1、 Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量 （Lowry基本法）一 目的與要求 掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。二 實驗原理Folin-酚試劑（Folin-phenol reagent）的顯色原理主要是：試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸混合物被蛋白質(zhì)還原，形成多種還原型的混合酸，并且有特殊的藍(lán)色。包括兩步反應(yīng)。 試劑甲使蛋白質(zhì)發(fā)生烯醇化反應(yīng)，在堿性條件下，形成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，從而使電子轉(zhuǎn)移到混合酸中，大大地增強了酚試劑對蛋白質(zhì)的敏感性。 試劑乙（磷鉬酸-磷鎢酸混合液）受蛋白質(zhì)中半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸等作用，使鎢酸、鉬酸兩者同時失去1個、2個或3個氧原子，還原成含有多種還原型的混

2、合酸，并且有特殊的藍(lán)色。利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，可制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣品中蛋白質(zhì)含量。本法可測定的蛋白質(zhì)含量為15-280g/ml。 1. 試劑甲1）10g Na2CO3、2gNaOH和0.25g酒石酸鉀鈉溶于500ml蒸餾水。（2）0.5g CuSO45H2O溶于100ml蒸餾水中。每次使用前將(1)：（2)=50:1之比例混合，即為試劑甲（有效期1天）。2.試劑乙 以100g Na2WO42H2O、25gNaMoO42H2O、溶于700ml蒸餾水中，并加入8.67mol/L H3PO4（85%）50ml、濃HCl 100ml，混合在1.5L容積的磨口回流瓶中，接上回流冷凝管與小火回

3、流10h。回流結(jié)束后，加入150g Li2SO4H2O、50ml蒸餾水，并隨之加入一定量的液體溴，開口繼續(xù)沸騰，使溶液由綠色變黃色（與回流開始前溶液顏色相似）。過量的溴可煮沸去除。冷卻后，稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，以酚肽為指示劑，然后適當(dāng)稀釋（約加水1倍）, 使最終的酸濃度為1mol/L。3.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 精密稱取結(jié)晶牛血清白蛋白，將其溶于0.1mol/L NaOH中，使蛋白質(zhì)含量為200g/mL。試劑配制：三 操作步驟 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取試管6支，編號。按表7-2操作，加入牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（200g/mL），補足蒸餾水，使各管容量達(dá)1mL。算出

4、各管中實際蛋白質(zhì)含量，然后按順序加入定量試劑甲、乙（各管加入乙試劑必須快速，并立即搖勻！），在分光光度計以上波長500nm比色，讀取光密度。Folin-酚試劑法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟管號牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液/ml蒸餾水/ml各管加試劑甲2.5mL，混勻放置10min后，加入試劑乙0.25mL，立即混勻，放置10min OD50010.10.420.20.330.30.240.40.150.50600.5 樣品測定取試管2支，分為測定管和空白管。測定管內(nèi)加入0.5ml待測樣品溶液（適當(dāng)稀釋至約25-280g/mL蛋白質(zhì)）。操作步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，見表。待測液ml蒸餾水ml各管加試劑甲2.5ml，混勻

5、放置10min后，加入試劑乙0.25ml，立即混勻，放置10min后比色。 OD500 空白管00.5測定管0.50標(biāo)準(zhǔn)管0.5（標(biāo)準(zhǔn)液）02.以各標(biāo)準(zhǔn)溶液含量為橫坐標(biāo)，各管的光密度為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。( 標(biāo)準(zhǔn)曲線必須從零點開始出發(fā)，最好能成一直線。畫好后，注明所用儀器的型號及編號、所用波長及測定方法、名稱及制作日期。)四 結(jié)果與計算根據(jù)光密度讀數(shù)查得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算檢測液內(nèi)的蛋白質(zhì)含量。進一步可根據(jù)檢測溶液的稀釋倍數(shù)及實際所要求的蛋白質(zhì)濃度換算。本實驗要求蛋白質(zhì)含量濃度以g/L為單位，也可以與測定管同樣操作的標(biāo)準(zhǔn)管按下式計算蛋白質(zhì)含量。測定管蛋白含量= 標(biāo)準(zhǔn)管蛋白質(zhì)含量 500 （稀釋倍

6、數(shù)） 測定管光密度 標(biāo)準(zhǔn)管光密度是非題1.Folin-酚試劑測定蛋白含量的適用范圍為25-280ng/mL。（）2.Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量比雙縮脲法靈敏度差。（）3.Folin-酚試劑（Folin-phenol reagent）的顯色原理涉及蛋白質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移。（）單選題1. 用紫外分光光度法測蛋白質(zhì)含量，選用波長為 (B)(A)260nm (B)280nm (C)250nm (D)270nm2.下列哪一種蛋白質(zhì)定量方法的原理直接涉及蛋白 質(zhì)中的肽鍵的呈色反應(yīng)？(D) (A)凱氏定氮法 (B)紫外分光光度法 (C)茚三酮反應(yīng) (D)雙縮脲法3.某一蛋白質(zhì)等電點pI為6.5，下列哪種溶液中蛋白質(zhì)帶