1、毛細(xì)管電泳法Capillary Electrophoresis, CE1 毛細(xì)管電泳是帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其淌度或分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的電泳新技術(shù)，也稱為高效毛細(xì)管電泳。 一、毛細(xì)管電泳的原理二、分離模式2一、毛細(xì)管電泳的原理 裝置 毛細(xì)管 數(shù)據(jù)處理 電極 檢測(cè)器 電極 試樣 緩沖液 緩沖液 高壓電源 （可高至30KV） 3進(jìn)樣方法1、電動(dòng)進(jìn)樣 也稱電遷移進(jìn)樣. 方法:將毛細(xì)管的進(jìn)樣端插入裝有試樣溶液的試樣管中，試樣管中插入電極，與檢測(cè)端的緩沖液間施加進(jìn)樣電壓，并維持一定時(shí)間，試樣溶液在電泳和電滲流作用下進(jìn)入毛細(xì)管，然后再將試樣溶液換成載體緩沖液，電泳即可進(jìn)行。 4

2、2、流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣 也稱為虹吸進(jìn)樣、重力進(jìn)樣、壓差進(jìn)樣方法:毛細(xì)管進(jìn)樣端插入試樣溶液容器，通過(guò)進(jìn)樣端加壓，或檢測(cè)端出口減壓，或調(diào)節(jié)進(jìn)樣端試樣溶液液面大于出口端緩沖液液面高度，利用虹吸現(xiàn)象，使進(jìn)樣口端與出口端形成正壓差，并維持一定時(shí)間，試樣在壓差作用下進(jìn)入毛細(xì)管進(jìn)樣端，再把進(jìn)樣端放回緩沖液液槽中，進(jìn)行電泳。5電泳 是指在電場(chǎng)作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳和電滲 電滲 是指在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動(dòng)的現(xiàn)象。 6電滲與固液界面的雙電層有著密切的關(guān)系 CE所用的石英毛細(xì)管柱,在pH3情況下,其內(nèi)表面帶負(fù)電,和溶液接觸時(shí)形成了一雙電層。在高電壓作用下,雙電層中

3、的陽(yáng)離子擴(kuò)散層引起流體整體地朝負(fù)極方向移動(dòng)，便形成電滲流，這種現(xiàn)象稱為電滲。電滲流的速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，故電滲流淌度定義為單位電場(chǎng)強(qiáng)度下得電滲流速度：eo=Veo/E7 粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和,正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致,故最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反,但因電滲流速度一般都大于電泳流速度,故它將在中性粒子之后流出,從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。 8電滲流的流型特點(diǎn)a. 毛細(xì)管中電滲流呈“塞式流”流型b. HPLC柱中壓力驅(qū)動(dòng)呈拋物線型9 電滲是CE中推動(dòng)流體

4、前進(jìn)的驅(qū)動(dòng)力，它使整個(gè)流體像一個(gè)塞子一樣以均勻的速度向前運(yùn)動(dòng)，使整個(gè)流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細(xì)管內(nèi)原則上不會(huì)擴(kuò)張。但在HPLC中，采用的壓力驅(qū)動(dòng)方式使柱中流體呈拋物線型，其中心處速度是平均速度的兩倍，導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶本身擴(kuò)張，引起柱效下降，使其分離效率不如CE。10電滲流的意義電泳過(guò)程中，伴隨著電滲現(xiàn)象電滲流的速度比電泳速度快57倍利用電滲流可將正、負(fù)離子或中性分子一起向同一方向，產(chǎn)生差速遷移，在一次電泳操作中同時(shí)完成正、負(fù)離子的分離分析電滲流是毛細(xì)管電泳分離的重要參數(shù)控制電滲流的大小和方向，可提高毛細(xì)管電泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度。 11二、分離模式 1 毛細(xì)管區(qū)帶電泳

5、2 膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳 3 毛細(xì)管凝膠電泳 4 毛細(xì)管等速電泳 5 毛細(xì)管等電聚焦121 毛細(xì)管區(qū)帶電泳 CZE 也稱為毛細(xì)管自由溶液區(qū)帶電泳 毛細(xì)管電泳中最基本的操作模式，應(yīng)用最廣泛，是其它各種操作模式的母體 13川芎中川芎嗪和阿魏酸含量的毛細(xì)管電泳測(cè)定電泳條件： 電泳溶液硼砂30 mmol.L-1 (pH 9.43),檢測(cè)波長(zhǎng)295 nm,34 kPa.s壓力進(jìn)樣，17 kV恒壓電泳，電泳時(shí)間10 min，電泳溫度20，進(jìn)樣分析溶液中均含硼砂3.0 mmol.L-1 (pH=9.43)。 為消除進(jìn)樣等因素所引起的誤差，采用內(nèi)標(biāo)定量法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p-NBA出峰時(shí)間在LIG與FA之間，在優(yōu)化條件

6、下樣品中雜質(zhì)對(duì)其無(wú)干擾，峰形好，用它作內(nèi)標(biāo)可明顯改善分析精密度，故選定p-NBA為內(nèi)標(biāo)，在進(jìn)樣分析溶液中濃度為60 g.mL-1。14Ligustrazin 川芎嗪2. p-NBA對(duì)硝基苯甲酸3. Ferulic acid阿魏酸152 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜 MECC 以膠束為假固定相的一種電動(dòng)電泳 在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當(dāng)溶液中表面活性劑濃度超過(guò)臨界膠束濃度時(shí)，表面活性劑中的疏水基團(tuán)可形成膠束，溶質(zhì)因淌度和分配系數(shù)的不同而分離。 16SDS膠束的結(jié)構(gòu)示意里面有一個(gè)疏水內(nèi)核，外面布滿了S03離子。17測(cè)定半夏等藥材中苯甲酸的含量 SDS應(yīng)用：分離中藥熊膽中磷脂主組分 SDC（脫氧膽酸鈉）

7、測(cè)定紅絲線提取物中紫藍(lán)素的含量 -CD 183 毛細(xì)管凝膠電泳 CGE 將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。 蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無(wú)關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離。19毛細(xì)管凝膠電泳綜合了電泳技術(shù)和平板凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn) :電泳峰尖銳，柱效極高短柱上實(shí)現(xiàn)極好的分離試樣容量為1012g主要缺點(diǎn):制備柱較困難，壽命較短 已成為分離分析生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、核 酸、DNA等強(qiáng)有力的工具。例應(yīng)用CGE分離與激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)相結(jié)合，用于DNA序列快速分析。204 毛細(xì)管等速電泳 CITP 建立在試樣中各組分的電

8、泳淌度不同，等速電泳中被分析試樣進(jìn)樣前后分別使用前導(dǎo)電解質(zhì)溶液和終結(jié)電解質(zhì)溶液，分離后的各組分區(qū)帶以相同的電泳遷移速度通過(guò)檢測(cè)窗口。 前導(dǎo)電解質(zhì)的電泳淌度應(yīng)高于試樣中各組分的電泳淌度，而終結(jié)電解質(zhì)的電泳淌度則反之。2122假定有區(qū)帶 L， A， B， C， T， 則各區(qū)帶的移動(dòng)速度為：v T = v A = v B = v C = v L或： T E T = A E A = B E B = C E C = L E L式中，有效淌度， E，電場(chǎng)強(qiáng)度由于 T A B C L ，所以有: E T E A E B E C E L 各區(qū)帶的電場(chǎng)強(qiáng)度不同。前導(dǎo)電解質(zhì)區(qū)帶的電場(chǎng)強(qiáng)度最小。23若某一區(qū)帶的離子進(jìn)入前一區(qū)帶， 由于電場(chǎng)強(qiáng)度變小而減速，由若進(jìn)入到下區(qū)帶，由于電場(chǎng)強(qiáng)度變大而加速， 都退回到原區(qū)帶, 結(jié)果導(dǎo)致各區(qū)帶形成鮮明的界面.245 毛細(xì)管等電聚焦 CIEF1、毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（68V）時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步升高的pH梯度；2、氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中性，淌度為零；3、聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場(chǎng)力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)