1、v1.0可編輯可修改二次諧波的應(yīng)用二次諧波成像是近年發(fā)展起來的一種三維光學(xué)成像技術(shù)，具有非線性光學(xué)成像所特有的 高空間分辨率和高成像深度，可避免雙光子熒光成像中的熒光漂白效應(yīng)。此外二次諧波信號對組織的結(jié)構(gòu)對稱性變化高度敏感，因此二次諧波成像對于某些疾病 的早期診斷或術(shù)后治療監(jiān)測具有很好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景二次諧波英文名稱：second harmonic component定義：將非正弦周期信號按傅里葉級數(shù)展開，頻率為原信號頻率兩倍的正弦分量。SHG的一個必要條件是需要沒要反演對稱的介質(zhì)其次是必須滿足相位匹配，傳播中的倍頻 光波和不斷昌盛的倍頻極化波保持了相位的一致性諧波產(chǎn)生的根本原因是由于非線性

2、負(fù)載所致。當(dāng)電流流經(jīng)負(fù)載時，與所加的電壓不呈線性關(guān)系，就形成非正弦電流，從而產(chǎn)生諧波。SHG實驗裝置SHG實驗裝置按二次諧波信號收集方式可分為前向和后向，圖2為前向和后向二次諧波產(chǎn)生的實驗裝置示意圖.以圖2 （a） 為例：由激光器產(chǎn)生的角頻率為 的入射基頻光，經(jīng)過物鏡聚焦到樣品上，產(chǎn)生頻率為2的二次諧波，由另一個高數(shù)值孔徑的物鏡收集，濾光片（一般為窄帶濾光片）濾掉激發(fā)光和可能產(chǎn)生的熒光和其 他背景光，再用探 測器件（如PMT）和計算機系統(tǒng)進行信號的采集、存儲、分析和顯示. 要實現(xiàn)二次諧波微成像需要對以下因素進行最優(yōu)化考慮：超短脈沖激光、高數(shù)值孑L徑的顯微物鏡、高靈敏度的非解掃面探測器、準(zhǔn)相位匹

3、配和具有高二階非線性的樣品 J. 激光器：摻T i藍(lán)寶石飛秒激光器因具有高重復(fù)頻率（8 0 MHz）和高峰值功率，單脈沖能量低且町在整個近紅外區(qū)（7 0 010 0 0 n m）內(nèi)連續(xù)調(diào) 諧,所以是二次諧波顯微成像的理想光源.激光的重復(fù)頻率對SHG也有影響，如果提高激發(fā)光的重 復(fù)頻率，激發(fā)光的平均功率可相應(yīng)提高，二次諧波信號也得到增強.物鏡：一般情況下，二次諧波主要非軸向發(fā)射， 即信號收集時必須有一個足夠大的數(shù)值孑L徑來有效接收整個二次諧波信號.濾光片：為保證所收集的信號為二次諧波信號，必須使用濾光片.一般采用一長波濾光片和窄帶濾光片（帶寬10 nm）組合以過濾任何干擾信號.信號收集系統(tǒng)：為盡

4、暈減少二次諧波信號在系統(tǒng)中的損失，提高系統(tǒng)的探測靈敏度，最好采用非 解掃（non. descanned）的信號.信號收集系統(tǒng)中的主要部件是PMTv1.0可編輯可修改探測器.首先，為收集整個二次諧波信號，需要探測器的接收面足夠?qū)?其次，對 于由可調(diào)諧T 1 :藍(lán)寶石飛秒激光器，要接收的二次諧波信號處于3 5 0 - 5 0 0 n m波段，故可采用雙堿陰 極光電倍增管.由于激發(fā)光波長離探測器的響應(yīng)區(qū)很遠(yuǎn)，故可有效探N-次諧波信號.除了使用不同的濾光片外， 二次諧波顯微成像 和雙光子激發(fā)熒光顯微成像在系統(tǒng)結(jié)構(gòu)上是完全兼容的.已有人成功地將激光掃描共聚焦顯微鏡改造成雙光子系統(tǒng) 9 ,同樣，也可以方便

5、的用改造后的系統(tǒng)進行兩者的復(fù)合成像 TOC o 1-5 h z 二次諧波顯微成像技術(shù)的發(fā)展及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞膜電壓的測量對理解細(xì)胞信號傳遞過程有重要作用.使用合適的膜染劑進行標(biāo)記 ，通過對染劑分子的二次諧波顯微成像，信號強度變化便能反映膜電壓的大小.近年來，二次諧波顯微成像的一個主要領(lǐng)域，就是發(fā)展具有高時空分辨率及高靈敏度的活細(xì)胞中橫跨膜電壓的光學(xué)測量方法.SHG成像用于膜電壓測量細(xì)胞膜電壓的測量對理解細(xì)胞信號傳遞過程有重要作用.使用合適的膜染劑進行標(biāo)記，通過對染劑分子的二次諧波顯微成像，信號強度變化便能反映膜電壓的大小.近年來，二次諧波顯微成像的一個主要領(lǐng)域，就是發(fā)展具有高時空分辨率

6、及高靈敏 度的活細(xì)胞中橫跨膜電壓的光學(xué)測量方法.1993 年，O Bouevit ch等人一 證明，所加電場可強烈地調(diào)制SHG強度.1999年，P J Camp a g n o ! a等人 則 證明了 S HG信號隨膜電壓變化.實驗結(jié)果表明，激發(fā)波長為8 5 0 nm時，SHG對膜電壓的靈敏度為18/100 mV,而TPEF只有10710 0 m V_J.2004年，Andre w等人進一步研究了苯乙烯基染劑產(chǎn)生的二次 諧波信號對膜電壓的敏感性.實驗表明，使用8 5 09 10 nm的激發(fā)波長，膜染劑di4.ANE PMP OH使S HG對膜電壓的敏感度高達(dá)2 0 / 1 0 0 mV,且由于

7、共振增強，使用9 5 0 9 7 0 n m的激發(fā) 波長 時，敏感度達(dá)到4 0 / 1 0 0 mV .這些研究結(jié)果 進一步鞏固了 SHG在活細(xì)胞中膜 電壓的功能成像中的重要性. 最近，Cornel 1大學(xué)的科學(xué)家， 通過使用一種低毒性的有機染劑D H P E S B P,對海參神經(jīng)細(xì)胞進行二次諧波 微成像（如圖5 ）,并成功實現(xiàn)了腦組 織巾的電脈沖成像一，這對于解瀆大腦工作過程，解釋大腦退化疾病如Alzheimer s癥等，具有巨大度、高空間分辨率和對生物的低殺傷性特點，為活v1.0可編輯可修改體測量提供了一種新方法， 有望成為組織形態(tài)學(xué)和 生理學(xué)研究的？個強大工具.目的，S HG在神經(jīng)科

8、學(xué)、藥理學(xué)及疾病早期 斷方面的應(yīng)用研究已取得 一些進展.但二次諧波成像還是一 .不很成熟的技術(shù)，隨著研究的逐步深入， 對它的應(yīng)用仍然有待進一步的開發(fā).隨著微光纖技術(shù)的發(fā)展，二次諧波成 像技術(shù)還可與光纖光學(xué)結(jié)合進行人體內(nèi)窺鏡檢查，實現(xiàn)活體生物體內(nèi)深處的組織在分子水平的成像.隨著信號檢測技術(shù)和計算機技術(shù)等的發(fā)展，還可運用二次諧波成像實時觀察生物細(xì)胞活動.由于二次諧波顯微應(yīng)用于肌纖維長度的精確度已達(dá)到2 0n m_，活體未標(biāo)記心臟和肌肉組織的納米藥理學(xué)研究也將發(fā)揮很大的作用.本實驗室正著手研究將次諧波成像、共聚焦顯微成像以及雙光子激發(fā)熒光成像結(jié)合，根據(jù)視網(wǎng)膜的分層結(jié)構(gòu)和特點， 采用不方法成像，進而揭

9、示視網(wǎng)膜的 正常生理結(jié)構(gòu)及 病變部位，為視網(wǎng)膜疾病的早期診斷提供一種新型的具有三維高空間分辨牢的手段相位匹配及實現(xiàn)方法實驗證明，只有具有特定偏振方向的線偏振光，以某一特定角度入射晶體時， 才能獲得良好的倍頻效果，而以其他角度入射時，則倍頻效果很差，甚至完全不 出倍頻光。根據(jù)倍頻轉(zhuǎn)換效率的定義P 23刀 TOC o 1-5 h z P3 ,(15)經(jīng)理論推導(dǎo)可得sin2(L? k/2)22“一(J?d?L2?E2(L? k/2)2(16)“與L? ? k/2關(guān)系曲線見圖1。圖中可看出，要獲得最大的轉(zhuǎn)換效率，就要使 L? ? k/2 =0, L是倍頻晶體的通光長度，不等于 0,故應(yīng)？ k = 0,

10、即v1.0可編輯可修改就是使-2兀倍頻效率與的關(guān)L? ? k/22kl k2(n1n2 ) 0nw和n2w分別為晶體對基頻光和倍頻光的折射率。也就是只有當(dāng)基頻光和倍頻光的折射率相等時，才能產(chǎn)生好的倍頻效果，式（18）是提高倍頻效率的必要條件, 稱作相位匹配條件。由于V3 = c/n V23 = c/n2 v。和V2-分別是基頻光和倍頻光在晶體中的傳播速度。滿足（18）式，就是要求基頻光和倍頻光在晶體中的傳播速度相等。從 這里我們可以清楚地看出，所謂相位匹配條件的物理實質(zhì)就是使基頻光在晶體中 沿途各點激發(fā)的倍頻光傳播到出射面時， 都具有相同的相位，這樣可相互干涉增 強，從而達(dá)到好的倍頻效果。實現(xiàn)

11、相位匹配條件的方法：由于一般介質(zhì)存在正常色散效果，即高頻光的折 射率大于低頻光的折射率，如n2 1大約為102數(shù)量級。？ kw0。但對于各向同性晶體，由于存在雙折射，我們則可利用不同偏振光間的折射率關(guān)系，尋找到卜面以負(fù)單軸晶體為例相位匹配條件，實現(xiàn)？ k = 0。此方法常用于負(fù)單軸晶體,說明。圖2中畫出了晶體中基頻光和倍頻光的兩種不同偏振態(tài)折射率面間的關(guān) 系。圖中實線球面為基頻光折射率面，虛線球面為倍頻光折射率面，球面為 光折射率面，橢球面為e光折射率面，z軸為光軸。圖2負(fù)單軸晶體折射率球面v1.0可編輯可修改折射率面的定義：從球心引出的每 一條矢徑到達(dá)面上某點的長度，表示晶 體以此矢徑為波法

12、線方向的光波的折 射率大小。實現(xiàn)相位匹配條件的方法之 一是尋找實面和虛面交點位置，從而得 到通過此交點的矢徑與光軸的夾角。圖 中看到，基頻光中o光的折射率可以和 倍頻光中e光的折射率相等，所以當(dāng)光波沿著與光軸成8 m角方向傳播時，即可實現(xiàn)相位匹配，0 m叫做相位匹配角，0m可從下式中計算得出sin2(19)(n。)2 (nO ) 2(n2 ) 2 (n2 ) 2 ,22式中n0,n。,ne都可以查表得到，表1列出幾種常用的數(shù)值。法線方向和光軸方向成9 m,見圖3圖3非線性晶體的切割以上所述，是入射光以一定表1相位匹配角晶體入 /mn。ne0 m鋸酸鋰87O碘酸鋰29。30KD*P30O57注意

13、，相位匹配角是指在晶體中基頻光相對于晶體光軸 z方向的夾角，而不 是與入射面法線的夾角。為了減少反射損失和便于調(diào)節(jié)，實驗中一般總希望讓基 頻光正入射晶體表面。所以加工倍頻晶體時，須按一定方向切割晶體，以使晶體v1.0可編輯可修改角度入射晶體，通過晶體的雙折射，由折射率的變化來補償正常色散而實現(xiàn)相位 匹配的，這稱為角度相位匹配。角度相位匹配又可分為兩類。第一類是入射同一 種線偏振光，負(fù)單軸晶體將兩個e光光子轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€倍頻的。光光子。第二類是 入射光中同時含有o光和e光兩種線偏振光，負(fù)單軸晶體將兩個不同的光子變?yōu)?倍頻的e光光子，正單軸晶體變?yōu)橐粋€倍頻的 o光光子。見表2表2單軸晶體的相位匹配條件

14、晶體種類第一類相位匹配第二類相位匹配偏振性質(zhì)相位匹配條件偏振性質(zhì)相位匹配條件正單軸e e one ( m ) noo e o工none( m) n22負(fù)單軸o o eno n e ( m )e o e1 .,2 /、-ne( m) no n e ( m)2本實驗用的是負(fù)單軸花酸鋰晶體第一類相位匹配。相位匹配的方法除了前述的角度匹配外，還有溫度匹配，這里不作細(xì)述圖4晶體中基頻光和倍頻光振幅隨在影響倍頻效率的諸因素中，除前述的比較重要的三方面外，還需考慮到晶體的 有效長度Ls和模式狀況。圖4為晶體中基頻 光和倍頻光振幅隨距離的變化。如果晶體過 長，例LLs時，會造成倍頻效率飽和；晶體 過短。例LL

15、s,則轉(zhuǎn)換效率比較低。Ls的大 小基本給出了倍頻技術(shù)中應(yīng)該使用的晶體長 度。模式的不同也影響轉(zhuǎn)換效率，如高階橫模，方向性差，偏離光傳播方向的光會偏離相位匹配角。 所以在不降低入射光功 率的情況下，以選用基橫?；虻碗A橫模為宜。V 1 V 1 VY2Y2Y圖5基頻光與倍頻光的脈寬及相對線寬的比較1. 5.倍頻光的脈沖寬度和線寬通過對倍頻光脈沖寬度t和相對線寬V的觀測，還v1.0可編輯可修改可看到兩種線寬都比基頻光變窄的現(xiàn)象。這是由于倍頻光強與入射基頻光強的平方成比例的緣故。圖5中，假設(shè)在t=t。時。基頻和倍頻光具有相同的極大值。 基頻光在ti和ti時，功率為峰值的1/2,脈沖寬度？ ti = ti

16、ti,而在相同的 時間問隔內(nèi)，倍頻光的功率卻為峰值的i/4,倍頻光的半值寬度t2 12V ti 一ti, gp? t2? ti,脈沖寬度變窄。同樣道理可得到倍頻后的譜線寬度也會變窄。1064-532:I 類匹配為 theta=90 phi=25CII 類為 theta= phi=9025 CLBO匹配分兩種，一種為非臨界相位匹配，一種為臨界相位匹配即角度匹配.后一 種都是在常溫下使用的，也可以根據(jù)不同的工作溫度進行角度的調(diào)整。二次諧波的應(yīng)用二次諧波成像是近年發(fā)展起來的一種三維光學(xué)成像技術(shù)，具有非線性光學(xué)成像所特有的 高空間分辨率和高成像深度，可避免雙光子熒光成像中的熒光漂白效應(yīng)。此外二次諧波信

17、號對組織的結(jié)構(gòu)對稱性變化高度敏感，因此二次諧波成像對于某些疾病的早期診斷或術(shù)后治療監(jiān)測具有很好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景二次諧波英文名稱：second harmonic component定義：將非正弦周期信號按傅里葉級數(shù)展開，頻率為原信號頻率兩倍的正弦分量。SHG的一個必要條件是需要沒要反演對稱的介質(zhì)其次是必須滿足相位匹配，傳播中的倍頻光波和不斷昌盛的倍頻極化波保持了相位的一致性諧波產(chǎn)生的根本原因是由于非線性負(fù)載所致。當(dāng)電流流經(jīng)負(fù)載時，與所加的電壓不呈線性關(guān)系，就形成非正弦電流，從而產(chǎn)生諧波。SHG實驗裝置SHG實驗裝置按二次諧波信號收集方式可分為前向和后向，圖2為前向和后向二次諧波產(chǎn)生的實驗裝置示

18、意圖.以圖2 （a） 為例：由激光器產(chǎn)生的角頻率為 的入射基頻光，經(jīng)過物鏡聚焦到樣品上，產(chǎn)生頻率為2的二次諧波，由另一個高數(shù)值孔徑的物鏡收集，濾光片（一般為窄帶濾光片）濾掉激發(fā)光和可能產(chǎn)生的熒光和其 他背景光，再用探 測器件（如PMT）和計算機系統(tǒng)進行信號的采集、存儲、分析和顯v1.0可編輯可修改示. 要實現(xiàn)二次諧波微成像需要對以下因素進行最優(yōu)化考慮：超短脈沖激光、高數(shù)值孑L徑的顯微物 鏡、高靈敏度的非解掃面探測器、 準(zhǔn)相位匹配和具 有高二階非線性的樣 品 J. 激光器：摻T i藍(lán)寶石飛秒激光器因具有高重復(fù)頻率(8 0 MHz)和高峰值功率，單脈沖能量低且町在整個近紅外區(qū)(7 0 010 0

19、0 n m)內(nèi)連續(xù)調(diào)諧，所以是二次諧波顯微成像的理想光源.激光的重復(fù)頻率對SHG也有影響，如果提高激發(fā)光的重 復(fù)頻率，激發(fā)光的平均功率可相應(yīng)提高，二次諧波信號也得到增強.物鏡：一般情況下，二次諧波主要非軸向發(fā)射， 即信號收集時必須有一個足夠大的數(shù)值孑L徑來有效接收整個二次諧波信號.濾光片：為保證所收集的信號為二次諧波信號，必須使用濾光片.一般采用一長波濾光片和窄帶濾光片(帶寬10 nm)組合以過濾任何干擾信號.信號收集系統(tǒng)：為盡暈減少二次諧波信號在系統(tǒng)中的損失，提高系統(tǒng)的探測靈敏度， 最好采用非 解掃(non. descanned)的信號.信號收集系統(tǒng)中的主要部件是PMT探測器.首先，為收集整

20、個二次諧波信號，需要探測器的接收面足夠?qū)?其次，對 于由可調(diào)諧T 1 :藍(lán)寶石飛秒激光器，要接收的二次 諧波信號處于3 5 0 - 5 0 0n m波段，故可采用雙堿陰 極光電倍增管.由于激發(fā)光波長離探測器的響應(yīng)區(qū) 很遠(yuǎn)，故可有效探N -次諧波信號.除了使用不同的濾光片外， 二次諧波顯微成像和雙光子激發(fā)熒光顯微成像在系統(tǒng)結(jié)構(gòu)上是完全兼容的.已有人成功地將激光掃描共聚焦顯微鏡改造成雙光子系統(tǒng) 9 ,同樣，也可以方便的用改造后的系統(tǒng)進行兩者的復(fù)合成像 TOC o 1-5 h z 二次諧波顯微成像技術(shù)的發(fā)展及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞膜電壓的測量對理解細(xì)胞信號傳遞過程有重要作用.使用合適的膜染劑進行標(biāo)

21、記 ，通過對染劑分子的二次諧波顯微成像，信號強度變化便能反映膜電壓的大小.近年來，二次諧波顯微成像的一個主要領(lǐng)域，就是發(fā)展具有高時空分辨率及高靈敏度的活細(xì)胞中橫跨膜電壓的光學(xué)測量方法.SHG成像用于膜電壓測量細(xì)胞膜電壓的測量對理解細(xì)胞信號傳遞過程有重要作用.使用合適的膜染劑進行標(biāo)記，通過對染劑分子的二次諧波顯微成像，信號強度變化便能反映膜電壓的大小.近年來，二次諧波顯微成像的一個主要領(lǐng)域，就是發(fā)展具有高時空分辨率及高靈敏 度的活細(xì)胞中橫跨膜電壓的光學(xué)測量方法.1993 年，O Bouevit ch等人一 證明，所加電場可強烈地調(diào)制SHG強度.1999年，P J Cam8v1.0可編輯可修改p a g n o ! a等人 則 證明了 S HG信號隨膜電壓變化.實驗結(jié)果表明，激發(fā)波長為8 5 0 nm時，SHG對膜電壓的靈敏度為18/100 mV,而TPEF只有10710 0 m V_J .2004年， Andre w等人進一步研究了苯乙烯基染劑產(chǎn)生 的二次 諧波信號