1、關(guān)于谷氨酸生產(chǎn)菌的特征育種及擴(kuò)大培養(yǎng)第一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié). 谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征一、現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌。 1. 棒狀桿菌屬(Corynebacterium)直到微彎的桿菌，一端膨大呈棒狀，折斷分裂形成“八”字形或柵狀排列。葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，G+第二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2 短桿菌屬(Brevibacterium) 短的不分枝直桿菌。多數(shù)從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，不發(fā)酵乳糖。 G+3 小桿菌屬(Microbacterium) 形態(tài)與棒狀桿菌相似。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸弱，主要產(chǎn)乳酸。

2、G+第三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月4 節(jié)桿菌屬(Arthrobacterium) 培養(yǎng)過程中，細(xì)胞形態(tài)變化較大球菌 桿菌，桿菌 球菌。 G+ G- , G- G+ 能液化明膠，從碳水化合物產(chǎn)酸極少或不產(chǎn)酸。第四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、谷氨酸棒狀桿菌基因組研究進(jìn)展谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032GenBank NC-004369第五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月目前應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸常用的微生物僅有兩大類:一類為細(xì)菌,多采用乳酸菌,另一類為根霉。根霉可以直接利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)L-乳酸,但是產(chǎn)酸量

3、低,副產(chǎn)物多,轉(zhuǎn)化率低。Sauer等構(gòu)建了包含乳桿菌L-乳酸脫氫酶基因的畢氏酵母,它利用木糖發(fā)酵,初始濃度為100g/L，生產(chǎn)L-乳酸達(dá)到58g/L，比利用葡萄糖產(chǎn)生乳酸的水平高?；蚬こ逃N（重組DNA技術(shù)）第七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、現(xiàn)有谷氨酸生成菌的主要特征（1）細(xì)胞形態(tài)球形、棒狀以及短桿狀。（2）G+，無芽孢、無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。（3）需氧型、生物素缺陷型微生物。（4）脲酶強(qiáng)陽性（5）不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白以及明膠。（6）發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時(shí)發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變化。（7）CO2固定反應(yīng)酶系活力強(qiáng)。第八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月

4、（8）異檸檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循環(huán)弱。（9）-酮戊二酸氧化能力微弱。（10）NADPH2進(jìn)入呼吸鏈能力弱。（11）檸檬酸合成酶、烏頭酸梅、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)。（12）能利用醋酸，不能利用石蠟。（13）具有向環(huán)境中泄露谷氨酸的能力。（14）不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸5%以上。第九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌及其比較 1、形態(tài)特征 短桿至小棒狀，有時(shí)微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，呈多種形態(tài)。 單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。 G+。胞內(nèi)有橫隔。不運(yùn)動(dòng)。無芽孢。一、 北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征第十張，PPT共四

5、十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2、培養(yǎng)特征普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形， 24h白色，48h淡黃色，中央隆起，表面濕潤、光滑，有光澤，邊緣整齊且呈半透明狀，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。第十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3、生理特征 對(duì)氧的要求：好氧及兼性厭氧。 與溫度的關(guān)系：菌株2637 培養(yǎng)生長良好，不耐高溫，41 生長較弱。 pH的影響： Ph510均能生長，最適 pH67.5。 還原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈。 石蕊牛奶培養(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿。 不水解淀粉，不分解纖維素。 對(duì)尿素的耐力，2.6%以上生長受抑制。 脲酶試驗(yàn)：強(qiáng)陽性反應(yīng)。 產(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖迅速產(chǎn)酸。

6、生長因素試驗(yàn)：生物素是必需生長因素。硫胺素明顯促生長。第十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征1、 形態(tài)特征 短桿至棒狀，有時(shí)微彎曲，兩端鈍圓，不分枝。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。 折斷分裂。 G+。胞內(nèi)有橫隔。不運(yùn)動(dòng)。無芽孢。第十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2、 培養(yǎng)特征普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，近草黃色， 表面濕潤、光滑，無光澤，邊緣頓齒狀，較薄，半透明，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。第十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 對(duì)氧的要求：兼性厭氧。 與溫度的關(guān)系：菌株2037 培養(yǎng)生長良好，不耐高溫，42 不生長。

7、 pH的影響： pH69生長良好， pH10生長微弱， pH45已不能生長。 還原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈。 石蕊牛奶培養(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿。 水解淀粉，不分解纖維素。 對(duì)尿素的耐力，2.6%以上生長受抑制。 脲酶試驗(yàn)：強(qiáng)陽性反應(yīng)。 產(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定： G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈等迅速產(chǎn)酸。 生長因素試驗(yàn)：生物素是必需生長因子。3、生理特征第十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征典型的短桿狀，有時(shí)微彎曲，兩端稍鈍圓，不分枝。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。折斷分裂。 G+。不運(yùn)動(dòng)。無芽孢。1、形態(tài)特征第十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022

8、年6月2、培養(yǎng)特征 普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，淺黃色， 表面濕潤、光滑，隆起，邊緣整齊，較薄，半透明，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。第十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3、生理特征 對(duì)氧的要求：好氧及兼性厭氧。 與溫度的關(guān)系：菌株2637 培養(yǎng)生長良好，75 處理10min不再生長。 pH的影響： pH610生長良好， pH5生長微弱， pH4和pH11已不能生長。 還原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈。 不水解淀粉，不分解纖維素。 對(duì)尿素的耐力，5%以上生長受抑制。 脲酶試驗(yàn)：強(qiáng)陽性反應(yīng)。 產(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈 生長因素試驗(yàn)：生物素是必需生長因子。硫胺素是

9、促生長作用。第十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、北京棒桿菌(7338)與鈍齒棒桿菌(B9)的比較后提取容易，收率較高，質(zhì)量較好分泌色素較多第十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2.5 天津短桿菌(T613)與鈍齒桿菌(B9)的比較 T613感染噬菌體時(shí)，不能換用B9，調(diào)換7338.第二十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化 斜面和一、二級(jí)種子在不同培養(yǎng)條件下，細(xì)胞形態(tài)基本相似。斜面培養(yǎng)的菌體較細(xì)小,一、二級(jí)種子比斜面菌體大而粗壯,革蘭氏染色深。多為短桿至棒桿狀,有的微呈彎曲狀,兩端鈍圓,無分枝;細(xì)胞排列呈單個(gè)、成對(duì)及“V

10、”字形,有柵狀或不規(guī)則聚塊;分裂的細(xì)胞大小為0.70.9*1.03.4um。由于生物素充足,繁殖的菌體細(xì)胞均為谷氨酸非積累型細(xì)胞。 一、 種子的菌體形態(tài)第二十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài) 長菌型細(xì)胞：發(fā)酵0-8h或0-10h。短桿至棒狀，有的微彎曲狀，細(xì)胞單個(gè)、成對(duì)及 V字形排列。轉(zhuǎn)移期細(xì)胞：發(fā)酵8-18h或10-20h。細(xì)胞開始伸長、膨大。在生物素貧乏的條件下，從谷氨酸非積累型轉(zhuǎn)變成谷氨酸積累型。轉(zhuǎn)移期有長菌型細(xì)胞，也有產(chǎn)酸型細(xì)胞。第二十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月產(chǎn)酸型細(xì)胞：發(fā)酵16-20h后。細(xì)胞為含磷脂不足的異常狀態(tài)，呈伸

11、長、膨大、不規(guī)則狀，缺乏V字形排列。發(fā)酵后期，細(xì)胞較長，呈有明顯的橫隔的多節(jié)細(xì)胞，產(chǎn)酸高。過量生物素，不同階段的細(xì)胞形態(tài)則基本上沒有明顯的變化。菌體較粗壯，類似于長菌型細(xì)胞。典型的異常發(fā)酵，長菌體、耗糖快、耗尿素快、發(fā)酵周期短、低酸或不產(chǎn)酸。第二十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài) 發(fā)酵前期感染噬菌體后,菌體細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞不規(guī)則,發(fā)圓、發(fā)胖,缺乏字形排列,有明顯的細(xì)胞碎片,嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng),互相堆在一起,幾乎找不到完整的菌體細(xì)胞,類似蛛網(wǎng)或魚翅狀。 第二十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月在發(fā)酵中、后期感染噬菌體后,菌體細(xì)胞形態(tài)不

12、規(guī)則,邊緣不整齊,有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西,有細(xì)胞碎片 。第二十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié)、谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種 一、日常菌種工作 1、定期分純1-2個(gè)月分離純化一次第二十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2、小劑量誘變刺激用紫外線（10-20s）處理，可以淘汰生長微弱的菌株，并能激發(fā)溶原性噬菌體，使挑出來的菌產(chǎn)酸高、生長旺盛、無噬菌體感染。第二十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3、高產(chǎn)菌制作安瓿管育種后分純的高產(chǎn)菌種需保存到安瓿管中，防止菌種變異。第二十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、選育耐高滲透壓菌種耐高糖突變株選育在

13、含20-30%葡萄糖的平板上生長好的突變株。耐高谷氨酸突變株選育在含15-20%味精的平板上生長好的突變株。耐高糖、高谷氨酸突變株選育在含20%葡萄糖、15%味精的平板上生長好的突變株。第二十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、 選育不分解利用谷氨酸的突變株 選育以谷氨酸為唯一碳源菌體不長或生長微弱的突變株。四、選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株 生物素亞適量吐溫-60青霉素溫度敏感株第三十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月五、 選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株六、選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株 七、選育強(qiáng)化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到 -酮戊二酸代謝的突變株 八、選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶

14、反 饋調(diào)節(jié)的突變株 九、選育強(qiáng)化能量代謝的突變株耐谷氨酸、谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物、谷氨酰胺抗性突變株第三十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 一、應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)第三十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月鈍齒棒桿菌B9(細(xì)胞個(gè)體大、易于提??；產(chǎn)酸率低)天津短桿菌TG-866(產(chǎn)酸率高)融合子F263(細(xì)胞個(gè)體大、產(chǎn)酸率高)第三十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、應(yīng)用轉(zhuǎn)化法第三十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、應(yīng)用轉(zhuǎn)導(dǎo)法第三十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、應(yīng)用重組DNA技術(shù)第三十六張，PPT

15、共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的 接種量的需要 菌種的馴化 縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平第三十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的過程第三十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1、斜面菌種的培養(yǎng)培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%，蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化鈉 0.25% ，酵母膏0.5%，瓊脂 2%， pH 7.0-7.2培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長，原料比較精細(xì)。生長斜面要求： 32，生長18-24小時(shí)，生長良好， 所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次第三十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 一級(jí)種子

16、培養(yǎng)（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32 培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿 2.5%， K2HPO4 0.1%，F(xiàn)eSO4 2mg/k , MnSO42mg/kg PH7.0培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長，所使用的原料 已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基.第四十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一級(jí)種子培養(yǎng)的質(zhì)量要求： 種齡：12h PH：6.4光密度：OD值凈增0.5以上殘?zhí)牵?.5%以下噬菌體檢查：無鏡檢：菌體生長均勻、 粗壯，排列整齊革蘭氏染色：陽性反應(yīng)。第四十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 二級(jí)種子培養(yǎng)(種子罐)培養(yǎng)基：水解糖液3%，尿素0.4%， Na2HPO4 0.3%，玉米漿 2.5%，KCl 0.14%，消泡劑0.5-1kg，PH7.0培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%），32培養(yǎng)7-10個(gè)小時(shí)第四十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二級(jí)種子培養(yǎng)操作流程種子罐配料培養(yǎng)基加至罐體積60-75%空消0.2MPa，130,50min打料實(shí)消接種0.1 MPa，118,5min第四十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二級(jí)種子培養(yǎng)的質(zhì)量要求：種齡：7-8hPH：7.2光密度：OD值凈增0.5以上殘?zhí)牵合?%左右噬菌體檢查：無鏡檢：菌體生長旺盛， 排列整齊革蘭氏