1、高級(jí)植物生理實(shí)驗(yàn)報(bào)告植物營(yíng)養(yǎng)農(nóng)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)東保柱20132020542013年12月27日實(shí)驗(yàn)1植物組織銨態(tài)氮含量的測(cè)定（茚三酮比色法）一、實(shí)驗(yàn)原理植物吸收的氮主要是氨態(tài)氮和硝態(tài)氮，后者經(jīng)過(guò)還原過(guò)程形成氨，前者經(jīng)同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白質(zhì)。測(cè)定氨態(tài)氮的方法有多種，本實(shí)驗(yàn)為改良的茚三酮比色法。a-氨基酸與水合茚三酮溶液一起加熱，經(jīng)氧化脫氨變成相應(yīng)的a-酮酸，酮酸進(jìn)一步脫羧變成醛，水合茚三酮?jiǎng)t被還原，在弱酸環(huán)境中，還原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反應(yīng)，縮合生成藍(lán)紫色物質(zhì)。根據(jù)藍(lán)紫色的深淺，在580nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。本實(shí)驗(yàn)中在茚三酮試劑中添加乙二醇并補(bǔ)加正丁醇和丙醇

2、，可以克服茚三酮的不穩(wěn)定性。二、儀器設(shè)備研缽、燒杯、漏斗、量筒、具塞試管、三角瓶、容量瓶、移液管、天平、沸水浴鍋、可見分光光度計(jì)三、試劑10%醋酸（lOOmL）1%抗壞血酸（lOOmL）5pg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g定容至lOOOmL）pH5.4醋酸緩沖液：8.8mL0.2mol/L醋酸（冰醋酸11.55mL稀釋至lOOOmL）加41.2mLO.2mol/L醋酸鈉（醋酸鈉16.4g或三水醋酸鈉27.2g配成lOOOmL）。水合茚三酮試劑：l.lg茚三酮放到燒杯中，加入15mL正丙醇，搖勻，溶解，后加入3Oml正丁醇和6Oml乙二醇，混勻，再加9mLpH5.4醋酸緩沖液，混勻。保存

3、于棕色瓶中，冰箱保存，適用期限1O天。四、操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以下表所示量從5pg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液中分別取溶液并在每個(gè)試管中加蒸餾水至2mL，對(duì)照加2mL蒸餾水，后在各試管中加入3mL水合茚三酮試劑和0.1mL1%抗壞血酸，搖勻。蓋上試管塞，于沸水中加熱15分鐘，取出后攪拌冷卻15分鐘。冷卻后的有色溶液中加無(wú)水乙醇至10mL，在波長(zhǎng)580nm處測(cè)吸光值，以銨態(tài)氮濃度（|Jg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試管號(hào)1234567試劑（mL）00.20.40.81.21.61.8銨態(tài)氮濃度（Mg/mL）00.512345稱取0.5g新鮮植物材料，放入研缽中，加入5mL10%醋

4、酸，研磨后以蒸餾水稀釋至100mL，混勻，通過(guò)濾紙過(guò)濾，棄去最先濾下的一部分濾液后過(guò)濾到100mL三角瓶中。從剩下的濾液中取2mL放入試管中，加3mL水合茚三酮試劑和0.1mL1%抗壞血酸，搖勻。蓋上試管塞，于沸水中加熱15分鐘。同時(shí)將盛有對(duì)照溶液（提取液用蒸餾水代替）的試管加熱。取出后攪拌冷卻15分鐘。加熱形成的紅色茚三酮試劑被氧氧化而褪色，茚三酮與氨基酸形成的藍(lán)紫色反應(yīng)產(chǎn)物仍然存留并變得更加鮮明。冷卻后的有色溶液中加無(wú)水乙醇至10mL，混勻。在波長(zhǎng)580nm處測(cè)光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得數(shù)值代入以下公式計(jì)算銨態(tài)氮含量。樣品c值:1.436、1.435、1.436、1.435（0.1X10X

5、C）X（100g樣品中的氨態(tài)氮毫克數(shù)）=X100（2Xn）C：比色液中氨態(tài)氮濃度（Ug/mL）10：比色液體積（mL）n：樣品重量（g）100：分析溶液總體積（mL）0.1：Mg換算成mg并折算成100g物質(zhì)中含量的換算系數(shù)。實(shí)驗(yàn)2植物體內(nèi)硝態(tài)氮含量的測(cè)定一、原理在濃酸條件下，N0-與水楊酸反應(yīng)，生成硝基水楊酸。生成的硝基水楊3酸在堿性條件下(PH12)呈黃色，最大吸收峰在波長(zhǎng)4處，可直接比色測(cè)定。二、儀器和設(shè)備分光光度計(jì)、天平、刻度試管、移液器、移液管、容量瓶、漏斗、水浴鍋、濾紙三、試劑500mg/LN0-N標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取KNO0.3611g溶于蒸餾水中，定容至100mL。335%水楊酸-硫

6、酸溶液：稱取5g水楊酸溶于lOOmL濃硫酸中，攪拌溶解后，貯藏于棕色瓶中。3.8%NaOH溶液：8.695gNaOH溶于lOOmL蒸餾水中。四、方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作吸取500mg/LNON標(biāo)準(zhǔn)溶液0,1,2,3,4,6,8mL分別放入50mL3容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，使之成為0、10、20、30、40、60、80mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL，分別放入刻度試管中，以0.1mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白。再分別加入0.4mL5%水楊酸-硫酸溶液，搖勻，在室溫下放置20分鐘后，再加入8%NaOH溶液9.5mL，搖勻冷卻至室溫。顯色液總體積為10mL。以空白作參比，在410

7、nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度。以NO-N濃度為橫坐3標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出回歸方程。硝酸鹽的測(cè)定1)樣品液的制備：取2g植物材料切碎后放入刻度試管中，加入10mL蒸餾水，封口。置于沸水浴中提取30分鐘，冷卻，將提取液過(guò)濾到25mL容量瓶中,并反復(fù)沖洗殘?jiān)?，最后定容至刻度。?）樣品液的測(cè)定：吸取樣品液O.lmL分別放入刻度試管中，加入5%水楊酸-硫酸溶液0.4mL，混勻后置室溫下20分鐘，再慢慢加入9.5mL8%NaOH溶液,待冷卻至室溫后以空白作對(duì)照，在410nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得或用回歸方程計(jì)算出NO-N濃度，再用以下公式計(jì)算其含量。3NON含量（mg/g）=（DX樣品液總量）/樣品鮮重3D：標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得NON濃度（mg/L）3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)四植物營(yíng)養(yǎng)4.1植物體內(nèi)硝態(tài)氮含量測(cè)定硝酸根離子含量和吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線如下所示：如圖所示：標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性系數(shù)為0.9344，線性關(guān)系良好樣品硝態(tài)氮含量?jī)芍貜?fù)分別為：1.435、1.436，平均值為1.4355.則每