1、不同成熟度棉花種子脂肪酶活性測(cè)定指導(dǎo)老師： 瑪依拉老師作 者： 米耶賽.買(mǎi)買(mǎi)提艾力 班 級(jí)： 生技102班 學(xué) 號(hào)： 103135219 前言試驗(yàn)材料與方法結(jié)果與分析討論內(nèi)容簡(jiǎn)介結(jié)論前言棉花是世界上最主要的農(nóng)作物之一,也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物.棉花生產(chǎn)實(shí)踐表明, 棉花種子成熟度與棉花生產(chǎn)保全苗、齊苗、壯苗有直接關(guān)系.成熟度好的種子不僅發(fā)芽率高, 更重要的是田間出苗率高, 出苗整齊健壯,即種子活力高.所以, 種子成熟度是反映種子活力的重要內(nèi)在指標(biāo).不同成熟度的棉花種子所含的脂肪酶和它的活性不同,因此選取不同成熟度的棉花種子提取脂肪酶并且測(cè)定其活力根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果找出活力較高的棉花種子對(duì)以后的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提

2、供依據(jù). 二、材料與方法2.1 試驗(yàn)材料2.1.1 棉花種子 棉花惠遠(yuǎn)710品種 不同采收期吐絮當(dāng)天、吐后第10天、吐絮后20天、混合收的種子為實(shí)驗(yàn)材料.參與本實(shí)驗(yàn)的品種是新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花育種教研室提供.2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品儀器：高速勻漿機(jī)，離心機(jī),冰谷,鑷子,剪刀,發(fā)芽盒，移液搶?zhuān)x心機(jī)，恒溫水溶谷，燒杯，PH測(cè)定紙,定容瓶,玻璃棒，三角膠頭滴管,電磁攪拌器,雙層紗布,烘干箱. 藥品 ：升汞，蔗糖,PH試紙，乙酸銅,Twenn-20和橄欖油,EDTA,KCI, MgCI2, DTT,磷酸緩沖液,雙氧水,吡啶的溶液,橄欖油,脂肪酸顯色劑,乳酸苯酚透明液，蒸餾水,95%酒精,4%聚乙

3、烯醇,橄欖油,底物溶液，氫氧化鈉 ，酚酞指示液.2.2 試驗(yàn)方法2.2.1 實(shí)驗(yàn)處理 選用細(xì)沙為發(fā)芽床，發(fā)芽溫度為常溫3035溫度和沙床，共4個(gè)處理的，每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)120粒種子。2.2.2 室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽實(shí)驗(yàn)2.2.2.1 砂床準(zhǔn)備 2.2.2.2 種子處理2.2.2.3 棉花葉子處理 我將發(fā)芽第4天的棉花幼苗用于做實(shí)驗(yàn)（如圖所示）我將長(zhǎng)好的子葉拔下來(lái)裝到空的發(fā)芽盒里面.然后把它消毒了以后做實(shí)驗(yàn)材料. 第四天發(fā)芽的棉花種子 2.2.3 棉花種子脂肪酶的提取參考Huang11的方法,將種子或幼苗蒸餾水洗凈后,取兩片子葉加入1.0ml含0.6mol/L蔗糖,lmmol/LEDTA10mrn

4、ol/LKCI,lmmol/LMgC12,2mmol/LDTT及0.15mmol/LTrieine,pH為7.5的酶提取液,在4度冰浴研磨,勻漿經(jīng)過(guò)濾除去組織碎片,即可直接作為酶的粗提取液測(cè)酶活性.在部分實(shí)驗(yàn)中,為除去勻漿中本身所含有脂類(lèi)物質(zhì)的干擾,將濾液在104g 10min下離心,棄去浮在表層的脂肪及沉淀物,用上清液部分作為脂肪酶酶源. 2.2.4 脂肪酶活性測(cè)定法電位滴定法按pH計(jì)使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行儀器校正；取兩個(gè)100mL燒杯，分別作為空白A和樣品B，分別加入底物溶液4mL和磷酸緩沖液5mL，再于A中加入95酒精15.00mL，于400.2水浴中預(yù)熱5min，然后各加1mL酶液，立即混勻計(jì)

5、時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于B中立即補(bǔ)加15.00mL 95酒精終止反應(yīng)取出。在燒杯中加入一轉(zhuǎn)子，置于電磁攪拌器上，邊攪拌，邊用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至pH10.3，為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。指示劑滴定法取兩個(gè)100mL三角瓶，分別作為空白A和樣品B，分別加入底物溶液4mL和磷酸緩沖液5mL，再于A中加入95酒精15.00mL，于400.2水浴中預(yù)熱5min，然后各加1mL酶液，立即混勻計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于B中立即補(bǔ)加15.00mL 95酒精終止反應(yīng)，取出。于A、B瓶中各酚酞兩滴，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保持30s不退色為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶

6、液的體積。三，結(jié)果與分析3.1 兩種測(cè)定方法對(duì)脂肪酶活性的比較測(cè)定脂肪酶活力是我們用了電位滴定法和指示劑滴定法等兩種方法，測(cè)定結(jié)果如圖表（1）所示，從下面圖可以看出，電位滴定法和指示劑滴定測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果在數(shù)值上有一定差異，不能相互替代。用指示劑滴定法來(lái)分別測(cè)定棉花種子吐絮當(dāng)天，第10天，第20天，混合種子的結(jié)果比滴定法的結(jié)果高，那是因?yàn)橹甘緞┑味ǚㄔ囼?yàn)過(guò)程中，用NaOH滴定生成的脂肪酸,以酚酞作指示劑。滴定NaoH的體積多一點(diǎn),在棉花脂肪酶的測(cè)定中,由于棉子含油分高、棉酚等的干擾,指示劑顯色變化緩慢等當(dāng)點(diǎn)顯色突變很難準(zhǔn)確把握棉花種子脂解酶顯著的堿性特性。圖表(1）電位滴定法與指示劑滴定法對(duì)

7、脂肪酶活力變 2.2 不同溫度對(duì)脂肪酶活力的影響圖（2）吐絮當(dāng)天，吐絮后第10天，吐絮后20天，混合種子活力與溫度的關(guān)系2.3 不同成熟度的棉花種子的脂肪酶活力比較不同成熟度對(duì)種子活力的影響不同，由表可以看 出隨著棉花種子吐絮后采收期的長(zhǎng) ，棉花種子的脂肪酶活力指數(shù)逐漸降低,以吐絮后第10天的最高,說(shuō)明其活力最強(qiáng),其次為吐絮當(dāng)天的.測(cè)定方法 吐絮0號(hào) 吐絮10號(hào) 吐絮20號(hào) 混合種子 電位滴定法 6.66u/g 10.661u/g 6.318u/g 6.16u/g 指示劑滴定法 10.66u/g 12.988u/g 6.651u/g 6.56u/g電位滴定法 7.64u/g 9.541u/g

8、6.28u/g 4.02u/g指示劑滴定法 5.834u/g 6.541u/g 3.81u/g 2.35u/g電位滴定法和指示劑滴定法是3040的，電位滴定法 和指示劑滴定法 4050的活力測(cè)定。四，討論4.1 影響脂肪酶測(cè)定結(jié)果有很多因素,其中底物,反應(yīng)溫度和pH因素影響最大.在滴定法中,以前國(guó)外有報(bào)導(dǎo)測(cè)定脂肪酶酶活力時(shí),不將底物制成乳化液直,接在攪拌狀態(tài)下對(duì)油脂 進(jìn)行酶解反應(yīng)然后用堿滴定生成的脂防酸.4.2 雖然PVA對(duì)該酶解反應(yīng)有抑制作用，PVA增加了體系的粘度，使反應(yīng)體系的流動(dòng)性變差，對(duì)酸堿滴定也會(huì)產(chǎn)生一定影響，但綜合考慮，它能形成較均勻的乳化體系，使酶能與底物充分接觸、反應(yīng)，隨機(jī)誤差

9、大大減小。平行測(cè)定中，PVA的影響作為系統(tǒng)誤差可基本抵消，具有可比性，故宜采用加PVA制成乳化液這樣的反應(yīng)體系。4.3 酶都有其最適的反應(yīng)溫度，在不同溫度下酶所表現(xiàn)的活性也不同，溫度的升高可以加快反應(yīng)速度，但會(huì)引起酶蛋白變性失活。同一濃度的堿性脂肪酶在相同的溫度下，對(duì)同樣的底物作用，在不同的pH環(huán)境中，所測(cè)得的酶活也不同。五，結(jié)論 5.1 棉花種子脂解酶顯著的堿性特性. 5.2 最適PH值7.5時(shí)，脂肪酶催化反應(yīng)的溫度作用范圍為3040，最適溫度35. 5.3從試驗(yàn)結(jié)果可看出不同成熟期棉花所采收的種子活力有差異. 最掛采收期吐絮后第十天. 種子成熟度與子葉中可溶性脂肪含量有相關(guān).當(dāng)天采收的棉花種子脂肪酶含量比正常成熟的低 , 第20天采收棉花種子的活力也低.因?yàn)橥滦醍?dāng)天不完全成熟,吐絮后第20天以后棉花活力逐漸走向衰老,葉片光合速率逐步下降.所以把棉花種子吐絮后第十天采收最好,成熟充分,又及時(shí)采收,種子質(zhì)量好且活力高.謝謝觀賞 本試驗(yàn)的完成是在我們的導(dǎo)師瑪依拉老師的細(xì)心指導(dǎo)下進(jìn)行的. 在每次實(shí)驗(yàn)遇到問(wèn)題時(shí)老師不辭辛苦的講解才使得我的試驗(yàn)順利地進(jìn)行.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,花費(fèi)了瑪依拉老師很多的寶貴時(shí)間和精力,在此向?qū)煴硎局孕牡馗兄x！導(dǎo)師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度,開(kāi)拓進(jìn)取的精神和高度的責(zé)任心都將使學(xué)生受益終生！ 還要感謝和我同一試驗(yàn)小組的各位