1、消毒與滅菌效果的評價方法與標(biāo)準(zhǔn)第一篇 壓力蒸汽滅菌效果評價方法與標(biāo)準(zhǔn)主題內(nèi)容與適用范圍本方法規(guī)定了壓力蒸汽滅菌技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及其評價滅菌效果的檢測方法。本方法適用于對壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的評價。試劑本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未說明規(guī)格者，均為分析純（ A及，水為蒸儲水。 1 蛋白胨。 2 葡萄糖。3澳甲酚紫酒精溶液：取澳甲酚紫 2. 0g,溶于100mL9削乙醇中。4澳甲酚紫蛋白陳水培養(yǎng)基配制：蛋白陳 10. 0g,葡萄糖5. 0g,溶于1000mLM 儲水中，調(diào)pH值至7. 07. 2,然后再加2%澳甲酚紫酒精溶液0. 6mL搖勻后，按5m L/ 管，分裝包口，置壓力蒸汽滅菌器中，于115滅菌40mi

2、n 后備用。指示菌嗜熱脂肪桿菌芽胞（ATCC 795M SSI K31）菌片，含菌量為5X 1055Xl06cfu/片， 121c下，殺滅90%微生物所需時間D121值為1. 31. 9min,殺滅時間（KT值）為0 19 min,存活時間（ST值）為3. 9min。4化學(xué)指示劑需用衛(wèi)生部批準(zhǔn)的化學(xué)指示劑5技術(shù)要求壓力蒸汽火菌器壓力,MPa/cm2溫度C火菌時間,min下排氣式0.070115400.10512130預(yù)真空式0.2101344-6國家技術(shù)監(jiān)督局1995-12-15批準(zhǔn)1996-07-01實(shí)施6檢測方法6. 1生物學(xué)指標(biāo)（用作壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的依據(jù)）。6. 1. 1將嗜熱

3、脂肪桿菌芽胞菌片兩個分別放入滅菌小紙袋內(nèi)，置于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包中心 部位。6. 1. 2滅菌柜室內(nèi)，上、中層中央和排氣口處各放置一個標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包（由 3件平紋 長袖手術(shù)衣，4塊小手術(shù)巾，2塊中手術(shù)巾，1塊大手術(shù)巾，30塊10cmK 10cm 8層紗布敷料包裹成25cm10. 95。E2. 5酶聯(lián)免疫吸附法試劑，要求特異性100%,精密性CVC 15%,靈敏度0 3.2ng/mL,線卜t r 0. 95。E3 器材E3. 1吸量器：包括試管、吸管（0. 1, 1. 0, 5. 0和10. 0mL4#）和微量進(jìn)樣器 （100. 0L） 0E3. 2載體（直徑1. 5cm大小的不銹鋼片）。E3 3 免疫計數(shù)

4、儀。E3 4 酶聯(lián)免疫測定儀。E3.5 低溫冰箱（一30C70C）。E4 HBsAgt液的配制E4. 1 取 0. 01mol/LPBS （pH7. 27. 4） 9. 4mLi口入小牛血清 0. 6mL 配成含 6% 小牛血清的懸液。再取該 PBS 9. 0mL加入濃度為1. 0mg/mL的純化HBsAgt液1. 0mL 使成含5. 4%小牛血清，HBsAgB度為100仙g/mL的試驗(yàn)用HBsAgS液。E4. 2 將試驗(yàn)用HBsAg&7取1. 0mL盛裝入容量為1. 5mL的玻璃安甑中，封口，放 30c70c冰箱保存?zhèn)溆谩１４嫫跒槿齻€月。E5 HBsAg的檢測方法E5 1 固相放射免疫分析法

5、（SPRIA）。E7 破壞試驗(yàn)方法E7 破壞試驗(yàn)方法E6 中和劑選擇在測定消毒劑對HBsAg的破壞效果時，應(yīng)先選出適宜的中和劑及其使用濃度，再進(jìn)行 破壞試驗(yàn)。所用中和劑：a.應(yīng)能有效而及時中止消毒劑的殘余作用；b.中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對HBsAg的抗原活性沒有影響，亦不影響檢測方法對 HBsA附出的靈敏度。E6. 1將消毒劑用無菌蒸儲水配成不同濃度，取 1. 2mL消毒7與0. 3mLHBsAg1液 混勻，置202c水浴條件下，作用10min,測定該消毒劑10min抑制或破壞HBsA次原性 的最低有效濃度。E6. 2取消毒劑10min抑制或破壞HBsA次原性的最低有效濃度與待選中和劑進(jìn)

6、行試 驗(yàn)，試驗(yàn)可按下列組別進(jìn)行：a.消毒液0. 9mL+HBsAg17取0. 1mL; b.消毒液0. 4mL+HBsAg 懸70. 1mL作用10min后+含20%小牛血清的中和劑0. 5mL c.先取含20%小牛血清的 中和劑1mL與消毒液1mL混勻，作用1030min,制成中和產(chǎn)物溶液，再行試驗(yàn)。中和產(chǎn) 物溶液 0. 9mL+HBsAgl液 0. 1mL d.含 10%小牛血清的 PBS0 9mL+HBsAgl液 0. 1mL; e.含10%小牛血清的中和劑 0.9mL+HBsAg!液0. 1mL f .中和產(chǎn)物溶液0. 9mL+PBs01mL 經(jīng)檢測只有在c、d、e組HBsAg?舌性的

7、測定值相近（相差10%以下）并都明顯多于b組， a組HBsA舌性不能檢出或檢出活性明顯少于 b組，f組陰性對照正常，方可證明所選中和 劑及其使用劑量是適宜的。E6 3 進(jìn)行消毒試驗(yàn)時，依據(jù)消毒劑與中和劑等當(dāng)量中和原則，適當(dāng)調(diào)整中和劑的用量。再次按E6 2 步驟測定中和效果后，方可進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。E7 1 懸液法懸液法指將HBsAgS懸液中與消毒劑相互作用并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的試驗(yàn)方 法。E7. 1. 1 HBsAgt液的濃度為檢測試劑靈敏度的104倍。如檢測試劑的靈敏度為 1ng/mL, HBsAg的濃度應(yīng)為 10 仙 g/mL。E7. 1. 2 取含5%小牛血清的PBS2 7mL加到

8、含0. 3mL濃度為100仙g/mL的HBsAg 懸液中，混勻。E7. 1. 3取小牛血清20mLto到含80mLM菌的中和劑溶液中，混勻。E7. 1. 4破壞試驗(yàn)：將預(yù)定消毒液濃度1. 25倍的消毒液與HBsAgS液按4 ： 1比例 混合，混合液容量不少于1. 5mL然后置202c水浴條件下，作用達(dá)規(guī)定時間，即刻取 0.3mL昆合液與等體積含20%小牛血清的中和劑混勻，作用1030min,取樣測定殘留HBsAg 的活性，每一樣本平行測定2份，每份0. 1mL取其平均值，判定破壞效果。每種消毒劑 觀察 3 個濃度，每一濃度觀察4 個作用時間。試驗(yàn)重復(fù)5 次。E7. 1. 5陽性對照：取含20%

9、小牛血清的中和劑1mL加到含1mL試驗(yàn)用消毒液的 試管中混勻，作用1030min,制成中和產(chǎn)物溶液。取該中和產(chǎn)物溶液 0. 9m助口入試驗(yàn)濃 度的HBsA/7取0. 1mLM樣檢測，每一樣本檢測3份，每份0. 1mL取其平均值為陽性 對照值。E7. 1. 6陰性對照：取含20%小牛血清的中和劑1mL加到含1mL試驗(yàn)用消毒液的試 管中，混勻，作用1030min,取樣檢測，每一樣本檢測3份，每份0. 1mLM其平均值為 陰性對照值。應(yīng)注意陰性對照不能用試劑盒的陰性對照樣本。E7 2 載體法載體法指將在載體表面的HBsAgf消毒因子相互作用，并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的 試驗(yàn)方法。E7. 2. 1 H

10、BsA碎體的制備E7. 2. 1. 1載體為直徑1. 5cm大小的不銹鋼片，經(jīng)洗滌劑煮沸洗滌脫脂、壓力蒸 汽滅菌備用。E7. 2. 1. 2 HBsAgt液的濃度為檢測方法靈敏度的 5X104倍。如靈敏度為1ng/mL, HBsAg的濃度應(yīng)為50ig/mLoE7. 2. 1. 3 HBsAg的污染方法為滴染法。滴染時，將滅菌載體平鋪于無菌平皿內(nèi)， 用微量進(jìn)樣器吸取HBsAgt液，滴注于載體中央，每個載體 20仙L。然后用L型白金絲將 懸液涂布土勻，放37c培養(yǎng)箱4060min,待懸液干燥后進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。E7 2 2 抗原性破壞試驗(yàn)取污染HBsAg的載體，平放于無菌平皿內(nèi)，用吸管吸取預(yù)定濃

11、度的消毒液50仙L,滴注于載體中央，迅即涂勻，使整個載體均勻受藥。每2 片一組，置20 2水浴中，作用至規(guī)定時間后，用無菌銀子將載體移入含 1. 0mL1竄小牛血清的中和劑試管中。作用10 30min,敲打振蕩200次，取樣檢測殘留HB- sAg的活性，每一樣本取樣2份，每份0. 1mL取其平均值，判定抗原性的破壞效果。每種消毒劑觀察3 個濃度，每個濃度觀察4 個作用時間。試驗(yàn)重復(fù) 5 次。E8 破壞效果判定在觀察紫外線破壞HBsA叫效果時，將污染載體直接置作用因子下，作用至規(guī)定劑量 后將載體移入含I.OmLia小牛血清PBS的試管中，敲打振蕩200次，取樣檢測殘留HBsAg 活性，每一樣本取

12、樣2份，每份0. 1mL取其均值，判定破壞效果。試驗(yàn)重復(fù) 5次。E7 2 3 陽性對照在觀察消毒劑破壞HBsA吸果時，取50仙L試驗(yàn)用消毒液加到含1. 0mL10V、牛血清 中和劑的試管中，作用1030min,制成中和產(chǎn)物溶液。取該中和產(chǎn)物溶液 1. 0mL加到大 試管中，然后將滴染HB-sAg的載體移入，敲打振蕩200次,每一樣本檢測3份，每份0.1mL 取其平均值為陽性對照值。在觀察紫外線破壞HBsA吸果時，將污染HBsAg的載體直接移入含1. 0mL10V、牛血 清的PBS(PH7 27. 4)的試管中，敲打振蕩200次，每一樣本檢測3份，每份0. 1mL 取其平均值為陽性對照值。E7 2 4 陰性對照在觀察消毒劑破壞HBsA吸果時，取50 nL消毒液加到含1mL 10%小牛血清中和劑試 管中，作用1030min,取樣檢測，每一樣本檢測3份，每份0. 1mL取其平均值為陰性 對照值。在觀察紫外線破壞HBsAg寸，陰性對照則為含10%小牛血清的PBS(pH7. 27. 4)。 每一樣本檢測3份，每份0. 1mL取其平均值為陰性對照值。應(yīng)注意陰性對照不能用試劑盒的陰性對照樣本。以