1、克隆抗體技術原理及流程(二)三、操作流程脾細胞材料免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。1640培養(yǎng)液2.5%FCS1640 營養(yǎng)液操作方法拉頸或用CO2處死小白鼠將小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾。把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細胞懸液，用毛細管將懸液移入小試管中。直立小試管3min，使大塊的結締組織下沉，把細胞懸液移入離心管中。以2.5%FCS1640充滿離心管，并以400g離心7min10min (與此同時應開始制備骨 髓細胞)。把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮重復、步驟。計算細胞，

2、以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細胞數應高于80%為合格骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞能產生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細胞融合后，可能影響或降低所分泌 抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞選擇骨髓瘤細胞的條件：該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；骨髓瘤細胞必須是靜息狀態(tài)，不產生Y球蛋白或不分泌到細胞外；骨髓瘤細胞生長需要一個較高的細胞密度，最好106個細胞/ml；生長速度快，繁殖時間短。目前常用的Balb/c小鼠產生的骨髓瘤細胞株有：S194/5XXO BU 1；SP2 / 0Ag14 (簡稱 SP2)；P2X? Ag8 -6-5-3

3、 (簡稱 653)；FO以653最為常用，它是由礦物油4甲基一15烷（Pristane,降植烷）誘發(fā)出來的一 種漿細胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma MOPC）并經過培育形成一株8-氮鳥嘌吟有抵抗 力的亞系。骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入，保存于-195C液氮罐中，試驗時復蘇、增 殖、傳代即可由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰酶處理。為了防止 出現返祖現象，在融合前，可將培養(yǎng)基內加入15g/ml8 一氮鳥嘌吟。取約1X1076X107 對數生長期（即培養(yǎng)15h20h）的骨髓瘤細胞，在室溫離心（400g） 10min，沉淀以2.5% FCS1640液再

4、懸浮并計數。（三）飼養(yǎng)細胞在體外的細胞培養(yǎng)中，單個的或數量很少的細胞不易生存與繁殖，必須加入 其它活的細胞才能使其生長繁殖，加入的細胞稱之為飼養(yǎng)細胞（Feeder cell）。在細胞融 合和單克隆的選擇過程中，就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長繁殖成群體，因此在 這一過程中必須使用飼養(yǎng)細胞。許多種類的動物細胞都可以做飼養(yǎng)細胞，如正常的脾細胞、 胸腺細胞、腹腔滲出細胞等，常選用腹腔滲出細胞，其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞。應用腹腔滲出細胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細胞，另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細 胞和細胞碎片，為融合細胞的生長造成良好的環(huán)境。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同 系鼠。也可以是

5、其他種類的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。材料（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。（2） 11.6%蔗糖溶液（經10磅30min 高壓滅菌）。操作方法（1）拉頸處死小鼠。（2）70%酒精浸泡消毒10min。（3）用手術剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔.（4）用注射器將4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔 液體，加入離心管。（5）1 000r / min 離心 10min。（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細胞制成懸液。臺盼藍染色計數活細胞，使每毫升含40 萬個活細胞。（7）以1ml吸管將細胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔0.05ml，含2萬個細

6、胞，放入CO2培養(yǎng)箱培 養(yǎng)，即可供細胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細胞數量少，則可以 在細胞換液時再加入一些。（四）融合細胞.融合劑細胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學融合法和生物融合法，如仙臺病毒， 此處例舉化學融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇(PEG)，在分子量為200700時，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大于1 000 時，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，與許多化學藥品 不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4 000者，常用濃度為50%， pH8.0pH8.2 (用10%NaHCO3調整)，分子量小的

7、PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過 大，則粘性太大，不易操作。50%濃度，pH偏堿時融合效應最高。也有采用30%50%濃度 的PEG加上10%二甲亞颯。不同批號的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時必須注意。每批都必須 進行細胞毒性試驗后方可應用。要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG2.融合過程融合的方法很多，常用的有轉動法和離心法。.試劑與材料供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。1640 培養(yǎng)液 100ml完全 1640 液 100ml2.5%FCS1640 液 50ml。HAT 培養(yǎng)液 100ml。50 % PEG :取分子量4 000，高純度的PEG10g放入25ml瓶

8、中高壓滅菌，使用前用預熱 于40C的1640液10ml等量(W/V)混合，以酚紅檢查pH，一般不必調pH。如pH有改變， 可用HCl或NaHCO3調整。10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。40孔塑料培養(yǎng)盤。2.操作方法準備好脾細胞。 在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞，并加入50ml 2.5%FCS1640 液。 室溫400g離心3min，使細胞沉淀。移去上清液輕敲管底部，使沉淀流動，把沉淀管放于40r水浴中，使其達融合溫度。加預熱至40 r的50 % PEG 0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現，滴加過程要求持續(xù)2min 加1ml16

9、40液，邊加邊搖動，持續(xù)1min。重復一次。加1ml 1640液，邊加邊搖動，持續(xù)0.5min。.技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要 失敗的。2.融合試驗最大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環(huán)境，以及適宜 的無菌操作技術四、雜交瘤細胞的保存(一)保存當獲得產生所需的單克隆抗體的雜交瘤細胞后，必須將一部分雜交瘤細胞保存， 否則在連續(xù)傳代的過程中，可能產生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或丟失產生抗體 的特性。另外在長期的培養(yǎng)過程中，難免不發(fā)生污染以至于毀滅。所以必須冷藏保存一部分。保存方法如下：材料細胞：取對數生長期的細胞10%二甲基亞

10、颯保護液(二甲基亞颯能損壞濾器，而又被高壓所破壞，所以不能過濾或 高壓消毒。其本身就是毒品，無菌)：含10%二甲基亞颯、20%滅活胎牛血清，70%RPMI 1640 液。20%FCS1640 培養(yǎng)液：含青霉素 100U/ml，鏈霉素 100g/ml。滅菌的2ml安瓶等操作方法去掉細胞培養(yǎng)瓶中的舊的培養(yǎng)液，加入10%FCS1640液，使細胞懸浮。1 000r/min離心10min，去上清。細胞沉淀用10%二甲基亞颯保護液制成懸液，使成 1.0X107 細胞/ml。取樣，臺盼蘭染色，計數活細胞，應在95%以上。用注射器將細胞分裝安瓶，每瓶0.5ml1.0ml，熔封安瓶放 4C 2h。放液氮罐氣態(tài)部分(-70C) 1