1、酒精性肝病與肝細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究【關(guān)鍵詞】酒精性肝病1乙醇體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與TGF和抗as單克隆抗體對(duì)肝細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用相似1,低濃度的乙醇可以在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞發(fā)生凋亡2。由于腫瘤細(xì)胞的易培養(yǎng)性,往往以肝癌細(xì)胞代替肝細(xì)胞建立乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。乙醇可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系ep2細(xì)胞凋亡,并且其誘導(dǎo)凋亡的效果強(qiáng)于絲裂霉素3。用不同濃度的乙醇作用于ep2細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞系細(xì)胞不同時(shí)間之后,每例取6103個(gè)細(xì)胞進(jìn)展透射電鏡分析。發(fā)現(xiàn)乙醇對(duì)肝細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)于對(duì)肝癌細(xì)胞的作用P0.05,而且肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生程度與乙醇的濃度和作用時(shí)間顯著正相關(guān)P0.014。2酒精性肝病

2、中的肝細(xì)胞凋亡aahara等5用免疫組化法檢測(cè)了凋亡相關(guān)抗原eis在20例LD患者平均每天攝入酒精80以上的肝活檢組織的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)含allry小體的肝細(xì)胞呈eis抗原陽(yáng)性表達(dá),提示至少局部含allry小體的肝細(xì)胞以凋亡的方式被去除。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明,LD組織的凋亡發(fā)生率明顯高于正常肝組織,并且在氣球樣變性、膽汁淤積、炎癥區(qū)和結(jié)節(jié)性肝硬化部位更為明顯6。ldin等7用連續(xù)23天乙醇蒸汽吸入法建立了小鼠LD模型。在21只正常對(duì)照小鼠中,只有36%的肝末端小靜脈可見(jiàn)凋亡小體,并且這些凋亡小體中的88%位于中央靜脈周?chē)鷥膳诺母渭?xì)胞。實(shí)驗(yàn)組41只小鼠中,72%的肝末端小靜脈可見(jiàn)凋亡小體,并且

3、這些凋亡小體大多數(shù)不只是位于中央靜脈周?chē)鷥膳诺母渭?xì)胞,肝細(xì)胞凋亡程度與肝細(xì)胞損傷程度親密相關(guān)。在停頓吸入酒精蒸氣后,肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象逐漸減輕,并且經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后肝組織構(gòu)造可完全恢復(fù)正常。說(shuō)明LD中凋亡小體產(chǎn)生的數(shù)量和位置具有時(shí)間依賴性,肝組織損傷具有可復(fù)性。aini等8在用定量分析法證實(shí)了大鼠慢性酒精中毒肝細(xì)胞凋亡率上升的趨勢(shì)之后,用以rdU檢測(cè)分裂期細(xì)胞的方法說(shuō)明,其肝細(xì)胞增殖率也明顯上升。在大鼠LD的逐步開(kāi)展過(guò)程中,不僅凋亡的肝細(xì)胞不斷增多,而且肝細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原陽(yáng)性率也不斷增高9。在小型豬LD模型中也可見(jiàn)到不僅肝細(xì)胞凋亡小體隨著LD的開(kāi)展而明顯增多,肝細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率也逐漸增高10。

4、提示在LD中肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及其再生修復(fù)同時(shí)存在。3酒精性肝病中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)活力制關(guān)于LD中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)活力制尚未完全說(shuō)明,目前認(rèn)為其主要與以下幾種因素有關(guān):1肝細(xì)胞色素45021YP21的活化。在正常肝臟中,YP21主要分布在中央靜脈周?chē)母渭?xì)胞,此處正是LD病理?yè)p傷的好發(fā)部位。在LD組織中,YP21活性普遍較高。YP21具有很強(qiáng)的ADPH氧化酶活性,可使乙醇氧化生成羥乙基根,使肝細(xì)胞反響性氧中間產(chǎn)物和脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物增多,產(chǎn)生對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用,引起肝細(xì)胞凋亡。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)把YP21基因轉(zhuǎn)染到epG2細(xì)胞中,并使其穩(wěn)定表達(dá)。在乙醇誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)染YP21基因的細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更容易發(fā)

5、生凋亡YP21拮抗劑，抗氧化劑都可以對(duì)抗乙醇對(duì)肝細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用11。從大豆中提取的一種多聚不飽和卵磷脂可以降低乙醇特異性YP21的產(chǎn)生和對(duì)抗氧化,從而減輕乙醇引起的肝細(xì)胞凋亡,說(shuō)明YP21確實(shí)在乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中具有重要的作用12。2肝臟鐵負(fù)荷增加。鐵可催化自由基的生成,并增強(qiáng)肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反響。在大鼠飲食中參加碳酸鐵,可加重其LD所致的肝損傷,使肝細(xì)胞凋亡程度增加13。3腫瘤壞死因子TNF和TNF受體的活性增高。用乙醇誘導(dǎo)凋亡的epG2細(xì)胞與凋亡前相比,-表達(dá)程度增高了35倍,-1和-6的程度也分別有所增高14。乙醇可以阻止-激活肝細(xì)胞內(nèi)對(duì)氧化復(fù)原作用敏感的轉(zhuǎn)錄因子k,使肝細(xì)胞增殖活

6、性下降,肝細(xì)胞對(duì)lx等生存基因的表達(dá)減弱,破壞-和其他與肝細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有關(guān)的細(xì)胞因子對(duì)肝臟的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用15。4促氧化物增多和抗氧化物減少造成的氧應(yīng)激反響。乙醇代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化劑可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡,并使DNA產(chǎn)生片段化。谷胱甘肽等細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑可以對(duì)抗乙醇引起的肝細(xì)胞凋亡16。用共聚焦顯微鏡研究的結(jié)果顯示,可以對(duì)抗乙醇引起的氧化壓力的試劑可有效地減輕乙醇引起的肝細(xì)胞凋亡或壞死。并且,細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑的抑制劑可以加重乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡17。5肌纖維母細(xì)胞和TGF-的誘導(dǎo)凋亡作用在LD中,來(lái)自肝星狀細(xì)胞的肌纖維母細(xì)胞不僅可以合成和分泌一些膠原和非膠原基質(zhì)蛋白,而且可使成纖維生長(zhǎng)因子TG

7、F-的分泌增加。TGF-是一種公認(rèn)的肝細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。ressner等18別離了大鼠的肌纖維母細(xì)胞,并在體外觀察此肌纖維母細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。發(fā)現(xiàn)當(dāng)肌纖維母細(xì)胞分泌TGF-時(shí),用DNA熒光染料ehst33342染色可見(jiàn)肝細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化,TUNEL法檢測(cè)顯示有很多明顯的陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),并可用瓊脂糖凝膠電泳觀察到凋亡細(xì)胞特有的梯狀DNA片段化。當(dāng)肌纖維母細(xì)胞不分泌TGF-時(shí),肝細(xì)胞未見(jiàn)明顯的凋亡發(fā)生。提示肝臟的肌纖維母細(xì)胞可能通過(guò)增加TGF-的分泌來(lái)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。6某些凋亡相關(guān)分子的變化。LD肝組織的D95受體及其配體表達(dá)程度普遍增高,細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞TL可以通過(guò)D95受體和

8、配體的互相作用啟動(dòng)細(xì)胞凋亡13。eaiu等19用給大鼠連續(xù)7天喂食含乙醇液體飲食的方法建立了LD模型。別離LD大鼠的肝細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞之后分別檢測(cè)其aspase3表達(dá)程度,發(fā)現(xiàn)均較正常對(duì)照組明顯增高。乙醇誘導(dǎo)的epG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中aspase1和aspase3表達(dá)程度明顯增高,并可分別被IE蛋白抑制劑和bl2基因轉(zhuǎn)染所抑制11。提示上述凋亡相關(guān)分子的變化可能在LD肝細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中具有一定的作用。4內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子炎癥介質(zhì)和或細(xì)胞因子對(duì)酒精性肝病的形成具有重要的作用20。酒精的攝入可致炎癥細(xì)胞對(duì)炎癥刺激過(guò)度的反響產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)和或細(xì)胞因子,即所謂的激發(fā)和致敏。一

9、方面,肝細(xì)胞損傷后,可發(fā)生肝本質(zhì)細(xì)胞的凋亡和壞死,激活肝內(nèi)的upffer細(xì)胞和血循環(huán)中的單核細(xì)胞。另一方面,酒精性肝病時(shí),因腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)、腸黏膜通透性增加、腸細(xì)菌移位以及正常的免疫功能受抑制等,導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥21。內(nèi)毒素不僅可直接損傷肝細(xì)胞,更重要的是內(nèi)毒素還與Kupffer細(xì)胞特異受體D14及TLR4lllikereeptr4結(jié)合激活該細(xì)胞。進(jìn)而可釋放大量的氧自由基、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),如TNF-、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-、TGF-、PDGF等。不僅如此，細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞因子受體表達(dá)也增加。多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)可引起肝細(xì)胞進(jìn)一步壞死、凋亡、炎癥和肝纖維化形成。尤

10、其是腸源性內(nèi)毒素血癥在LD的形成過(guò)程中的作用至關(guān)重要,內(nèi)毒素可使Kupffer細(xì)胞釋放TNF-和,誘發(fā)肝細(xì)胞壞死與凋亡,并發(fā)現(xiàn)TNF-與各種細(xì)胞膜上的受體結(jié)合可增加細(xì)胞內(nèi)活性氧形成,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。不僅如此,對(duì)酒精性肝病時(shí)upffer細(xì)胞TNF-表達(dá)上調(diào)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),慢性酒精的攝入能增加內(nèi)毒素刺激的細(xì)胞外受體活性激酶1/2ERK1/2的活性,促進(jìn)早期生長(zhǎng)反響因子1Egr1的表達(dá),并使gr1與TNF-啟動(dòng)子結(jié)合力增加。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明ALD血循環(huán)中TNF-明顯升高,運(yùn)用TNF-中和抗體能減輕酒精所致大鼠的肝損傷。通過(guò)飲食含乳酸桿菌食物或用多粘菌素或新霉素等抗生素,改善腸黏膜的屏障功能、抑制

11、腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)以減少內(nèi)毒素的生成等措施,均能明顯減輕實(shí)驗(yàn)性酒精性肝病的嚴(yán)重程度。應(yīng)用氯化釓dI3選擇性破壞枯否細(xì)胞,可在很大程度上阻斷酒精性肝病的發(fā)生,阻斷內(nèi)毒素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),均能減輕酒精性肝損傷22,23。5總結(jié)綜上所述,乙醇不僅可以在體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞凋亡,而且動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí),LD中肝細(xì)胞凋亡率明顯增高,肝細(xì)胞凋亡與LD病變的發(fā)生和開(kāi)展過(guò)程親密相關(guān)。目前,在乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與LD關(guān)系的研究中有待于解決的問(wèn)題主要是:1LD動(dòng)物模型的建立。盡管已經(jīng)用含乙醇液體飼料喂養(yǎng)、酒精灌胃和乙醇蒸氣吸入等方法建立了許多大鼠、小鼠和狒狒等動(dòng)物的LD模型,但是其與人類LD的病理變化仍有一定程度的差

12、異。其中,以用狒狒建立的模型最接近于人類LD,但是狒狒模型還存在價(jià)格昂貴,不易操作和結(jié)果不易重復(fù)的缺點(diǎn)。目前尚缺乏既能比擬完全地模擬人類LD的病理變化,又簡(jiǎn)便易行的動(dòng)物模型;2LD中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)活力制尚不明確。盡管已經(jīng)明確了LD中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生與YP21的活化,鐵負(fù)荷增加,和受體活性增高,促氧化物增多和抗氧化物減少造成的氧應(yīng)激反響,肌纖維母細(xì)胞和TGF-的誘導(dǎo)凋亡作用以及某些凋亡相關(guān)分子的變化親密相關(guān),但是其詳細(xì)的作用機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不清楚;3LD中肝細(xì)胞凋亡與抗凋亡的平衡機(jī)理。在LD中,肝細(xì)胞不僅發(fā)生凋亡,其增殖功能也變得異常活潑,PNA指數(shù)和rd數(shù)值都明顯增高,說(shuō)明伴隨著乙醇誘導(dǎo)肝

13、細(xì)胞凋亡的發(fā)生,肝細(xì)胞發(fā)生了再生。在LD中,肝細(xì)胞凋亡率明顯增高的同時(shí),肝臟膽管上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的l2蛋白表達(dá)程度也明顯上升9。說(shuō)明LD中還存在著肝細(xì)胞凋亡和肝臟抗凋亡的動(dòng)態(tài)平衡問(wèn)題。目前對(duì)這一問(wèn)題尚缺乏比擬深化的認(rèn)識(shí)。隨著新的凋亡相關(guān)分子的逐漸發(fā)現(xiàn),以及對(duì)LD發(fā)病機(jī)制的深化研究,乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與LD的關(guān)系會(huì)得到進(jìn)一步明確,LD中肝細(xì)胞凋亡的發(fā)活力制也必然會(huì)得到進(jìn)一步提醒。【參考文獻(xiàn)】1楊連君,王文亮.乙醇體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與酒精性肝病.臨床實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2001,171:12.2Rdrigues,FanG,aX，etal.navelrlefrursdexYhliaidininhibi

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