jin c)用于IPA DNA檢測(cè)結(jié)果與半乳甘露聚糖檢測(cè)和高分辨率CT的結(jié)果有良好的一致性 DNA檢測(cè)陰性