1、3.5核酸堿基順序分析中化學(xué)辦法 DNA化學(xué)順序辦法于1977年由A.M.Mamamx和W.Gilbert第一次報(bào)道，因此又稱為MG法（化學(xué)降解法）。這一辦法是將模板DNA一端標(biāo)識(shí)，之后按堿基順序逐一地將整個(gè)大分子斷裂，標(biāo)識(shí)DNA片段長(zhǎng)度或大小與每個(gè)堿基所在位置相相應(yīng)，當(dāng)這些反應(yīng)產(chǎn)物通過變性聚苯稀酰胺凝膠電泳分離后，其代表DNA順序便能夠從同位素標(biāo)識(shí)自顯影帶形上讀出。這項(xiàng)技術(shù)能夠測(cè)出距離標(biāo)識(shí)位點(diǎn)250核苷酸以內(nèi)DNA序列。通過多年努力在模板DNA末端標(biāo)識(shí)和特異性化學(xué)反應(yīng)方面都進(jìn)行了改進(jìn)，使這一辦法成為DNA序列分析基本辦法。第1頁第1頁化學(xué)降解法測(cè)序原理 在MG法測(cè)序系統(tǒng)中，一個(gè)末端標(biāo)識(shí)DNA

2、片段在4組或5組互為獨(dú)立化學(xué)反應(yīng)中分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對(duì)某一個(gè)或某一類堿基。在這幾組反應(yīng)中經(jīng)過化學(xué)裂解形成放射性標(biāo)識(shí)分子含有共同起點(diǎn)放射性標(biāo)識(shí)末端，而其終點(diǎn)不同發(fā)生化學(xué)降解位點(diǎn)。每組混合物中含有長(zhǎng)短不一DNA分子，其長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針正確堿基在待測(cè)DNA全長(zhǎng)片段中位置。此后，將各組反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行序列膠高壓電壓分離，再經(jīng)過放射自顯影顯示序列結(jié)果。第2頁第2頁原理示意圖第3頁第3頁辦法成敗關(guān)鍵一、對(duì)特定堿基進(jìn)行化學(xué)修飾二、通過修飾堿基從糖環(huán)上脫落，DNA主鏈在修飾堿基5 和3 磷酸二脂鍵斷裂。第4頁第4頁DNA樣品制備待測(cè)DNA樣品末端標(biāo)識(shí)單末端標(biāo)識(shí)DNA片段分離純化堿基特異

3、化學(xué)裂解反應(yīng)序列膠高壓電泳分解讀取序列化學(xué)法測(cè)序普通流程第5頁第5頁載體選擇化學(xué)法中用最多是Messing及其同事構(gòu)建pUC系列載體。它們是化學(xué)法測(cè)序中比較好載體。第6頁第6頁P(yáng)uc質(zhì)粒系列圖譜第7頁第7頁P(yáng)sp64/圖譜第8頁第8頁DNA樣品制備 DNA樣品必須是來自轉(zhuǎn)化細(xì)胞單菌落，絕對(duì)不含有宿主細(xì)胞染色體DNA及其RNA。1、氯化銫-溴化乙啶梯度平衡離心法純化質(zhì)粒DNA。2、寡核苷酸從固相支持物上洗脫下寡核苷酸不含有5末端磷酸基團(tuán)。測(cè)序前用高壓液相柱或電泳技術(shù)純化進(jìn)行5末端標(biāo)識(shí)。第9頁第9頁DNA樣品末端標(biāo)識(shí)Klenow片段酶介導(dǎo)標(biāo)識(shí)反應(yīng)1.在一支微量離心管中加入： 含有3 凹端DNA片段

4、 3種dNTP混合液 Klenow片段酶緩沖液 -32P-dATP2.混合均勻后加入0.5微升Klenow片段酶，混勻后置于20-22 保溫30分鐘。3.70 加熱10分鐘終止反應(yīng)。第10頁第10頁單末端標(biāo)識(shí)DNA片段分離和純化 普通采用變性DNA中性瓊脂糖凝膠和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳辦法進(jìn)行分離。 最慣用洗脫辦法是機(jī)械洗脫和電洗脫，當(dāng)前已有許各種商品化電洗脫裝置，性能優(yōu)良回收率高。第11頁第11頁雙鏈DNA解鏈及兩條鏈分離回收雙鏈DNA變性 1.在一支微量離心管中加入 32P標(biāo)識(shí)DNA片段; 變性加樣溶液 2.混勻后置于90 保溫2分鐘，快速放入冰浴冷卻。非變性聚丙烯 酰胺凝膠電泳分離 制

5、備一塊適宜濃度非變性聚丙烯酰胺凝膠確定凝膠中放射性標(biāo)識(shí)DNA片段位置 1.電泳結(jié)束后，輕輕去掉一塊玻璃板，用保鮮膜蓋住膠，再將放射性溶液取幾滴于3 濾紙條上，置于膠不對(duì)稱四點(diǎn)上，用透明膠帶固定。將整個(gè)凝膠投入X射線膠片暗合內(nèi)，上面覆蓋一張X射線膠片進(jìn)行放射自顯影。室溫曝光5-10分鐘后顯影、定影。不同大小片段便展現(xiàn)出來。 2.將凝膠上四處人為標(biāo)識(shí)與X射線膠片上對(duì)應(yīng)顯影點(diǎn)重合，則對(duì)應(yīng)于X射線膠片上DNA單鏈顯影處凝膠必定含有這個(gè)單鏈標(biāo)識(shí)DNA片段。用注射器針頭沿顯影條帶四周穿孔并直入凝膠內(nèi)，再將已被針孔劃出范圍凝膠用銳利刀片切割下來，放入一支離心管中。第12頁第12頁從聚丙烯酰胺凝膠中洗脫回收D

6、NA辦法一 機(jī)械性洗脫【碾碎-浸泡-過濾-沉淀法】1、將切下膠塊置于1.5 ml微量離心管中2、用潔凈玻璃棒將膠塊搗碎3、加入400 l洗脫緩沖液4、蓋好管蓋并用parafilm膜封口5、37 震蕩至少4小時(shí)或過夜6、用硅化玻璃棉裝入一個(gè)1ml槍頭7、將洗脫液過濾到一支微量離心管中8、再另加100 l洗脫緩沖液到洗脫管中洗脫殘余樣品9、重復(fù)710、用手提式射線監(jiān)測(cè)器監(jiān)測(cè)過濾樣品，樣品應(yīng)大部分得以回收11、像過濾樣品中加入1.0ml無水乙醇，-70 放置5分鐘沉淀DNA樣品12、在4 以15000r/min離心15分鐘搜集DNA沉淀并在真空下干燥DNA沉淀13、將沉淀重新溶于200 l0.3mo

7、l/l乙酸鈉中，加入500 l無水乙醇，-70 放置5分鐘14、在4 以15000r/min離心15分鐘15、用95乙醇洗沉淀樣品一次，然后真空干燥DNA樣品第13頁第13頁辦法二 電洗脫1、小心將膠條置入一個(gè)直徑1cm透析袋中，鉗住一端2、加1 TBE于透析袋中，趕出氣泡3、擠出多出緩沖液，再扎緊透析袋另一端4、將透析袋置于水平電泳板上用1 TBE浸沒5、恒壓100V電泳6、改變電泳方向，30秒，使樣品脫離透析膜7、取出透析袋，用新槍頭吸取透析袋中緩沖液到另一新離心管中8、用1/2體積1 TBE洗凈透析管，并將其吸入樣品管中9、用酚抽提洗脫回收樣品，然后以乙醇沉淀第14頁第14頁通過第二次限

8、制酶酶切及凝膠電泳分離回收末端標(biāo)識(shí)DNA片段第二次限制性酶酶解將干燥DNA樣品溶于適量體積雙蒸水中，溶解完畢，加入：10 限制酶緩沖液 適當(dāng)限制性內(nèi)切酶補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為20 l，混勻后于37 保溫2小時(shí)若酶切反應(yīng)完全，像酶切反應(yīng)液中加入5ul加樣緩沖液非變性聚丙烯凝膠電泳分離第15頁第15頁合成寡核苷酸DNA樣品5 末端標(biāo)識(shí)合成寡核苷酸DNA測(cè)序前應(yīng)用T4多核苷酸激酶進(jìn)行5 末端標(biāo)識(shí)。 1、取100ng oligo樣品溶于20 l雙蒸水中，加入：10 T4多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶 -32P-ATP2、混勻后置于37 保溫30分鐘3、加入10ul加樣緩沖液以終止反應(yīng)4、上樣于20非

9、變性聚丙烯酰胺凝膠，以300V電泳適當(dāng)初間5、放射自顯影和洗脫第16頁第16頁特異性堿基化學(xué)裂解反應(yīng)堿基特異性地裂解反應(yīng)包括：先對(duì)特定堿基進(jìn)行化學(xué)修飾；堿基消除：是修飾堿基從糖環(huán)上脫落。要確保每一個(gè)DNA分子平均只有一個(gè)靶堿基被修飾。隨后用哌啶裂解修飾堿基5 和3 位置。得到一組長(zhǎng)度從一到數(shù)百個(gè)核苷酸不等末端標(biāo)識(shí)分子，比較G,A+G,C+T,C各個(gè)泳道，可從測(cè)序凝膠放射自顯影片上讀出DNA序列第17頁第17頁測(cè)序流程圖第18頁第18頁第19頁第19頁合成寡聚核苷酸MG測(cè)序法合成 100堿基以下寡聚核苷酸測(cè)序方法唯一不同之處于于堿基修飾反應(yīng)時(shí)間。G反應(yīng)20分鐘G+A反應(yīng)為1小時(shí)T+G反應(yīng)為1小時(shí)

10、C反應(yīng)應(yīng)為1小時(shí)切割產(chǎn)物可用20變性PAGE膠進(jìn)行分離第20頁第20頁序列膠高壓電泳及序列閱讀核苷酸順序閱讀 化學(xué)裂解反應(yīng)并不完全是絕對(duì)堿基特異性，四條帶為G，G+A，C+T，C。這些帶分別來自G，G+A，C+T，C處斷裂DNA片段中心兩條帶G+A，C+A，含有所有標(biāo)識(shí)DNA降解產(chǎn)物。需要通過從C+T泳道出現(xiàn)條帶中扣除C泳道條帶而推斷T殘基位置，同樣，A殘基位置也要通過從A+G泳道條帶推斷出來。讀片時(shí)應(yīng)從底部開始，越靠近標(biāo)識(shí)端斷裂那些產(chǎn)物越靠近膠片底部。第21頁第21頁MG法與Sanger雙脫氧鏈終止法比較與進(jìn)行合成反應(yīng)雙脫氧鏈終止法不同，MG法是對(duì)待側(cè)DNA進(jìn)行化學(xué)降解。應(yīng)該說，這一方法是在

11、體外研究Iac阻抑物與Iac操縱基因相互作用時(shí)醞釀發(fā)展起來。因此， MG法所獨(dú)具鮮明特點(diǎn)是能夠探測(cè)DNA構(gòu)象和蛋白質(zhì)-DNA相互作用。然而，因?yàn)榉N種原因（如采取32P進(jìn)行放射性標(biāo)識(shí)、末端標(biāo)識(shí)DNA比活度、裂解位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分布、凝膠技術(shù)方面不足等）， MG法所能測(cè)定長(zhǎng)度要比Sanger法短一些，它對(duì)放射性標(biāo)識(shí)末端250個(gè)核苷酸以內(nèi)DNA序列效果最正確。伴隨M13噬菌體和噬菌粒載體發(fā)展，加上酶學(xué)方法改進(jìn)以及雙鏈DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展，雙脫氧鏈終止法如今比 MG法應(yīng)用廣泛。然而，化學(xué)降解法較鏈終止法含有一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：所測(cè)序列來原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生拷貝。因此， MG法有著Sanger法所不含

12、有特殊用途：能夠?qū)铣晒押塑账徇M(jìn)行測(cè)序；能夠分析諸如甲基化等DNA修飾情況：能夠經(jīng)過化學(xué)保護(hù)及修飾干擾試驗(yàn)來研究DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA相互作用等。然而，因?yàn)镾anger法既簡(jiǎn)便有快速，因此是當(dāng)前最正確選擇方案。實(shí)際上，當(dāng)前大多數(shù)測(cè)序策略都是為Sanger法而設(shè)計(jì)。第22頁第22頁雙脫氧鏈終止法M13單鏈測(cè)序系統(tǒng)雙脫氧鏈終止法測(cè)序是Sanger等于1977年建立起來。該法測(cè)序原理簡(jiǎn)樸，操作容易，均能我餓誒普通試驗(yàn)室所接受，當(dāng)前成為世界各試驗(yàn)室測(cè)序主要辦法。在Sanger鏈終止測(cè)序基礎(chǔ)上，逐步形成了越來越完善序列測(cè)定系統(tǒng)。早期，通過度子克隆技術(shù)將目的DNA插入到單鏈線狀噬菌體M13載體上，

13、提取單鏈模板用于序列測(cè)定。而伴隨技術(shù)改進(jìn)和發(fā)展，當(dāng)前雙鏈DNA測(cè)序水平已基本靠近M13系統(tǒng)。因此，能夠相信質(zhì)粒系統(tǒng)將越來越被廣泛應(yīng)用。近幾年，由于高溫DNA聚合酶廣泛應(yīng)用于雙脫氧鏈終止法測(cè)序，故建立了更為簡(jiǎn)樸、以便測(cè)序辦法，能夠直接對(duì)體外擴(kuò)增DNA產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，不必將其克隆在載體上。第23頁第23頁雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理酶學(xué)原理： 在正常體外合成反應(yīng)體系中，加入核苷酸單體為4種2-脫氧核糖核苷酸三磷酸、這一反應(yīng) 體系中，引物與模板退火形成雙鏈區(qū)后，DNA聚合酶便結(jié)合到DNA雙鏈區(qū)上而啟動(dòng)DNA合成：在引物引導(dǎo)下，聚合酶在模板鏈上沿3 - 5方向移動(dòng)，利用體系中4種核苷酸聚合成一條與模板鏈互

14、補(bǔ)DNA新生鏈。第24頁第24頁機(jī)構(gòu)圖第25頁第25頁然而在體外合成反應(yīng)體系中加入雙脫氧核苷三磷酸，DNA合成情況則完全不同。這些雙脫氧核苷三磷酸在DNA聚合酶作用下，經(jīng)過其5 三磷酸基團(tuán)與正在延伸DNA鏈末端脫氧核糖3 -OH發(fā)生反應(yīng)，形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中，但它們本身沒有3 -OH，不能同后續(xù)dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸DNA鏈終止。假如再加入一個(gè)一定百分比ddNTP，則新合成DNA在可能摻入正常DNTP位置都有可能摻入ddNTP而造成新合成鏈在不同位置終止。因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)，因此，產(chǎn)物是一系列長(zhǎng)度不同多核苷酸片段。這些片段含有共同起點(diǎn)引物5 端，而有不同終點(diǎn)，其長(zhǎng)度取決于dd

15、NTP摻入位置與引物5 端之間距離。第26頁第26頁原理圖第27頁第27頁載體系統(tǒng)含有特殊生活周期單鏈絲狀噬菌體M13是Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序工作最先選擇。在M13生活周期中，既有復(fù)制型雙鏈DNA，又有單鏈DNA形式。前者能夠作為克隆載體，后者能夠作為序列測(cè)定模板。因此，能夠?qū)⒛康腄NA與M13RF雙鏈DNA相連而達(dá)到克隆目的，然后提取成熟M13噬菌體并純化單鏈DNA作為測(cè)序模板。M13載體系統(tǒng)用于序列測(cè)定載體有它長(zhǎng)處。當(dāng)前慣用M13載體為M13mp18與M13mp19.第28頁第28頁M13系統(tǒng)單鏈DNA序列測(cè)定M13DNA物理圖譜第29頁第29頁M13/1918圖第30頁第30頁M13載體系統(tǒng)雙脫氧測(cè)定圖從第31頁第31頁M13載體系統(tǒng)雙脫氧鏈終止法序列測(cè)定單鏈模板DNA制備雙脫氧測(cè)序反應(yīng)序列膠高壓電泳及放射自顯影DNA序列閱讀第32頁第32頁單鏈模板DNA 制備將待測(cè)目的DNA插入到M13載體上MCS中，通過轉(zhuǎn)染受體菌取得重組克隆噬菌體。M13感染細(xì)胞后并不使細(xì)胞裂解，但感染細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，并不斷釋放成熟噬菌體，一個(gè)細(xì)胞在噬菌體復(fù)制每一代釋放出200左右噬菌體。在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)感染細(xì)胞時(shí)，噬菌體不斷從細(xì)胞中釋放出來并在培養(yǎng)基內(nèi)積累。從單一噬菌斑形成噬菌體顆?；驈募?xì)菌菌落中小規(guī)模制備單鏈M13噬