1、中國非小細(xì)胞肺癌患者EGFR T790M基因突變檢測專家共識本文來源：中華醫(yī)學(xué)雜志,2018,98（32） : 2544-2551.表皮生長因子受體（EGFR）!因突變是東亞人群中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC跟常 見的驅(qū)動基因突變，發(fā)生率為30%-40%既往多項(xiàng)研究支持EGFR酪氨酸激酶抑 制齊IJ（TKI）單藥治療是EGF磯因突變局部晚期或轉(zhuǎn)移NSCLCI者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案， 但大多數(shù)患者會在用藥后914個月發(fā)生耐藥，其中EGFFS因第20號外顯子發(fā) 生錯義突變（即T790M突變）是耐藥突變中最主要的類型。目前已報(bào)道的EGFR-TKI 耐藥后組織樣本的T790M突變陽性率基本在60溢右，不同技術(shù)方

2、法檢測結(jié)果較 為相似，但是血漿樣本T790M突變陽性率基于不同方法差別較大，在23%-63%奧希替尼是一種口服、強(qiáng)效、不可逆，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性，選擇性抑制 EGF微感突變和丁790呱變的三代EGFR-TKI同時(shí)對EGF的生型細(xì)胞作用較弱， 減少了相關(guān)不良事件的發(fā)生。一項(xiàng)隨機(jī)田期臨床研究 AURA3寸比了奧希替尼和含 柏雙藥化療治療一線EGFR-TKI耐藥后組織T790M陽性的晚期NSCLCt者，結(jié)果 顯示，對比標(biāo)準(zhǔn)化療，奧希替尼可顯著延長中位無進(jìn)展生存期（PFS）。R期、開放性、單臂、中國注冊臨床研究AURA171示了奧希替尼在EGFR-TK耐藥后組織 丁790般變陽性亞太及中國人群中的療

3、效，客觀緩解率（ORRM 63%中位PFS9.7 個月?；谏鲜鲅芯?，奧希替尼于2017年3月22日被中國國家食品藥品監(jiān)督管 理總局（CFDA）ft匕準(zhǔn)用于既往經(jīng)EGFR-TKI治療時(shí)或治療后出現(xiàn)疾病進(jìn)展，并且經(jīng) 檢測確認(rèn)存在EGFRT790M突變陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCL誠人患者的治療。 目前，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）歐洲臨床月中瘤協(xié)會（ESMO指南、中國臨床 月中瘤學(xué)會（CSCO原發(fā)性肺癌診療指南均推薦奧希替尼為局部晚期或轉(zhuǎn)移NSCLCEGFR-TKI而寸藥后丁790酸變陽性患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。EGFR T790M突變的才測對EGFR-TK耐藥的晚期NSCLC&者的后續(xù)治療具有 重

4、要的臨床指導(dǎo)意義，但是我國目前尚無這方面的共識。應(yīng)推薦何種人群進(jìn)行 T790M僉測？如何掌握T790Ml勺檢測時(shí)機(jī)？如何選擇檢測樣本？不同類型的樣本 在取材、固定和檢測技術(shù)選擇、應(yīng)用時(shí)應(yīng)該如何規(guī)范？這些臨床檢測實(shí)踐問題亟 待解決。共識制定方法本工作得到CSCO中瘤生物標(biāo)志物專家委員會的支持，由廣東省人民醫(yī)院吳 一龍教授牽頭，成立共識撰寫專家組，組織國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的臨床和病理學(xué)專家， 對中國NSCLC&者EGFR T790加因突變臨床檢測實(shí)踐中涉及的上述問題進(jìn)行反 復(fù)討論，基于現(xiàn)有的高質(zhì)量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)和經(jīng)專家廣泛認(rèn)可的臨床經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)參考國內(nèi)外最新相關(guān)指南達(dá)成如下專家共識，以規(guī)范國內(nèi)T790M臨床檢

5、測實(shí)踐。本共識中的推薦均有國內(nèi)外高質(zhì)量文獻(xiàn)作為參考依據(jù)，在共識撰寫時(shí)專家組對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)性檢索與分析，使用關(guān)鍵詞 非小細(xì)胞肺癌/Non-small cell lung cancer/NSCLC,獲得性耐藥/acquired resistance , T790M, 生物標(biāo)志物/biomarker等在PubMed,Google Scholar等公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行文獻(xiàn) 檢索。本共識專家組證據(jù)或共識水平的定義：（1）1類：表示該推薦內(nèi)容基于高水 平的證據(jù)，具有明確的優(yōu)勢，并且在本共識專家組成員中具有廣泛的共識，建議值得信賴。（2）2A類：表示該項(xiàng)基于臨床經(jīng)驗(yàn)在內(nèi)的較低水平證據(jù)，需要權(quán)衡優(yōu) 勢和劣勢

6、，本共識專家組成員達(dá)成共識，因此該推薦是可以信賴的。（3）2B類:表示該項(xiàng)推薦內(nèi)容基于臨床經(jīng)驗(yàn)在內(nèi)的較低水平證據(jù)，本共識專家組成員對于該 建議的適宜性意見不一致，但無較大分歧。（4）3類：表示本共識專家組成員存 在較大分歧。本共識中所推薦的證據(jù)級別除了少數(shù)做特別說明之外，均在 2A類 以上。形成的共識（一）EGFR T790M基因突變的檢測人群及檢測時(shí)機(jī)【共識11建議既往接受過EGFR-TKI治療的局部晚期或轉(zhuǎn)移NSCLC&者疾病進(jìn) 展后都應(yīng)進(jìn)行EGFR T790幟變檢測，建議在影彳t學(xué)進(jìn)展后，考慮 T790M僉測（1 類）。EGFR-TKI治療后耐藥的NSCLC&者中T790MB突變率約為6

7、0%奧希替尼是 各權(quán)威指南推薦的這類T790M突變陽性患者的標(biāo)準(zhǔn)治療，為使患者盡可能地從最 有效的治療中受益，只要條件許可，所有既往接受過 EGFR-TKI治療的局部晚期 或轉(zhuǎn)移NSCLC&者都應(yīng)嘗試進(jìn)行T790M突變檢測。多項(xiàng)動態(tài)血漿監(jiān)測研究顯示，丁790酸變的發(fā)生早于實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) （RECIST）評估的影像學(xué)進(jìn)展，然而仍需要更多的研究去探索在影像學(xué)進(jìn)展前檢測 到T790M耐藥突變的患者中使用三代 EGFR-TKI是否能更多獲益。IMPRESSES 結(jié)果顯示EGFR?變陽性經(jīng)一代EGFR-TKI吉非替尼治療后發(fā)生RECISTW估影像 學(xué)進(jìn)展的T790帳變陽Tt晚期NSCLCM者繼續(xù)采用

8、吉非替尼聯(lián)合順柏培美化療較 安慰劑聯(lián)合化療總生存期（OS）顯著受損。提示一代EGFR-TKI治療影像學(xué)進(jìn)展后 T790M陽性突變患者繼續(xù)一代EGFR-TKI治療有可能對患者產(chǎn)生損害。因此在臨 床實(shí)踐中推薦在接受EGFR-TK胎療并發(fā)生RECIS所準(zhǔn)評估的影像學(xué)進(jìn)展后進(jìn)行 T790M僉測，以指導(dǎo)患者后續(xù)治療選擇。（二）EGFR T790Ms因突變檢測標(biāo)本【共識2】建議首先評估患者是否可進(jìn)行組織活檢，如組織可獲取，推薦先取組 織用于檢測T790M突變。國內(nèi)外權(quán)威指南與共識均推薦 T790M突變檢測組織優(yōu)先。2017年NCCN V9 指南建議：NSCLC&者接受吉非替尼、厄洛替尼或阿法替尼等一代或二

9、代 EGFR-TKI治療后發(fā)生耐藥進(jìn)展均應(yīng)及時(shí)進(jìn)行 T790幟變檢測，檢測時(shí)優(yōu)先進(jìn)行 組織檢測，若組織活檢不可及時(shí)，再考慮血漿檢測，如果血漿T790M僉測陰性，推薦重新進(jìn)行基于組織的檢測；2017年CSC防南也指出對于EGFR-TKI耐藥病 例，建議二次活檢進(jìn)行繼發(fā)耐藥 EGFRT790M僉測（ARMS&法，獲批試劑盒）；對 于不能獲取組織的患者，可行血漿 ctDNA EGFR 丁790所測。月中瘤組織仍然是目前耐藥檢測的首選樣本，除了進(jìn)行分子檢測外，組織形態(tài)學(xué)的改變例如NSCL3小細(xì)月fi肺癌（SCLC）的轉(zhuǎn)化，只能通過組織活檢診斷。多項(xiàng) 研究報(bào)道50%-80%勺耐藥患者可以接受二次活檢。肺

10、癌患者組織小樣本取材根 據(jù)方法不同，可主要分為經(jīng)支氣管鏡取樣和經(jīng)皮肺穿刺活檢，前者又主要包括經(jīng) 支氣管腔內(nèi)活檢術(shù)、常規(guī)及支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢，其中通過 支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)的活檢，可以有效地將氣胸和出血等發(fā)生率控制在2%；下，其他小樣本活檢的具體要求及注意事項(xiàng)可以參考肺癌小樣本取材相關(guān)問題的中 國專家共識。【共識3】在組織無法獲取時(shí)，可考慮采用其他樣本比如腫瘤細(xì)胞學(xué)樣本或者血 漿樣本進(jìn)行EGFR T790M&測（2A類）。肺癌細(xì)胞學(xué)樣本可以通過支氣管肺泡灌洗術(shù)，或從胸腔積液、痰液、腦脊液 等樣本中獲取。使用胸腔積液檢測 EGFRS因突變具有較高的敏感性和特異性， 且使用胸腔積液或腹

11、腔積液檢測 EGFRS因突變與組織相比有相似的陽性率和極 高的一致性，因此在既往的EGFRS因突變檢測共識中，均推薦細(xì)胞學(xué)樣本的使 用。2017年，美國病理學(xué)家協(xié)會（CAP）、國際肺癌研究協(xié)會（IASLC）、美國分子 病理學(xué)會（AMP）K合更新的分子檢測指南中推薦病理醫(yī)師可以使用細(xì)胞團(tuán)塊或其 他細(xì)胞學(xué)標(biāo)本作為肺癌分子檢測的合適標(biāo)本。細(xì)胞學(xué)樣本也適用于EGFR T790Ms變檢測。研究報(bào)道既往接受 EGFR-TKI 治療的EGFR?變陽性NSCLCM者的組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)樣本檢測 T790M突變一致性 達(dá)到91.7%。無論采用哪種標(biāo)本類型，均應(yīng)保證包含足夠的月中瘤細(xì)胞 （推薦月中瘤 細(xì)胞數(shù)量在200

12、個以上），盡量剔除非月中瘤組織和細(xì)胞。對于不能獲取組織或細(xì)胞學(xué)樣本的患者，還可收集血液樣本、腦脊液或尿液， 抽提ctDNA,用于EGFR T790陳變檢測。EGFR-TKI耐藥后血漿T790MK變陽性 患者與月中瘤組織T790M陽性患者接受奧希替尼治療有著相似的臨床獲益， 推薦作 為月中瘤組織不可獲取時(shí)的首選樣本。尿液樣本提取的ctDNA也可用于T790M僉測， 尿液T790M陽性的患者接受三代EGFR-TKI治療后的ORRf中位PFS與組織陽性 患者相似?！竟沧R4】對于血漿檢測陰性的患者建議密切關(guān)注患者的疾病狀態(tài)，重新評估組 織活檢的可行性，視情況再行組織或者其他樣本的EGFR T790MT

13、測（2A類）。既往多項(xiàng)奧希替尼的注冊臨床研究 ARUAS歹報(bào)道，血4陰性但組織T790M 陽性的患者接受奧希替尼治療后仍然有較高的 ORR（62% 70% AURAff究中血漿 樣本采用高敏感的BEAMin摩字PC昉法進(jìn)行T790M突變檢測，104例血漿檢測 陰性患者中47例經(jīng)組織樣本cobas檢測為陽性，這些患者的 ORR （69%匕25%） 和平均PFS（16.5比2.8個月）顯著高于血漿及組織樣本檢測均陰性的患者。AURA3 研究基線血漿樣本回顧性分析顯示， T790M組織陽性患者的血漿中有 23%- 27% 未能檢測到EGFR ctDNA進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ctDNA釋放情況與月中瘤大小相關(guān)

14、，基 線靶病灶較?。═的堿基突變導(dǎo)致，在FFPE樣本的制 備過程中，甲醛固定會導(dǎo)致DN儂生脫氨基現(xiàn)象,胞喀噬和5-甲基胞喀噬分別 脫氨基為尿喀呢和胸腺喀噬，導(dǎo)致極低豐度的CT堿基突變，當(dāng)使用接近0.1%的檢測閾值檢測FFPE樣本可能產(chǎn)生假陽性，所以使用高敏感檢測技術(shù)時(shí)，建議 采用胸腺喀呢DNA基化酶對FFPE抽提的DNA羊本進(jìn)行預(yù)處理移除脫氨基形成 的尿喀呢和胸腺喀噬，并且采用經(jīng)過驗(yàn)證的合理檢測閾值進(jìn)行組織 T790M突變的 陽性判讀。對于組織不可獲取的患者，可采用細(xì)胞學(xué)或者血漿等抽提的 ctDNA樣本進(jìn)行 丁790般變檢測。ctDNA豐度低、片段小的特性對檢測平臺提出了較高要求，推 薦采用敏

15、感度較高的方法進(jìn)行檢測。以組織為參照，血漿T790M檢測ARMSS,比如凱杰的therascreen ? EGFR突變檢測試劑盒、羅氏cobas? EGF聯(lián)變檢測試 劑盒V2以及廈門艾德Super-ARMS?類EGFFfi因突變檢測試劑盒的敏感度為分 另I為 29% 41%- 64%口 49%- 61% 2018 年 1 月 19 日，CFDAtt準(zhǔn)了 Super-ARMS 法產(chǎn)品用于血液EGFFSH突變（含T790M尬測，作為不易獲取組織樣本時(shí)的補(bǔ) 充手段。以組織為參照，不同數(shù)字 PCR平臺（檢測閾值可達(dá)0.1%）的敏感度分別 為71%（BEAMin縱字PCR 56%- 71%自樂液滴式數(shù)字

16、 PCR ddPCR）和69%債 默飛QuantStudio ? 3D數(shù)字PCR）多個檢測方法平行比較的研究均顯示數(shù)字PCR法較普通ARM?法更為敏感。二代測序（NGS泯術(shù)檢測血液中T790M的陽性率在 不同研究報(bào)道中有較大的差異（16.8%54.0%）。在一定的測序覆蓋深度下（有效 深度超過1 000倍，檢測閾值達(dá)0.1%）NGS血液檢測基于組織的敏感度為 65%- 71%也可應(yīng)用于ctDNA中T790M突變的檢測。但由于不同實(shí)驗(yàn)室采用不同 NGS 平臺、操作規(guī)程、測序深度以及生物信息學(xué)判讀標(biāo)準(zhǔn)，可能導(dǎo)致不同檢測敏感度， 因此選擇NGSS彳T T790M僉測時(shí)應(yīng)充分關(guān)注NGSK術(shù)參數(shù)?；跀?shù)

17、字PCRffi NGS 的EGFR僉測平臺也在CFD所報(bào)過程中，未來臨床會有更多的選擇。（四）EGFR T790Ms因突變檢測流程【共識6】進(jìn)行EGFR T790變檢測的實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)人員需具備相關(guān)的資質(zhì)和 認(rèn)證（1類）。進(jìn)彳T EGFR T790幟變檢測的實(shí)當(dāng)室必須建立 PCRfe準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，通過國內(nèi)外 相關(guān)機(jī)構(gòu)的認(rèn)證，符合中國衛(wèi)生管理機(jī)構(gòu)和國際上的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 定期參加相關(guān)技 術(shù)的質(zhì)控項(xiàng)目，如國內(nèi)PQC（J國外EMQ管室間質(zhì)評項(xiàng)目。檢測人員應(yīng)接受過嚴(yán) 格的上崗培訓(xùn)，獲得相關(guān)PCF崗證書，對熟練掌握檢測技術(shù)，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操 作規(guī)程進(jìn)行操作。【共識7】申請EGFFT790M突變檢測時(shí)，建議提供既往用

18、藥史，既往 EGFR僉測 史等信息（2A類）。檢測前，由臨床醫(yī)師發(fā)起送檢申請，并規(guī)范填寫送檢單。送檢單除了包括患 者基本信息外，建議包括樣本采集信息（月中瘤組織采集部位，采集時(shí)間等）、患者 治療史（包括有無進(jìn)行EGFR-TKI治療，若有，則建議提供用藥起止時(shí)間、疾病進(jìn) 展時(shí)間、病灶轉(zhuǎn)移情況、是否接受放化療及起止時(shí)間等信息）和既往EGFR僉測史 （如有，包括樣本類型、檢測方法、檢測時(shí)間和結(jié)果）。填寫規(guī)范、信息全面準(zhǔn)確 的送檢單是后續(xù)分子檢測及患者治療的重要參考依據(jù)，也有利于對檢測結(jié)果進(jìn)行 合理解讀。共識8】為保證EGFR T790Ml變檢測的成功率及檢測結(jié)果的正確性，需對樣本 預(yù)處理和檢測各環(huán)節(jié)

19、進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控（1類）。對不同類型樣本的處理要求見表 1。表1不同類型樣本的處理和要求處理/ 要求組織樣本細(xì)胞學(xué)樣本血液樣本取樣/離體30 min內(nèi)固定固定要求4%：性甲醛手術(shù)樣本固定時(shí)間為648 h ;活檢樣本固定時(shí)間為612 h在骨轉(zhuǎn)移患者 取樣時(shí)需要注意優(yōu)先活檢存 在轉(zhuǎn)移病灶的軟組織成分，脫時(shí)盡量采用溫和的 EDTA方法（2A 類）血液樣本需謹(jǐn)防溶血發(fā)生使用EDT啦凝管需在常溫兩小時(shí)內(nèi)分離血漿使用常溫采血管（Streck或BCT管）可常溫保存37 d,但建議盡快分離、檢測（2A胸腔積液20500 ml ：用肝素抗凝痰 液和支氣管肺泡灌洗液：收集和處理前 保存于4 c細(xì)胞學(xué)細(xì)胞涂片使用 9

20、5比 醇固定液，時(shí)間不少于15 min若需制備細(xì)胞學(xué)樣本蠟塊，使用4刈性甲醛固定，后續(xù)操作可參照活檢小標(biāo)本處理 要求（2A類）需要采用普通ARM防法時(shí)，建議腫瘤細(xì)胞 200個（當(dāng)使用更為靈敏的技不同技術(shù)平臺對于血量的量 術(shù)，且該檢測方法被充分驗(yàn)證時(shí)，可使用較少的細(xì)胞 ）要求不同，通常推薦10 m腫瘤細(xì)胞比例10%寸，可直接檢測；腫瘤細(xì)胞 10%寸，需要在顯微鏡l全血（2A類）下仔細(xì)富集（2A類）DNA/ 對于組織FFPE樣本或者血漿樣本的 DNAtt提，建議使用經(jīng)過驗(yàn)證的專門針對 FFPE樣本或cfDNA的 血漿 提取試劑盒。大部分普通的DNA提取試劑盒對血漿樣本的小片段 ctDNA回收率非常低，因此血漿檢 游離D 測應(yīng)選擇對小片段回收率高的提取試劑盒， 最好進(jìn)一步濃縮 ctDNA濃度，能有效提高檢測敏感度（1 NA抽 類）提與完成抽提后，應(yīng)對組織DNA血漿cfDNA進(jìn)行定量，并對質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控。當(dāng) DNA/cfDNA上樣定量量不足或質(zhì)量不合格時(shí)，不應(yīng)繼續(xù)檢測，應(yīng)重新進(jìn)行提取或者重新取樣（2A類）T790M 需設(shè)置相關(guān)的野生型 DNAm生對照和T790M突變陽性對照。如果發(fā)現(xiàn)陰性對照和（或）陽性對照出現(xiàn) 檢測 異常，或者任何一個檢測環(huán)節(jié)質(zhì)控不合格，均應(yīng)進(jìn)行復(fù)檢。當(dāng)檢測結(jié)果是陽性時(shí)，如果樣品檢測結(jié) 對照果落于閾值附近難以判斷，建議采用另一種方法進(jìn)行復(fù)檢