1、高通量測(cè)序原理第1頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四Solexa技術(shù)介紹Solexa 技術(shù)最早由兩位劍橋大學(xué)的化學(xué)家創(chuàng)立，利用專利核心技術(shù)“DNA 簇” 和“可逆性末端終結(jié)”，達(dá)成自動(dòng)化樣本制備及基因組數(shù)百萬個(gè)堿基大規(guī)模平行測(cè)序。第2頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四Solexa 的基本原理第3頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四擴(kuò)增“橋”結(jié)構(gòu)單鏈引物第4頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四DNA簇第5頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四單分子克隆1000 DNA片段per 1 m

2、 “DNA簇” 1000 “DNA簇” per 100 m square40 million clusters per experiment準(zhǔn)備DNA片段兩端接上 adapters將DNA片段通過adapter錨定在芯片上循環(huán)擴(kuò)增DNA片段成“DNA簇”20 micronsSequence第6頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四檢測(cè)第7頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四可逆終止反應(yīng)Reversible Terminator ChemistryO PPPHNNOO熒光基團(tuán)3保護(hù)基團(tuán)Next cycle摻入檢測(cè)去保護(hù)基團(tuán) 去熒光基團(tuán)ODNAHNNOO3

3、O5游離3末端XOH4種標(biāo)記過的核苷酸第8頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四Sequencing-by-Synthesis (SBS)5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTA摻入一個(gè)堿基Cycle 1: 加入反應(yīng)體系移除其他未摻入的核苷酸信號(hào)檢測(cè)Cycle 2-n: 加入反應(yīng)體系，循環(huán)cycle 11、每輪測(cè)序反應(yīng)加入四種帶有熒光標(biāo)記的dNTP，末端帶有可以被去除的保護(hù)基團(tuán)2、每輪反應(yīng)只能整合一個(gè)核苷酸，儀器讀取相應(yīng)的熒光信號(hào)3、信號(hào)讀取結(jié)束，用化學(xué)方法去除阻斷基團(tuán)和熒光基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測(cè)序反應(yīng)第9頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18

4、點(diǎn)30分，星期四第10頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 根據(jù)每個(gè)DNA簇每輪反應(yīng)讀取的熒光信號(hào)序列，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的DNA序列通過熒光信號(hào)分析核苷酸序列第11頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四優(yōu)缺點(diǎn)高度自動(dòng)化的系統(tǒng)讀取片段多，適合進(jìn)行大量小片段的測(cè)序，如microRNA profiling基于可逆反應(yīng)，隨反應(yīng)輪數(shù)增加，效率降低，信號(hào)衰減，讀取序列較短，給從頭測(cè)序（de novo sequencing） 拼接帶來困難第12頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四技術(shù)特色突出表現(xiàn)每張測(cè)序芯片有8 個(gè)通道，每個(gè)通道可單獨(dú)運(yùn)行一個(gè)樣品，也可以把多個(gè)樣品混合在一起檢測(cè)；一次實(shí)驗(yàn)可讀取大于15 億個(gè)堿基/芯片；無需建庫(kù)，自動(dòng)化樣品制備，簡(jiǎn)單；實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低，測(cè)序成本為傳統(tǒng)測(cè)序方法的1/100；樣本使用效率極高，所以對(duì)少量樣本也可以極靈敏精確地檢測(cè)。第13頁(yè)，共14頁(yè)，2022年，5月20日，18點(diǎn)30分，星期四