1、實時熒光定量PCR聚合酶鏈反應(yīng)( PCR) 技術(shù)自1985年問世以來，以其靈敏性高、特異性強和速度快在分子生物學(xué)等科研領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但是，由于傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，在操作過程中易受污染而使假陽性率偏高; 因此，使其應(yīng)用受到限制。實時熒光定量PCR技術(shù)擁有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，已成為了分子生物學(xué)研究的重要工具，Real-time qPCR就是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。由于常規(guī)的PCR的缺點，real-time

2、qPCR由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點發(fā)展非常迅速。現(xiàn)在已經(jīng)涉及到生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，比如基因的差異表達分析，SNP檢測，等位基因的檢測，藥物開發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。一、實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。在熒光定量PCR 中，對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行實時監(jiān)測和連續(xù)分析熒光信號，隨著反應(yīng)時間的延續(xù)，監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，在PC

3、R 反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點檢測PCR產(chǎn)物的量，并由此可以推斷模板最初的含量。為了準(zhǔn)確判斷樣品中某基因產(chǎn)物的起始拷貝數(shù)，熒光定量PCR采用參數(shù)“Ct”值，Ct值(cyclethreshold) 是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可以繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出該樣品的起始拷貝數(shù)。一般來講，定量PCR儀包括：實時熒光定量PCR儀主要由樣品載臺、基因擴增熱循環(huán)組件、微量熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)、微電路控制系統(tǒng)、計算機及應(yīng)用軟

4、件組成。其中基因擴增熱循環(huán)組件工作原理與傳統(tǒng)基因擴增儀大致相同，不同廠家不同型號的產(chǎn)品分別采用空氣加熱、壓縮機制冷、半導(dǎo)體加熱制冷等工作方式。獨特是這個微量熒光檢測系統(tǒng)。有由熒光激發(fā)光學(xué)部件、微量熒光檢測部件、光路、控制系統(tǒng)組成。常用的熒光激發(fā)方式有兩種：鹵鎢燈和LED；熒光檢測元件常用兩種方式：光電倍增管和冷光CCD攝像機，光單色元件有濾光片和光柵。在實時PCR擴增過程中，熒光信號被收集，轉(zhuǎn)化為成為擴增和熔解曲線。具體數(shù)據(jù)就是基線，熒光閾值和Ct值。二、Real-time qPCR基本步驟及實驗設(shè)計 （一）實驗材料的處理和準(zhǔn)備以最基本的基因表達差異分析為例。實驗材料分為對照組（CON）和處理

5、組（TRT）。組內(nèi)要有生物重復(fù)，可以數(shù)據(jù)分析此處理是否有統(tǒng)計意義。在材料收集過程中，盡量避免RNA的降解（尤其對于絕對定量的樣品）。一般傳統(tǒng)的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍，然后迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由于對于異地取材?，F(xiàn)在新技術(shù)的發(fā)展，也有一些非液氮類的樣品儲存液 ，比如百泰克的RNAfixer 。 （二）引物設(shè)計 一般real-time PCR引物的設(shè)計遵循下面一些原則：擴增產(chǎn)物長度在80150bp。引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。產(chǎn)物長度一般在1530堿基之間。G+C含量在40%60%之間。堿基要隨機分布。引物自身不能有連續(xù)4

6、個堿基的互補。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物5端可以修飾。引物3端不可修飾。引物3端要避開密碼子的第3位。 （三）RNA提取和反轉(zhuǎn)錄在抽提RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實際的操作中應(yīng)遵循下面一些原則： = 1 * GB3 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。 = 2 * GB3 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實驗室可能用RNA

7、酶A或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品可能富含RNA酶。 = 3 * GB3 在提取裂解液中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。當(dāng)然，這些也不是絕對的要求。如果是操作熟練。完全可以用初次開封的離心管和槍頭，新過濾的超純水，進行RNA的提取。（三）Mix配制一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈

8、敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統(tǒng)計分析。通常來講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1l或者1l的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達豐度進行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗值，在操作過程中，還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進行優(yōu)化，達到一個最佳反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系配置過程中，有下面幾點需要注意： = 1 * GB3 MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。 = 2 * GB3 更多的配制Mix進行，減少加樣誤差。最

9、好能在冰上操作。 = 3 * GB3 每管或每孔都要換新槍頭，不要連續(xù)用同一個槍頭加樣。 = 4 * GB3 所有成分加完后，離心去除氣泡。 = 5 * GB3 每個樣品至少3個平行孔。 通常來講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80-150bp之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBRGreen等染料法，最好在PCR擴增程序結(jié)束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個在產(chǎn)物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。（四）儀器設(shè)置所有儀器的操作都基本一致

10、。設(shè)置的時候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以ABI StepOne為例，詳細看一下反應(yīng)設(shè)置： A. 首先是實驗?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。 B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法，F(xiàn)ast程序，以cDNA為模板進行。C. 目的基因的設(shè)置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。 D. 樣品的設(shè)置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。 E. 對照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個是為后面的定量做準(zhǔn)備。F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的

11、MasterMix。比如BioTeke的95 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是9515秒，6015秒的40個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說明書上建議的程序。 G. 反應(yīng)體系的設(shè)置： A-G這五個步驟簡單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進行反應(yīng)。需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none”。設(shè)置好之后，就可以把配置好的

12、PCR管放進儀器，點擊RUN。 三、實時熒光定量PCR的定量方法實時熒光定量PCR的定量方法有2種，即絕對定量法和相對定量法。絕對定量法是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本量；相對定量法是在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列量的變化，由于每個模板Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，利用已知起始DNA 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品即可繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。（一）絕對定量法絕對定量法指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知樣本的量，此方法要預(yù)先知道標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度并作為模板進行PCR反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的Ct值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。對未知樣品進行定量時根據(jù)未知樣品的Ct值

13、，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中推出樣品的起始拷貝數(shù)。（二）相對定量法比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量法相對定量法指的是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本量的變化。由于該方法中量的表達是相對于某個參照物而言的；因此，相對定量法的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較容易制備，對于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只需知道其稀釋度即可。在整個試驗中，待測樣本靶序列的量來自標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后必須除以參照物的量，其他的樣本為參照物量的n倍。在試驗中為了準(zhǔn)確加入反應(yīng)體系的RNA或DNA，通常在反應(yīng)中擴增1個內(nèi)源管家基因作為參照基因，由于管家基因在各種組織中的恒定表達，所以可用來作為標(biāo)準(zhǔn)，比較來源不同的樣本目的基因表達量的差異。管理基因是用于比較目的基因拷貝數(shù)，根據(jù)內(nèi)參照補償

14、待測樣本核酸抽提過程中造成的目的基因損失，反應(yīng)體系內(nèi)是否存在擴增抑制因素及參照物標(biāo)準(zhǔn)化等。比較Ct值的相對定量法該方法是同時擴增待測靶基因片段和內(nèi)參照基因片段。這2個擴增反應(yīng)可以在2個反應(yīng)管中分別進行，也可以在同1個反應(yīng)管中進行，測得兩者的Ct值之差即Ct。該方法不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，與標(biāo)準(zhǔn)曲線法不同之處在于其運用了數(shù)學(xué)公式來計算相對量，前提是假設(shè)每個循環(huán)增加1倍的產(chǎn)物，以PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到Ct值來估算起始模板的量，一個循環(huán)(Ct=1)相當(dāng)于起始模板數(shù)的2倍。此方法節(jié)省試劑，操作簡便，但由于是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致為前提的，效率的偏移會影響對實際拷貝數(shù)的估計；因此，如何優(yōu)化反應(yīng)體

15、系，使得目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相等是該方法的難點。熒光定量PCR擴增曲線四、影響PCR及熒光PCR的其他因素引物的設(shè)計和選擇符合熒光PCR的探針并進行設(shè)計對于實時熒光PCR尤其重要?？梢哉f，不合理的設(shè)計意味著絕對的失敗。但是，好的設(shè)計并不等于好的實驗結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進行介紹。（一）引物退火溫度 引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55到70。退火溫

16、度一般設(shè)定比引物的Tm低5。設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機程序使用近鄰分析法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時可以如下進行：以低于估算的Tm5作為起始的退火溫度，以2為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5。或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先

17、進行5個循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。（二）引物濃度 引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5M。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則計算引物濃度。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計算的消光系數(shù)。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數(shù)（OD/mol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（mol/OD）。 一

18、般商業(yè)合成的引物以O(shè)D值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長的引物，1個OD加100l水后引物濃度為50pmol/l（50M）。也可以用 OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/mol），計算出一定的工作濃度下，引物的加水量。濃度(M)A260（OD/ml）稀釋系數(shù)消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD） 舉例：計算某寡HYPERLINK /yp/product-list-674.html核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10l稀釋100倍（加入990l）水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8nmol/OD，代入得：濃度0.2（OD/ml）1004.8（nmol/OD）

19、96nmol/ml96M（三）引物、探針的純度和穩(wěn)定性 定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產(chǎn)生是因為DNA合成化學(xué)的效率不是100。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3到5合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。 引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100M。也可以用雙蒸水溶解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20。以大于10M濃度溶于TE的

20、引物在-20可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15到30）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20保存至少1年，在室溫（15到30）最多可以保存2個月。 探針即寡HYPERLINK /yp/product-list-674.html核苷酸進行熒光基團的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記以后一般應(yīng)該純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時間可以高達一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)別。由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下，最好稀釋成2M（10），作為工作濃度分裝多支，避光保存。（四）熱啟動 熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的

21、方法之一。盡管Taq DNA HYPERLINK /yp/product-list-473.html 聚合酶的最佳延伸溫度在72，HYPERLINK /yp/product-list-473.html聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如定點突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的HYPERLINK /y

22、p/product-list-127.htmlPCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到HYPERLINK /yp/product-list-127.htmlPCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量

23、應(yīng)用。（五）鎂離子濃度 鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200MdNTP的實時HYPERLINK /yp/product-list-128.html定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實性。為了確定最佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進行鎂離子滴定。（六）模板質(zhì)量模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣

24、品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會抑制PCR。一些在標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA制備中使用的試劑，如HYPERLINK /yp/product-list-703.htmlSDS，在濃度低至0.01時就會抑制擴增反應(yīng)。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍HYPERLINK /yp/product-list-708.html去垢劑裂解液，以及FTAGeneGuardSystem，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)注意進行PCR反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR反應(yīng)的成功率。（七）模板濃度 起始模板的量對于獲得高產(chǎn)量很重要。對大多數(shù)PCR擴增和熒光 PCR擴增，104到106個起始目的分子

25、就足以觀測到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大?。ㄏ卤恚?。舉例說，100ng到1g的人類基因組DNA，相當(dāng)于3104到3105個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA 比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10100ng的量就足夠檢測了。當(dāng)然對模板做一個梯度稀釋，對于HYPERLINK /yp/product-list-128.html定量PCR 而言是非常容易，且能分析擴增效率。（八）防止殘余（Carry-over）污染PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊

26、被擴增。當(dāng)前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應(yīng)時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘余污染）?？梢栽赑CR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的HYPERLINK /yp/product-list-918.html移液管可以阻止氣霧劑進入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨加入。一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG

27、）移除DNA中的尿嘧啶。在擴增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因為前面的擴增產(chǎn)物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。五、Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析（一）Real-time qPCR常見參數(shù) 基線（baseline）通常是315個循環(huán)的熒光信號，同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線。閾值（threshold）：自動設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾

28、值。 Ct值：與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。分析定量時候一般取Ct：1535。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。 Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。 Rn：Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（Rn=Rn-基線）。 （二）影響Ct值的關(guān)鍵因素 模板濃度：模板濃度是決定Ct的最主要因素?？刂圃谝粋€合適范圍內(nèi)，使Ct在1535之間。反應(yīng)液成分的影響任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響-比如溶液的pH值和鹽濃度。 PCR反應(yīng)的效率：PCR反應(yīng)的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條

29、件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在90110%之間都是可以接受的。 （三）如何評估實時定量PCR反應(yīng)的效果 PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。 R2值：另一個評估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2，它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準(zhǔn)確預(yù)測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預(yù)測X值。R2值大于0.99時，兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。 精確度：標(biāo)準(zhǔn)偏差（standar

30、d deviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就??；如果許多數(shù)據(jù)點都遠離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。實際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)常可通過經(jīng)典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應(yīng)效率是 100%，那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應(yīng)該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于0.250。 靈敏度：無論CT絕對值是多少，任何

31、能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數(shù)為1的系統(tǒng)都達到了靈敏度的極限。PCR效率是決定反應(yīng)靈敏度的關(guān)鍵因素。在檢測極低拷貝數(shù)時的另一個重要的考慮因素是，低拷貝時的模板數(shù)量不能按普通情況來預(yù)期。相反，它會遵循泊松分布，即進行大量的平行重復(fù)，平均應(yīng)該含有一個拷貝的起始模板，實際上約37%不含有拷貝，僅有約37%含有1個拷貝，約18%實際上含有兩個拷貝。因此，為了更可靠地檢測低拷貝，必須做大量的平行重復(fù)實驗來提供統(tǒng)計顯著性，并克服泊松分布的限制。六、實時熒光定量PCR 的應(yīng)用實時熒光定量PCR 的應(yīng)用范圍很廣，目前主要用于腫瘤的診斷、細胞因子表達的分析、病原體的分子檢測、基因工程的研究等方面。（一）腫瘤的

32、診斷腫瘤基因遺傳學(xué)改變的積累是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因。癌基因的表達增加和突變在許多腫瘤早期和良性階段就可出現(xiàn)。實時熒光定量PCR技術(shù)不但能夠有效地檢測基因的突變，而且還能準(zhǔn)確地測定表達量，進行腫瘤的早期診斷和治療效果及預(yù)后的判斷。該技術(shù)的應(yīng)用已成為檢測腫瘤微小殘留分子標(biāo)志的一種必備的研究工具。曹恒斌等應(yīng)用實時熒光定量PCR 方法成功證實肌細胞增強因子2與肝癌之間有密切關(guān)系。陳公琰等利用實時熒光定量PCR法檢測hTERT mRNA 表達，證實端粒酶參與了人肺腺癌Anip973 /NVB 細胞的MDR，可將端粒酶作為逆轉(zhuǎn)耐藥的新靶點。（二）細胞因子的表達分析細胞因子在體內(nèi)作為一種調(diào)節(jié)蛋白，其表達和分泌都受到嚴(yán)格的調(diào)控。在某些病理情況下，細胞因子的表達會出現(xiàn)異常，通過實時熒光定量PCR 技術(shù)可以對細胞因子的mRNA進行定量，來估算其蛋白表達量，從而可以對某些疾病進行診斷和研究。另外，細胞因子通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)在機體的免疫系統(tǒng)中起著核心作用。為了闡明在許多炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、器官移植