1、基因工程的基本操作程序參考課件第1頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二 基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞操作過程目的基因的檢測(cè)與鑒定第2頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二第3頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二 目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因目的基因的獲取供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：將需要的基因從供體生物細(xì)胞內(nèi)提取出來目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因等。第4頁，共26頁，2022年，5月20日

2、，12點(diǎn)5分，星期二 1）從基因文庫中獲取目的基因1.什么是基因文庫？2.怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？種類：基因組文庫：部分基因文庫(cDNA文庫)：獲得目的基因的方法2）2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3）人工合成 含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA第5頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二1.用一定的_切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出_。2.用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。 核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處， 再加入適量_，形成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏

3、性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建第6頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA 連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種 限制酶 目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。第7頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二 科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉

4、花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲能力。 資 料:第8頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因第9頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。轉(zhuǎn)化目的基

5、因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第10頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第11頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功檢測(cè)鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法DNA分子雜交DNA分子雜交抗原-抗體雜交第12頁，共26頁，2022年，5月

6、20日，12點(diǎn)5分，星期二PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理：前提：條件：PCR擴(kuò)增儀DNA雙鏈復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的兩條鏈為模板溫度控制第13頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二類別項(xiàng)目復(fù)制轉(zhuǎn)錄場(chǎng)所特點(diǎn)模板原料酶能量堿基配對(duì)產(chǎn)物細(xì)胞核只有DNA的一條鏈四種核糖核苷酸RNA聚合酶ATPA-U C-G T-A G-C細(xì)胞核DNA的兩條鏈四種脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶ATPA-T C-G T-A G-C兩個(gè)雙鏈DNA分子一條單鏈mRNA邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制邊解旋邊轉(zhuǎn)錄第14頁，共26頁，2022年

7、，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二5/3/GGTC3/5/GACC5/3/引物GG變性復(fù)性延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。5/3/AG引物第15頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第16頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二PCR技術(shù)擴(kuò)增過程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下， 斷裂，形成_ b、復(fù)性（55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與DNA模板結(jié)合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物的5端3端延伸，合成與模

8、板互補(bǔ) 的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第17頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二目的基因的mRNA單鏈DNA (cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 ：第18頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二2.微生物作受體細(xì)胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞3.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少

9、處理細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 _細(xì)胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：第19頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二 目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上 農(nóng)桿菌 導(dǎo)入植物細(xì)胞 整合到受體細(xì)胞的染色體上 目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達(dá) 1.農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體上2.轉(zhuǎn)化第20頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二第21頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二如果顯示出雜交帶，就表明待測(cè)樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。第22頁，共26頁，2022年，5月

10、20日，12點(diǎn)5分，星期二1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對(duì)應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成A. B. C. D.第23頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二3.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C增加質(zhì)粒分子的分子量D便于與外源基因連接4. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是A限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的C質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料第24頁，共26頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)5分，星期二5.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分( ) A.啟動(dòng)子 B.終止密碼 C.標(biāo)記基因 D.目的基因6.下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方( ) A基因槍法 B顯微注射法 C.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 D花粉管通道法第25頁，共26頁，