1、關(guān)于質(zhì)粒的提取和純化第一張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月內(nèi) 容一.質(zhì)粒的概念和提取原理二.堿裂解法的實(shí)驗(yàn)操作和原理三.煮沸法快速提取質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)操作和原理四.實(shí)驗(yàn)室使用的方法五.質(zhì)粒純化后的檢測(cè)第二張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一.質(zhì)粒的概念和提取原理質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中,它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì),如離開宿主細(xì)胞則不能

2、存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活 .第三張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一.質(zhì)粒的概念和提取原理質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型: 緊密控制型(Stringent control) 松馳控制型(Relaxed control)第四張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一.質(zhì)粒的概念和提取原理在pH 12.0 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，可除去

3、大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。 第五張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)中使用的三個(gè)溶液1,溶液： 葡萄糖使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部. Tris.Cl (pH8.0)提供反應(yīng)的最佳環(huán)境. EDTA (pH8.0) Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑,抑制DNase(脫氧核糖核酸酶)的活性和抑制微生物生長(zhǎng). 第六張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)中使用的三個(gè)溶液2,溶液：NaOH (臨用前用10mol/L NaOH 母液稀釋) 1 SDS 注:要新從濃NaOH稀釋制備NaOH，是

4、為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性. NaOH細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化,瞬間就溶解. 當(dāng)然SDS也是堿性的,但是很弱,只能抽提得到少量質(zhì)粒 .第七張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)中使用的三個(gè)溶液3,溶液： KAc 冰醋酸 ddH2O注:冰醋酸的作用是為了中和過(guò)量的NaOH.KAc是提供K+和SDS反應(yīng),取代Na離子,形成十二烷基硫酸鉀 (PDS),而PDS是難溶于水的. SDS易和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了 ,同時(shí)長(zhǎng)長(zhǎng)的基因組DNA也一

5、起被共沉淀了.但是SDS并不與DNA分子結(jié)合 .第八張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二，堿裂解法的操作步驟1,取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的含質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液,高速離心,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。 2, 加入溶液I,充分懸浮菌體細(xì)胞。 3,加入新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴5分鐘。 4,加用冰預(yù)冷的溶液III, 搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。5,4下離心15分鐘。 第九張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二，堿裂解法的操作步驟6,取上清液,加入 RNA酶A, 37水浴20分鐘。 7,加入等體積的

6、飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4下高速離心10分鐘。 8,取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4下高速離心10分鐘。9,取上層水相,加入2倍體積的無(wú)水乙醇 ,室溫放置幾分鐘 ,離心。 10,4下高速離心15分鐘, 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌,4下高速離心5分鐘。 11,吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥 。 12,得到的質(zhì)粒樣品一般用TE緩沖液或者ddH2O進(jìn)行溶解.第十張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意的事項(xiàng)一,在加溶液后:.時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；.必須溫柔混合,不然基因組DNA也會(huì)斷裂。二,加入的酚必

7、須要用氯仿和乙醇洗滌干凈,否則對(duì)后面的實(shí)驗(yàn)有影響.三,沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來(lái),所以多數(shù)還是用乙醇。 四,提取質(zhì)粒DNA過(guò)程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提 .第十一張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三，煮沸法快速提取質(zhì)粒的操作步驟 （1） 將 2ml 含相應(yīng)抗生素的 LB 培養(yǎng)基加入到容量為 15ml 的試管中，接種一單菌落，用棉塞封口，在 37 劇烈震蕩（ 250rpm ）培養(yǎng)過(guò)夜。 （2） 將 1.5ml 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，在 4 條件下離心 30 秒。 （3） 棄上清

8、液，用濾紙吸干離心管中的液體培養(yǎng)基，將細(xì)菌沉淀物懸浮于 200 m l STET 緩沖液（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,10mmol/L Tris ） ，用渦旋混合器充分混勻。 （4） 加入 4 m l 新鮮配制的溶菌酶液，混勻，置室溫下 5min 。 （5） 用漂子架住離心管，置于沸水浴中，精確記時(shí) 45 秒，取出后立刻離心 10min 。 第十二張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三，煮沸法快速提取質(zhì)粒的操作步驟（6） 用無(wú)菌牙簽挑取離心管中的沉淀物棄去，離心管的上清液中加入 8 m l 5%CTAB(十六烷基三甲基溴化氨) ，用混合器混勻后，高速

9、離心 5min ，棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體。 （7） 加入 1.2M 氯化鈉 300 m l ，充分溶解沉淀物，再加入 750 m l 的冷乙醇，充分混勻后，離心 15min ，棄上清液。 （8） 取 1ml 70% 冷乙醇，緩慢淋洗離心管內(nèi)壁，離心 5min 。棄上清液，用濾紙吸干管壁上的液體，置室溫中使核酸沉淀自然干燥 5-10min 。 （ 9 ） 沉淀物溶于 50 m l TE 緩沖液中， 混合器混勻 。 （10） 即成質(zhì)粒制備液，制備的質(zhì)粒供下一步實(shí)驗(yàn)使用.第十三張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四，實(shí)驗(yàn)室使用的操作步驟1,取1.5ml含細(xì)菌的培養(yǎng)液,離心,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。 2,加入溶液I,充分懸浮菌體細(xì)胞。 3,加入新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴5分鐘。4,加用冰預(yù)冷的溶液III, 搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。 5,4下離心15分鐘。第十四張，PPT共十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四，實(shí)驗(yàn)室使用的操作步驟6,取上清液加新的離心管中.7,加入純化樹脂,混勻,放置10min.8,將溶液轉(zhuǎn)移到離心純化柱中,高速離心.9,倒掉下管中的溶液,再加80%異丙醇,洗滌兩次,每次離