1、實(shí)驗(yàn)八質(zhì)粒提取與電泳Extraction and Identification of Recombinant Plasmid實(shí) 驗(yàn) 目 的1、學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理2、學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法3、掌握質(zhì)粒提取及鑒定的基本操作實(shí) 驗(yàn) 原 理質(zhì)粒(Plasmid)是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為環(huán)形閉合的雙股DNA。 質(zhì)粒具有可自主復(fù)制、傳給子代、也可丟失及在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移等特性，與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān)。 在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。 DNA瓊脂糖凝膠電泳： 電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng) 核酸從負(fù)極向正極泳動(dòng)，小分子泳動(dòng)速度較快 質(zhì)粒DNA較染色體DNA小，且具有超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的特點(diǎn)。

2、 pH調(diào)至中性，變性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型， 而染色體DNA不能復(fù)性，與蛋白質(zhì)一起沉淀。 堿變性條件下, 染色體DNA雙螺旋解開而變性，而質(zhì)粒DNA部分解開, 雙鏈不會(huì)完全分離。實(shí) 驗(yàn) 步 驟取1.5ml菌液，9000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清。用250l溶液P1重懸菌體沉淀，槍頭反復(fù)抽吸至菌體徹底懸浮。P1：葡萄糖：制造低滲環(huán)境，增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性； 增加溶液的粘稠度，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉底。 EDTA：螯合核酸酶加250l溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次使菌體充分裂解至清亮。P2：NaOH/SDS溶液，是最佳的溶解細(xì)胞的試劑。 NaOH使DNA變性，SDS使蛋白質(zhì)變

3、性。染色體與蛋白質(zhì)纏繞。加400l溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次，放置5min。13000rpm離心10min，小心取上清。P3：醋酸/醋酸鉀溶液，使溶液pH值恢復(fù)接近中性。此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA難以復(fù)性。SDS遇到K+變成十二烷基硫酸鉀，不溶于水，連同結(jié)合的蛋白質(zhì)和纏繞其上的染色體DNA共同沉淀。加500l去蛋白液PE，13000rpm離心60sec，棄濾液。加500l漂洗液WB，13000rpm離心60sec，棄濾液。（重復(fù)一遍）取出吸附柱，放入干凈離心管中，在吸附膜中間部位加40l洗脫緩沖液EB，放置1min，13000rpm離心1min洗脫DNA，-20保存?？罩?30

4、00rpm離心2min。敞口放置3min，除去殘留乙醇。將上清液加入吸附柱中，13000rpm離心1min，棄濾液。注意：吸附柱使用前需先處理。將吸附柱置于收集管上，加500l溶液P4，13000rpm離心1min，棄濾液。P4：緩沖液，濕潤(rùn)、平衡吸附膜加250l溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)610次使菌體充分裂解，至溶液變清亮。取1.5ml菌液，9000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清。用250l溶液P1重懸菌體沉淀，槍頭反復(fù)抽吸至菌體徹底懸浮。加400l溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)610次，放置5min。13000rpm離心10min，小心取上清。吸附柱置于收集管上，加500l溶液P4，130

5、00rpm離心1min，棄濾液。加500l去蛋白液PE，13000rpm離心3060sec，棄濾液。加500l漂洗液WB，13000rpm離心3060sec，棄濾液。（重復(fù)一次）取出吸附柱，放入干凈離心管中，在吸附膜中間部位加40l洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在6570水浴中加熱效果更好），放置1min，13000rpm離心1min洗脫DNA，-20保存。空柱13000rpm離心2min。放置35min，除去殘留乙醇。將上清液加入吸附柱中，13000rpm離心1min，棄濾液。瓊脂糖凝膠電泳樣品：10 l質(zhì)粒樣品 + 2 l上樣緩沖液，混勻電泳：90120mA，電泳2040分鐘配膠：瓊脂糖凝膠粉，溶于TBE緩沖液中， 配成1%1.2%的瓊脂糖凝膠上樣：將樣品用微量移液器加入凝膠孔中2000bp 1000bp750bp500bp250bp100bpMarkerPEP實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果負(fù)極正極注 意 事 項(xiàng)1、注意無(wú)菌操作，避免細(xì)菌污染質(zhì)粒；2、瓊脂糖凝膠的配制、使用過程中用到溴化乙錠(EB) 是強(qiáng)誘