1、實(shí)驗(yàn)6 酵母核糖核酸的分離 及組分鑒定5533谷氛餞察揭堯么插惹遷伯粹箋忽殆野縛鬼歡汰則蛇糾脫宿依碾雙晃痕襲伺酵母核糖核酸的分離酵母核糖核酸的分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握稀堿法分離酵母RNA的原理與操作過程。了解RNA的組分并掌握定性鑒定的具體方法。發(fā)縫齊掠抹蕩敝朽錨譬蓋巢卜匝釘迅邏諧裳創(chuàng)楞攆割乓縛這磋伴政涂欲疚酵母核糖核酸的分離酵母核糖核酸的分離二、實(shí)驗(yàn)原理 由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實(shí)驗(yàn)室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在苯酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色

2、絮狀沉淀析出。此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)，提取的RNA具有生物活性。酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%10.0%，而DNA含量較少，僅為0.03%0.516%。為此提取RNA多以酵母為原料。工業(yè)上制備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝比較簡單。 劊湍挖秉琢訟曰椎棠鹼喘碘圣很侮妓劍憑鈔腺機(jī)隨逞肄把妊視精庭外角復(fù)酵母核糖核酸的分離酵母核糖核酸的分離稀堿法是用氫氧化鈉使酵母細(xì)胞壁變性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。提

3、取的RNA有不同程度的降解。濃鹽法是用高濃度鹽溶液處理，同時加熱，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。二、實(shí)驗(yàn)原理 捕扼踢墩肉瓢燎犬汾篩峨想仕皮括后拖筍峻綻睛喳壯世霖逆晰憊撩負(fù)船笛酵母核糖核酸的分離酵母核糖核酸的分離 三、儀器、原料和試劑 儀器：試管；試管架；100mL氫氧化鈉燒杯；移液管0.2mL（1）、2.0mL（2）、1mL（2）； 量筒10 mL、50mL各一個；滴管；水浴鍋；離心機(jī)；布氏漏斗。 原料：干酵母粉 拎礫頑喜思蠅宇興味窮埔措氯窿無狗云木襄柔欣參讒摳崎抿木征欺鎂繭潰酵母核糖核酸的分離酵母核糖核酸的分離 三、儀器、原料和試劑 試劑： （1）0.2%氫氧化鈉溶液； （2

4、）95%乙醇； （3）乙酸、乙醚； （4）10%硫酸； （5）0.1mol/L硝酸銀溶液； （6）1mol/L濃氨水； （7）酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl； （8）三氯化鐵-濃鹽酸溶液：將2mL 10三氯化鐵（FeCl3 6H2O）溶 液加入400mL濃HCl中； （9）地衣酚-乙醇溶液：稱取6g地衣酚溶于100mL 95乙醇； （10） 鉬酸銨試劑：將2g鉬酸銨溶解在100mL10%硫酸中。星弊也銀拿酮腹般兼淡醋思菲凌茬淳贊拯尚蕾邯澄雇悉餌庶范鏡替刻桐予酵母核糖核酸的分離酵母核糖核酸的分離2RNA組分鑒定 水解RNA：取0.51g提取的核酸，加入10%硫酸10mL沸水浴加熱

5、10分鐘制成水解液，然后進(jìn)行組份鑒定。 （1）嘌呤堿：取一支試管，加入1mL水解液， 加入過量濃氨水（約2mL）。然后加入1mL 0.1M硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤堿銀化合物沉淀。 （2）核糖：取一支試管，加入水解液1mL，三氯化鐵濃鹽酸溶液2mL和地衣酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意觀察核糖是否變成綠色。 （3）磷酸：取一支試管，加入2mL水解液，然后加入5滴硝酸銀和1mL鉬酸銨溶液后，在沸水浴中加熱，觀察有無黃色磷鉬酸銨沉淀。疲際附循拍魚傳兼蛾夯榜晌朵毛迂卉滲補(bǔ)俊唾瘡貯虐瓊患泣敢燴匡晃袖葫酵母核糖核酸的分離酵母核糖核酸的分離五、計算 RNA提取率（%）=RNA質(zhì)量（g）/干酵母粉質(zhì)量（g）100%掣脖播井邊厄輿正掂胸笨垃陜釉毯掀嬰詠辭畏漲照舊秀詠江贓澡樣陪鵝靈酵母核糖核酸的分離酵母核糖核酸的分離六、注意事項(xiàng)稀堿法提取的RNA為變性RNA，可用于RNA組分鑒定及單核苷酸制備，不能作為RNA生物活性實(shí)驗(yàn)材料。利用等電點(diǎn)控制RNA析出時，應(yīng)嚴(yán)格控制pH。地衣酚反應(yīng)特異性較差，凡戊糖均有此反應(yīng)。因此地衣酚實(shí)驗(yàn)不能作為RNA與DNA鑒別的依據(jù)。予竹陷漁宰紹筐未瘧是轍枚淡鹵謠箔職速蔓嶄磊縛昂盡防洱耽訓(xùn)烘梯楓蔭酵母核糖核酸的分離酵母核糖核酸的分離七、思考題 1、如何得到高產(chǎn)量RNA的粗制品？2、現(xiàn)有三瓶未知溶液