1、流式細胞分析1第1頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四流式細胞儀（FlowCytometer簡稱FCM）是一項集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術及細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技儀器。概括來說，流式細胞術就是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒進行多參數的、快速的定量分析和分選的技術。從開始設想到第一臺儀器的問世,科技工作者進行了不懈的努力。隨著各相關技術的迅速發(fā)展，F(xiàn)CM技術已經成為日益完善的細胞分析和分選的工具。2第2頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四FCM儀器分為二大類：一類為臺式機，其特點為：儀器的光

2、路調節(jié)系統(tǒng)固定，自動化程度高，操作簡便，易學易掌握。BD公司的臨床型FACScan也是最早可用于臨床診斷的儀器。另一類為大型機，其特點為可快速將所感興趣的細胞分選出來，并且可將單個或指定個數的細胞分選到特定的培養(yǎng)孔或板上，同時可選配多種波長和類型的激光器，適用于更廣泛更靈活的科學研究應用。3第3頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四流式細胞儀實物BD FACSVantageBD-Calibur 4第4頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四其特點是：測量速度快，最快可在1秒種內計測數萬個細胞；可進行多參數測量，可以對同一個細胞做有關物理、化學特性的多參數測

3、量，并具有明顯的統(tǒng)計學意義；是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術、計算機技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等從多領域的知識和成果；既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。5第5頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四概要說來，流式細胞術主要包括了樣品的液流技術、細胞的分選和計數技術，以及數據的采集和分析技術等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個世紀以來人們在這方面的心血和成果。 6第6頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四流式細胞儀發(fā)展的歷史 起源: 1934年- 細胞計數儀 雛形: 1949年- Coulter 計數器 1959年- B型Coulter計

4、數器 1972年: BD(Becton-Dickinson) 第一臺流式細胞儀, 具有分選功能 7第7頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四 流式細胞儀主要由三部分組成：流動室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下： 液流系統(tǒng)：依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)。 光路系統(tǒng)：細胞由激光激發(fā)，通過光學濾片產生光信號，并傳送到相應的探測器。 電系統(tǒng)：把光信號轉換為電信號。8第8頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四在流式細胞儀中，細胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。任何存在于懸液中的直徑為0.2-150微米的粒子或細胞都適用于流式分析。在實際工作中，用實體

5、組織進行流式細胞分析往往是不可能的，分析之前必須對其進行分解。被液滴包繞的粒子稱為細胞液柱，當粒子經過激光照射區(qū)時，通過激光激發(fā)產生散射光。含有熒光的粒子就會表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)（相應的透鏡，濾片和探測器）收集。分光器和濾光片引導散射光和熒光至相應的探測器，把光信號轉換為電信號。 9第9頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四10第10頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細胞傳送到激光束的中心。而且在特定時間內，應該只有一個細胞或粒子通過激光束。 因此，必須在

6、流動室內把細胞注入鞘液流。流動室是液流系統(tǒng)的核心部件，臺式機中流動室稱為樣品槽，大型機稱之為噴嘴。在流動室內細胞液柱聚焦于鞘液中心，細胞在此與激光相交。 11第11頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四Flow CellInjector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid12第12頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四13第13頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四 高流速適用于定性測量，如免疫表型。樣本流變寬，細胞間距離縮短，這樣在單位時間內流經激光照射區(qū)的細胞數量

7、增加，可以快速獲取數據。 低流速促使樣本流變窄，單個細胞得以依次通過，這樣大多數細胞可流經激光束的中心，細胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測分辨率要求高的實驗，如DNA分析。 14第14頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四散射光信號和熒光信號的檢測前向角散射：前向角散射（FSC）光與被測細胞的大小和面積有關，檢測的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向的散射光信號。FSC不受細胞熒光染色的影響，常用于免疫表型分析的信號處理。15第15頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四Forward Angle Light Scatter

8、前向角FALS SensorLaser16第16頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四側向角散射：側向角散射（SSC）光與被測細胞的顆粒密度和內部結構有關，對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感。SSC收集與激光束正交90度方向的散射光信號。17第17頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四90 Degree Light Scatter90度側向角FALS Sensor90LS SensorLaser18第18頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四流式細胞儀產生的信號非熒光信號顆粒度細胞大小19第19頁，共54頁，2022年，5月20日，

9、11點20分，星期四上述兩種信號都是來自于激光原光束，目前采用這兩個參數組合，可區(qū)分不同種類的細胞亞群，同時可獲得細胞相關的重要信息，下圖（圖3-2）為FSC和SSC組成的二維散點圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細胞、單核細胞及粒細胞區(qū)分開。 20第20頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四21第21頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四熒光信號熒光物質吸收符合其波長范圍的光能量，內部電子受激上升到高能級。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過剩能量成為光子。這種能量的轉換稱為熒光。 能夠激發(fā)熒光物質的波長范圍稱為激發(fā)光譜。因為更多的能量消耗在吸收轉換而

10、不是熒光轉換中，所以發(fā)射光波長要高于激發(fā)光波長。熒光物質的發(fā)射波長范圍叫做發(fā)射光譜。 22第22頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四目前的流式細胞儀大多采用氬離子激光器，因為488nm的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質的激發(fā)光譜的峰值，所產生的熒光信號愈強。FITC的激發(fā)光譜如圖3-3所示， 488nm非常接近FITC的激發(fā)光譜的峰值，所以FITC被激發(fā)時會表現(xiàn)出最強熒光信號，而當FITC被其波譜范圍內的其它波長激發(fā)時，也會檢測到熒光，但信號強度不會這么高。23第23頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四24第24頁，共54頁，

11、2022年，5月20日，11點20分，星期四25第25頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四Fluorescein (FITC)400 nm600 nm700 nmWavelength500 nmExcitationEmission26第26頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四Phycoerythrin (PE)400 nm600 nm700 nmWavelengthExcitationEmission500 nmFluorescent Dyes27第27頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四EthidiumPEcis-Parina

12、ric acidTexas RedPE-TR Conj.PIFITC600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610632488Common Laser Lines28第28頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四29第29頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四對單克隆抗體進行熒光染色，通過分析細胞表面抗原標記確認細胞類型。在細胞的混合群體中，我們使用不同的熒光染料區(qū)分細胞亞群。每個亞群的染色模式與FSC和SSC數據相結合，用于識別樣本中的細胞種類，并可以得到各細胞亞群的百分含量。而且，還可以對感興趣的細胞進行再分選。3

13、0第30頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四FluorescenceFALS SensorFluorescence detector31第31頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersExample Channel Layout for Laser-based Flow CytometryLaser 1234Flow cell32第32頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四臺式機通常配有兩根激光器：第一根激光器波長為488nm。第二根為波長635nm的紅

14、二極管固態(tài)激光器。33第33頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四數據分析 34第34頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四ImmunophenotypingCD2CD435第35頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四設門 通過設門的方法可以定義細胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據FSC或細胞大小，在FSC，SSC的散點圖中設門，其數據結果只反映淋巴細胞亞群的熒光特性。36第36頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四37第37頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星

15、期四直方圖可直觀單個參數的細胞數量。陰性對照用于決定直方圖中單參數的左右邊界。左圖中M1為陰性對照峰。右圖中M2為CD3 FITC陽性峰。 38第38頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四39第39頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四統(tǒng)計結果表明，整個事件共記錄了6000個細胞，門內淋巴細胞2891個。其中M1（陰性）細胞619個，M2（CD3陽性）細胞2272個細胞。淋巴細胞亞群CD3陽性百分含量的統(tǒng)計結果為：M2：2272/2891=78.59%。 40第40頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四二維點圖以雙參數顯示結果，每個點

16、表示一個或多個細胞。圖為陰性對照圖，用于設定陰性對照邊界，全圖劃分為四個象限，以區(qū)分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。左下象限（LL）為雙陰性細胞，左上象限（UL）為Y軸陽性細胞（CD19 PE），右下象限（LR）為X軸陽性細胞（CD3 FITC），右上象限（UR）為雙陽性細胞（CD19+/CD3+）。 41第41頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四如圖5-7所示，淋巴細胞亞群雙陽性細胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43%。 42第42頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四分 選 43第43頁，共54頁，2022年，5

17、月20日，11點20分，星期四488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detectorPurdue University Cytometry Laboratories44第44頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四流式細胞術的臨床應用45第45頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四1.檢測淋巴細胞亞群，監(jiān)測細胞免疫狀態(tài)2.白血病/淋巴瘤免疫分型 3.HLA組織配型及HLA與某些疾病的關系4.干祖細胞的定量及成分分析.5.其它

18、:血小板PAIg：粘附分子;TCR多態(tài)性檢測; 腫瘤癌基因及 抑癌基因蛋白產物的檢測;細胞內酶;耐藥蛋 白的分析等等。臨床常見應用46第46頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四HLA-B27檢測 外周血HLAB27的表達及其表達程度與強直性脊柱炎的發(fā)生有很大程度的相關性.循環(huán)血中活化血小板（CD62P、CD63）： 糖尿病伴微血管病變、冠心病、高血壓病、高脂血癥、腦血栓形成、短暫性腦缺血發(fā)作、腦動脈硬化患者活化血小板百分率和絕對值顯著高于正常人。而糖尿病無微血管病變、周圍血管病變以及深靜脈血栓形成患者活化血小板水平與正常人無顯著差異。PTCA后24小時發(fā)展成急性血管閉塞或

19、高度再狹窄的患者活化血小板CD62p、CD63增多，可以用于預測PTCA后急性缺血再發(fā)作的危險性。 47第47頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四微轉移腫瘤細胞靈敏度:10-748第48頁，共54頁，2022年，5月20日，11點20分，星期四 細胞周期分析:在細胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標記DNA，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。也可利用細胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對細胞周期進行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及細胞周期分析49第49頁，共54頁，2022年