1、天花粉蛋白抑制HeLa細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究【關(guān)鍵詞】天花粉蛋白；,HeLa細(xì)胞；,細(xì)胞凋亡摘要：目的研究天花粉蛋白(TS)對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,討論TS抗腫瘤的作用機(jī)制。方法采用TT法檢測(cè)TS對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用，形態(tài)學(xué)觀察、DNA電泳及流式細(xì)胞儀檢測(cè)TS對(duì)HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果TS對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞圓縮，胞漿凝聚等凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，DNA凝膠電泳呈梯級(jí)格局，流式檢測(cè)出現(xiàn)凋亡峰，凋亡比例具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)論天花粉蛋白通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖。關(guān)鍵詞：天花粉蛋白；HeLa細(xì)胞；細(xì)胞凋亡Exper

2、ientalStudyfTrihsanthinsEffetnHelaellsPrliferatinAbstrat：bjetiveTstudytheinhibitryeffetftrihsanthin(Ts)nHelaellsanditsanti-turehanis.ethdsTheantiprliferativeeffetfTSnHelaellsaseasuredithTTassay.Lightirspyasusedtbservetherphlgyhanges,DNAagarseeletrphresisandFanalysiserearrieduttexainetheinduedapptsis

3、.ResultsTheprliferatinfHeLaellsassignifiantlyinhibitedbyTS,Helaellsshedaserialfharateristihangesfapptsissuhasellvlueshrinkage,hratinndensatin;theurrenefDNAladderandapptsisratefHelaellsasdseandtiedependent.nlusinTrihsanthinaninhibittheprliferatinfHelaellsbyitsindutinfapptsis.Keyrds：Trihsanthin;Helael

4、l;Prliferatin宮頸癌是導(dǎo)致婦女死亡的第二大原因，嚴(yán)重威脅女性身體安康。天花粉蛋白Trihsanthin,TS是從葫蘆科植物栝樓Trihsanthinkiriluiiaxi的塊根中提取出來(lái)的一種單鏈核糖體失活蛋白(ribse-inativatingprtEin,RIP)，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等作用1。目前，TS的抗腫瘤研究主要集中在絨毛膜上皮癌、胃腸道腫瘤和白血病等方面23。本實(shí)驗(yàn)研究TS對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的角度討論其抗癌作用，為藥物的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1材料與方法1.1試劑E培養(yǎng)基和胎牛血清FBS購(gòu)自美國(guó)

5、GIBBRL公司，碘化丙啶PrpidiuIdide，PI及RNaseA(RNA酶)為Siga公司產(chǎn)品，噻唑藍(lán)(TT)購(gòu)自Ares公司。二甲基亞砜(DS)購(gòu)自Fluka公司，TS購(gòu)自上海金山制藥廠純品，規(guī)格為1.2g/l。1.2細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞為本室傳代保存,培養(yǎng)于5%2，37濕化孵箱中。培養(yǎng)基E含10%FBS，0.1U/L青霉素，0.1U/L鏈霉素，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞待用。1.3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)采用噻唑藍(lán)(TT)復(fù)原法進(jìn)展檢測(cè):將Hela細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)(每孔的細(xì)胞數(shù)為2104個(gè))，細(xì)胞貼壁后對(duì)照組換新穎培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組換用含有不同濃度TS的培養(yǎng)基，置2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24

6、，48，72h，去上清，參加TT溶液200l/孔，置2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h，去上清，每孔參加200lDS，輕度振蕩后，測(cè)定570n處光吸收值。取8孔吸收值平均數(shù)，按公式細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)100%計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。1.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè)1.4.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞以不同濃度的TS處理后，倒置顯微鏡下觀察Hela細(xì)胞的形態(tài)改變。1.4.2DNA瓊脂糖凝膠電泳胰蛋白酶消化收獲實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照細(xì)胞,1000r/in離心5in,PBS清洗細(xì)胞兩遍,NP40溶液作用細(xì)胞沉淀,參加SDS(終濃度1%)及RNase(終濃度2g/l)，5

7、6處理2h，蛋白酶K(終濃度2g/l)37作用35h，參加1/10體積的3醋酸鈉及2倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕振搖后置于-70冰箱中過(guò)夜,14000r/in離心15in，棄上清，用冰冷的70乙醇漂洗，1.2%瓊脂糖凝膠30V電泳35h，紫外觀察拍照。1.4.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)分別離心搜集對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后參加75%冰冷的乙醇固定,在10000r/in條件下離心5in，去乙醇，PBS洗滌兩次，棄上清；用0.5lPBS重懸，參加等體積的細(xì)胞裂解緩沖液室溫作用5in，加RnaseA(終濃度30g/l)置37水浴中消化30in，離心后再加人11PI染色(終濃度50g/l)避

8、光染色30in，以300目尼龍網(wǎng)濾過(guò)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，ultiyles軟件分析結(jié)果。1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS10.0frinds統(tǒng)計(jì)軟件包作ANV方差分析。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1TT法測(cè)定結(jié)果20，40和80g/l的天花粉蛋白分別作用于Hela細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸升高,且抑制率隨藥物濃度增加而上升,呈一定的劑量、時(shí)效依賴(lài)性。結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1TS對(duì)Hela細(xì)胞作用的時(shí)間-劑量曲線略2.2Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變鏡下可見(jiàn)(200)對(duì)照組Hela細(xì)胞始終為多角形，梭形，貼壁結(jié)實(shí),TS處理的Hela細(xì)胞逐漸變圓,細(xì)胞體積縮小，胞漿凝縮,折光率增強(qiáng),呈現(xiàn)凋亡

9、細(xì)胞的形態(tài)改變。結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2Hela細(xì)胞形態(tài)改變略2.3DNA凝膠電泳圖譜凝膠電泳分析經(jīng)不同濃度的TS20，40和80g/l處理48h的Hela細(xì)胞DNA斷裂成相差約200bp的片段，呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的梯級(jí)ladder格局，而對(duì)照組細(xì)胞DNA無(wú)斷裂現(xiàn)象。結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3凋亡細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳略2.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè)凋亡細(xì)胞在流式細(xì)胞儀直方圖上可出現(xiàn)特征性的亞二倍體峰subG1peak。由表1可見(jiàn),隨著天花粉蛋白藥物濃度的增大及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞的比例增加，說(shuō)明TS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。表1凋亡細(xì)胞在各組標(biāo)本中所占的百分比時(shí)間略3討論細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中發(fā)

10、生的一種復(fù)雜的生理過(guò)程。Dunne等4發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)紊亂親密相關(guān)。有資料說(shuō)明，許多抗癌藥物都是通過(guò)最終觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而到達(dá)治療的目的，有效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的新的手段之一5。天花粉蛋白(TS)是一種有效并具有專(zhuān)一性的抗腫瘤藥物，與一般化療藥物造成的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞兩敗俱傷的作用不同，它對(duì)人的外周血淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞和羊膜細(xì)胞等正常體細(xì)胞影響極小6，具有顯著優(yōu)勢(shì)。天花粉蛋白是型單鏈核糖體失活蛋白(ribse-inativatingprtEin,RIP)，能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)直接使核糖體失活。TS可以使絨毛癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,其誘導(dǎo)凋亡的作用與胞內(nèi)的a2+濃度升高和活性氧基團(tuán)(re

11、ativexygenspeies，RS)的產(chǎn)生有關(guān)78。本實(shí)驗(yàn)將天花粉蛋白處理HeLa細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，出現(xiàn)凋亡的特征性改變：染色體凝聚、核碎裂等形態(tài)改變，凝膠電泳呈現(xiàn)典型的梯級(jí)ladder格局，流式結(jié)果可見(jiàn)特征性的亞二倍體峰，且凋亡細(xì)胞的比例隨藥物濃度的增高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。這些結(jié)果說(shuō)明TS對(duì)Hela細(xì)胞具有良好的抑制作用和明顯的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，并具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性，初步顯示了良好的藥物開(kāi)發(fā)前景。對(duì)其抗癌機(jī)理進(jìn)展深化研究，有望應(yīng)用于宮頸癌等腫瘤的臨床治療。參考文獻(xiàn)：1ShaP,leeK,ngKB.reentadvanesintrihsanthin,aribse-i

12、nativatingprtEInithultiplepharalgialprpertiesJ.Txin.2022,45(6)：683.2汪猷，金善煒.天花粉蛋白，第2版.北京：科學(xué)出版社，2000.3孫，涂程度，吳裕圻，等.天花粉蛋白誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞KN245凋亡中P53、Bl2、y蛋白表達(dá)變化J.上海醫(yī)學(xué)，2001，214：291.4DunneAL,PrieE,thersill,etal.Relatinshipbeteenlngeniradisensitivity,radiatin-induedapptsisandDNAdaage/repairinhuanlnanerellsJ.BrJaner.2022,89(12)：2277.5axanDJ,ShartzPS.HarnessingapptsisfriprvedantianergenetherapyJ.anerRes,2022,63(24)：8563.6戴榮禧，徐國(guó)江，劉蓮英，等.天花粉蛋白對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞專(zhuān)一損傷機(jī)制的研究J.實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1993，2624：411.7ZhangY,GngYX,aH,etal.Reativexygenspeiesinvlve