1、第四章 序列特征分析Analysis of Sequence Characterristics第一節(jié) 引言一、基因結(jié)構(gòu)Section 1 Introduction 基因的概念是隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展不斷完善的。從分子生物學(xué)角度來(lái)看，基因是負(fù)載特定生物遺傳信息的DNA分子片段，在一定的條件下能夠表達(dá)這種遺傳信息，產(chǎn)生特定的生理功能。原核生物基因結(jié)構(gòu)： 一個(gè)完整的原核基因結(jié)構(gòu)是從基因的5端啟動(dòng)子區(qū)域開(kāi)始，到3端終止區(qū)域結(jié)束?；虻霓D(zhuǎn)錄開(kāi)始位置由轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)確定，轉(zhuǎn)錄過(guò)程直至遇到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)結(jié)束，轉(zhuǎn)錄的內(nèi)容包括5端非翻譯區(qū)、開(kāi)放閱讀框及3端非翻譯區(qū)?；蚍g的準(zhǔn)確起止位置由起始

2、密碼子和終止密碼子決定，翻譯的對(duì)象即為介于這兩者之間的開(kāi)放閱讀框ORF。 操縱子模型結(jié)構(gòu) 原核生物大多數(shù)基因表達(dá)調(diào)控是通過(guò)操縱子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。所謂操縱子通常由調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)子、操縱基因以及2個(gè)以上的編碼序列（結(jié)構(gòu)基因）在原核生物基因組中成簇串聯(lián)組成。其中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受到操縱基因的調(diào)控。調(diào)節(jié)基因能產(chǎn)生作用于操縱基因的阻遏物（一種蛋白質(zhì)），操縱基因靠近它所控制的結(jié)構(gòu)基因，阻遏物與操縱基因的結(jié)合能阻止結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。 真核生物基因結(jié)構(gòu)： 一個(gè)完整的真核生物基因，不但包括編碼區(qū)域，還包括5端和3端兩側(cè)長(zhǎng)度不等的特異性序列，雖然這些序列不編碼氨基酸，卻在基因表達(dá)的過(guò)程中起著重要的作用。所以，嚴(yán)格的“基因

3、”這一術(shù)語(yǔ)的分子生物學(xué)定義是：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必須的全部核苷酸序列。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)是一種生物大分子，蛋白質(zhì)中相鄰的氨基酸通過(guò)肽鍵形成一條伸展的肽鏈，這條鏈稱為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，不同蛋白質(zhì)其肽鏈的長(zhǎng)度不同，肽鏈中不同氨基酸的組成和排列順序也各不相同。肽鏈上的氨基酸殘基形成局部的二級(jí)結(jié)構(gòu)，各種二級(jí)結(jié)構(gòu)在空間卷曲折疊形成特定的三維空間結(jié)構(gòu)。有的蛋白質(zhì)由多條肽鏈組成，每條肽鏈稱為亞基，亞基之間又有特定的空間關(guān)系，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定三級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)H表示螺旋 E表示折疊 B表示橋G表示3-螺旋 I表示螺旋

4、 T表示氫鍵轉(zhuǎn)角S代表轉(zhuǎn)向 對(duì)DNA序列和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行序列特征分析，能夠使我們從分子層次上了解基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，了解與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的信息，了解DNA序列與蛋白質(zhì)序列之間的編碼，了解蛋白質(zhì)序列與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系和規(guī)律，為進(jìn)一步研究了解蛋白質(zhì)功能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。 第二節(jié) DNA序列特征分析Section 2 Analysis of DNA Sequence Characteristics 分析DNA序列，除了進(jìn)行序列比對(duì)之外，更重要的工作是從序列中找到基因及其表達(dá)調(diào)控信息。尋找基因的工作有兩個(gè)：一是識(shí)別與基因相關(guān)的特殊序列信號(hào)，如啟動(dòng)子、起始密碼子，通過(guò)信號(hào)識(shí)別大致

5、確定基因所在的區(qū)域；二是預(yù)測(cè)基因的編碼區(qū)域，或預(yù)測(cè)外顯子所在的區(qū)域。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合兩個(gè)方面的結(jié)果確定基因的位置和結(jié)構(gòu)。絕大部分基因表達(dá)調(diào)控信息隱藏在基因序列的上游區(qū)域，在組成上具有一定的特征，可以通過(guò)序列分析識(shí)別這些特征。一、開(kāi)放閱讀框ORFopen reading frame 開(kāi)放閱讀框指的是從5端開(kāi)始翻譯起始密碼子（ATG）到終止密碼子（TTA、TAG、TGA）的蛋白質(zhì)編碼堿基序列。每個(gè)序列都有6個(gè)可能的開(kāi)放閱讀框，其中3個(gè)開(kāi)始于第1、2、3個(gè)堿基位點(diǎn)并沿著給定序列的5 3的方向進(jìn)行延伸，而另外的3個(gè)開(kāi)始于第1、2、3個(gè)堿基位點(diǎn)但沿著互補(bǔ)序列的5 3的方向進(jìn)行延伸。在開(kāi)始這項(xiàng)工作之前，我

6、們并不知道DNA雙鏈中哪一條單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈，也不知道準(zhǔn)確的翻譯起始點(diǎn)在何處，由于每條鏈都有3種可能的開(kāi)發(fā)閱讀框，2條鏈共計(jì)6種可能的開(kāi)放讀框，我們的目的就是從這6個(gè)可能的開(kāi)放閱讀框中找出一個(gè)正確的開(kāi)放閱讀框。根據(jù)這個(gè)開(kāi)放閱讀框翻譯得到的氨基酸序列才是真正表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。 真核生物的開(kāi)放閱讀框 真核生物的開(kāi)放閱讀框不僅含有編碼蛋白的外顯子（exon），而且還有內(nèi)含子（intron），并且內(nèi)含子將開(kāi)放閱讀框分割為若干個(gè)小片段。開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度變化范圍非常大，因此真核生物的基因預(yù)測(cè)遠(yuǎn)比原核生物困難。但是，在真核生物的開(kāi)放閱讀框中，外顯子與內(nèi)含子之間的連接絕大部分情況下滿足GT-AG規(guī)律：內(nèi)含子序列

7、5 端的起始兩個(gè)核苷酸總是GT，并且其3端的最后兩個(gè)核苷酸總是AG，即：5-GT AG-3，這個(gè)規(guī)律有助于真核生物開(kāi)放閱讀框的識(shí)別。利用GENSCAN識(shí)別基因開(kāi)放閱讀框 GENSCAN是美國(guó)麻省理工學(xué)院的Chris Burge于1997年開(kāi)發(fā)成功的人類（或脊椎動(dòng)物）基因預(yù)測(cè)軟件，它是根據(jù)基因組DNA序列來(lái)預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框及基因結(jié)構(gòu)信息的開(kāi)放式在線資源，尤其適用于脊椎動(dòng)物、擬南芥和玉米等真核生物。GENSCAN的網(wǎng)址為： http：/genes.M/GENSCAN.htmlGENSCAN在線操作頁(yè)面用GENSCAN預(yù)測(cè)AC002390序列的基因/外顯子 二、CpG島 CpG islands CpG

8、島是指DNA序列上的一個(gè)區(qū)域，此區(qū)域含有大量相聯(lián)的胞嘧啶（C）、鳥(niǎo)嘌呤（G），以及使兩者相連的磷酸酯鍵（p）。CpG島的概念是Gardiner-garden和Fromner于1987年提出的，基因中平均每100 Kb即可出現(xiàn)。CpG島位于基因的啟動(dòng)子和第一個(gè)外顯子區(qū)，約有60%80%的人類基因的啟動(dòng)子和起始外顯子含有CpG島，其中GC含量大于50%，長(zhǎng)度超過(guò)200bp。因此搜索CpG島可以為基因及其啟動(dòng)子預(yù)測(cè)提供重要線索。利用CpGPlot預(yù)測(cè)分析CpG島 CpGPlot是預(yù)測(cè)CpG島的在線工具，它是由歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室EMBL European Molecular Biology Labo

9、ratory提供的。其網(wǎng)址為：http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.htmlCpGPlot在線操作頁(yè)面用CpGplot預(yù)測(cè)AC002390序列的CpG島的結(jié)果 三、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)是在mRNA序列的3端終止密碼子下游位置上的加尾信號(hào)（tailing signal）。前體mRNA 3端多聚腺苷酸化是真核細(xì)胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄后處理的三個(gè)最主要步驟之一，這三個(gè)步驟包括：5帽子結(jié)構(gòu)的形成、內(nèi)含子的剪切及3端的多聚腺苷酸化，因此，前體mRNA 3端多聚腺苷酸化與mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)、mRNA的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯的起始以及一些其他的細(xì)胞機(jī)制和疾

10、病機(jī)制有著重要關(guān)系。真核生物前體mRNA3端的多聚腺苷酸化包括兩個(gè)步驟：1. 特異性的核苷酸內(nèi)切酶在PolyA位點(diǎn)處進(jìn)行斷裂；2. 腺苷酸聚合酶在斷裂位點(diǎn)處添加PolyA尾巴，其主要標(biāo)志 為AATAAA或ATTAAA兩種序列，稱為多聚腺苷酸信號(hào) （polyadenylation signal），簡(jiǎn)稱PolyA信號(hào)序列，也稱為 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。 在3UTR區(qū)存在多個(gè)潛在PolyA位點(diǎn)，因此對(duì)PolyA位點(diǎn)的準(zhǔn)確識(shí)別，對(duì)于預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)、理解mRNA的形成機(jī)制及某些疾病的分子機(jī)制具有巨大的作用。利用POLYAH預(yù)測(cè)分析轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) SoftBerry網(wǎng)站的POLYAH軟件是識(shí)別3端剪切和PolyA區(qū)域

11、的在線工具。其網(wǎng)址為：/berry.phtml?topic=polyah&group=programs&subgroup=promoter， 四、啟動(dòng)子promoters 啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，是位于結(jié)構(gòu)基因5端上游區(qū)的DNA序列，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。啟動(dòng)子本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過(guò)與稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)合而控制基因活動(dòng)的。轉(zhuǎn)錄因子就像一面“旗子”，指揮RNA聚合酶的活動(dòng)。如果基因的啟動(dòng)子部分發(fā)生突變，則會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)節(jié)障礙。這種突變常見(jiàn)于惡性腫瘤。利用PromoterScan預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子區(qū)域 BioInformatics and Molecular

12、Analysis Section網(wǎng)站的PromoterScan軟件是預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子區(qū)域的在線工具。其網(wǎng)址為：http:/www-/molbio/proscan/ PromoterScan在線網(wǎng)頁(yè)五、密碼子偏好性 密碼子使用偏性是指生物體中編碼同一種氨基酸的同義密碼子的非均勻使用現(xiàn)象。這一現(xiàn)象的產(chǎn)生與諸多因素有關(guān)，如基因的表達(dá)水平、翻譯起始效應(yīng)、基因的堿基組分、某些二核苷酸的出現(xiàn)頻率、G+C含量、基因的長(zhǎng)度、tRNA的豐度、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及密碼子一反密碼子間結(jié)合能的大小等。所以對(duì)密碼子使用偏好性的分析具有重要的生物學(xué)意義。利用CodonW分析密碼子偏好性 CodonW是美國(guó)DEC公司開(kāi)發(fā)的對(duì)密碼子

13、的使用進(jìn)行分析的免費(fèi)的軟件工具。此軟件是建立在大量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的基礎(chǔ)上，為了簡(jiǎn)化在線分析的復(fù)雜性而開(kāi)發(fā)的，它可以在Windows環(huán)境下運(yùn)行，并且可以同時(shí)處理2000條以上的序列。通過(guò)對(duì)DNA或RNA序列的分析，CodonW會(huì)產(chǎn)生關(guān)于密碼子使用的相關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的數(shù)據(jù)，我們可以利用這些數(shù)據(jù)對(duì)我們所要了解的序列進(jìn)行分析。其下載網(wǎng)址為：ftp:/molbiol.ox.ac.uk/cu/codonW.tar.Z。CodonW1.4主菜單的操作頁(yè)面 waxy基因的序列 序號(hào)Genebank登陸號(hào)物 種基因功能1234567AY094405AF486514X03935X62134X88789U2394

14、5X57233Arabidopsis halianaHordeum vulgareZea maysO.sativaP.sativumSorghum bicolorWheatgranule bound starch synthase I mRNAgranule bound starch synthase I mRNAglucosyl transferasegranule bound starch synthase I mRNAmRNA for starch synthasegranule-bound starch synthase precursor (Wx)mRNAwaxy mRNA for

15、granule-bound starch synthase用CodonW分析waxy基因所得的RSCU值 和 個(gè)數(shù) Finding sequence motifs common to a group of similar sequencesORFsUpstream regionSimilar sequence found in most upstream regionsHow do you identify motifs in sequence data?How can you tell if the identified motif is significant?How do you fin

16、d genomic examples of the identified motif?A G A T G G A T G GT G A T T G A T G T T G A T G G A T G GA G A T T G A T C G T G A T G G A T T G T G A T G G A T T G A G A T G G A T T G IUPAC consensus:W G A T G G A T N GSite 1Site 2Site 3Site 4Site 5Site 6Site 7 (where W = A or T)First, representation o

17、f motifs: Position-specific Weight Matrices (PWMsaka Position-Specific Scoring Matrix, PSSM)A G A T G G A T G GT G A T T G A T G T T G A T G G A T G GA G A T T G A T C G T G A T G G A T T G T G A T G G A T T G A G A T G G A T T G G 0 1.0 0 0 0.7 1.0 0 0 0.4 0.8A 0.4 0 1.0 0 0 0 1.0 0 0 0T 0.6 0 0 1.

18、0 0.3 0 0 1.0 0.4 0.2C 0 0 0 0 0 0 0 0 0.2 0Site 1Site 2Site 3Site 4Site 5Site 6Site 7PWM represents frequencies of each base at each position in the motif * These days, PWM/PSSM can correspond to the frequency matrix or a likelihood matrixFirst, representation of motifs: Position-specific Weight Ma

19、trices (PWMsaka Position-Specific Scoring Matrix, PSSM)A graphical representation of PWMsHeight of the base proportional to frequency of base on that position more specifically known as “bits” , “information content” , or “entropy”Information content ICThe least variable positions likely are importa

20、nt for specifying the protein-DNA interactionTherefore high information content = low sequence variation at that position.If using log2, the info content is in bitsICi = 2 + S Pb(i) * log2(Pb(i) )b=G,A,T,CInformation Content at position i:Where Pb(i) is the probability of base b at position i G 0 1.

21、0 0 0 0.7 1.0 0 0 0.4 0.8A 0.4 0 1.0 0 0 0 1.0 0 0 0T 0.6 0 0 1.0 0.3 0 0 1.0 0.4 0.2C 0 0 0 0 0 0 0 0 0.2 0Information content ICThe least variable positions likely are important for specifying the protein-DNA interactionTherefore high information content = low sequence variation at that position.I

22、f using log2, the info content is in bitsICi = 2 + S Pb(i) * log2(Pb(i)b=G,A,T,CInformation Content at position i:Where Pb(i) is the probability of base b at position i Maximum IC if P of some base is 1.0: = 2 + (1.0 * 0) + 0 + 0 + 0 = 2Minimum IC if P is 0.25 for all bases: = 2 + 0.25(-2) * 4 = 0G

23、0 1.0 0 0 0.7 1.0 0 0 0.4 0.8A 0.4 0 1.0 0 0 0 1.0 0 0 0T 0.6 0 0 1.0 0.3 0 0 1.0 0.4 0.2C 0 0 0 0 0 0 0 0 0.2 0G 0 1.0 0 0 0.7 1.0 0 0 0.4 0.8A 0.4 0 1.0 0 0 0 1.0 0 0 0T 0.6 0 0 1.0 0.3 0 0 1.0 0.4 0.2C 0 0 0 0 0 0 0 0 0.2 0Information content ICThe least variable positions likely are important fo

24、r specifying the protein-DNA interactionTherefore high information content = low sequence variation at that position.IC 1.0 2.0 2.0 2.0 1.1 2.0 2.0 2.0 0.5 1.3 = bit score of 15.9PositionbitsInformation Profile:PositionbitsOften for protein-DNA interactions, IC profile is smoothbitsPositionReal moti

25、fRandomized dataFinding matches to (instances of) a PWMG 0 1.0 0 0 0.7 1.0 0 0 0.4 0.8A 0.4 0 1.0 0 0 0 1.0 0 0 0T 0.6 0 0 1.0 0.3 0 0 1.0 0.4 0.2C 0 0 0 0 0 0 0 0 0.2 0Is the sequence A G A T T G A T C T a match to this matrix?b = G,A,T,C iJoint probability: assuming each position is independent, P

26、(motif) = P Pb(i)P(sequence | matrix model ) = (0.4)(1.0)(1.0)(1.0)(0.3)(1.0)(1.0)(1.0)(0.2)(0.2) = 0.0048Finding matches to (instances of) a PWMG 0 1.0 0 0 0.7 1.0 0 0 0.4 0.8A 0.4 0 1.0 0 0 0 1.0 0 0 0T 0.6 0 0 1.0 0.3 0 0 1.0 0.4 0.2C 0 0 0 0 0 0 0 0 0.2 0Is the sequence A G A T T G A T C T a mat

27、ch to this matrix?b = G,A,T,C iJoint probability: assuming each position is independent, P(motif) = P Pb(i)P(sequence | background model ) = (0.25)(0.25)(0.25)(0.25)(0.25)(0.25)(0.25)(0.25)(0.25)(0.25) = 6.8e-24P(sequence | matrix model ) = (0.4)(1.0)(1.0)(1.0)(0.3)(1.0)(1.0)(1.0)(0.2)(0.2) = 0.0048

28、Background model:P(G,A,T,C) = 0.25Log-likelihood ratio LLR= log ( P(sequence | matrix model ) / P(sequence | background model ) )A measure of how different the likelihood of the sequence is, given themotif model vs. the background model.In our example:LLR = log ( 0.0048 / 6.8e-24 ) = 20.8The larger

29、the LLR, the more likely the motif model is the right one.To select motifs in real life, can define a LLR cutoff (often defined by sampling).Finding matches to (instances of) a PWMG 0 1.0 0 0 0.7 1.0 0 0 0.4 0.8A 0.4 0 1.0 0 0 0 1.0 0 0 0T 0.6 0 0 1.0 0.3 0 0 1.0 0.4 0.2C 0 0 0 0 0 0 0 0 0.2 0Is the

30、 sequence A A A T T G A T C T a match to this matrix?b = G,A,T,C iJoint probability: assuming each position is independent, P(motif) = P Pb(i)P(sequence | matrix model ) = (0.4)(0)(1.0)(1.0)(0.3)(1.0)(1.0)(1.0)(0.2)(0.2) = 0* If your PWM was trained on a small sample set, you might have missed some examples= overfitting of the matrix (ie. too specific)Pseudo-counts: protecting agains