1、什么是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術？熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）作為一種高效的光學分子尺，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測等方面有廣泛的應用。在分子生物學領域，該技術可用于研究活細胞生理條件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用在整個細胞生命過程中占有重要地位，由于細胞內(nèi)各種組分極其復雜，因此一些傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的方法如酵母雙雜交、免疫沉淀等可能會丟失某些重要的信息，無法正確地反映在當時活細胞生理

2、條件下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的動態(tài)變化過程。FRET 技術是近來發(fā)展的一項新技術，為在活細胞生理條件下對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進行實時的動態(tài)研究提供了便利。一、FRET 技術基本原理熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個熒光發(fā)色基團在足夠靠近時，當供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移（即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移）。FRET 是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程，使供體熒光強度降低，而受體可以發(fā)射更強于本身的特征熒光（敏化熒光），也可以不發(fā)熒光（熒光猝滅），同時也伴隨著熒光壽命

3、的相應縮短或延長。能量轉(zhuǎn)移的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等因素有關。作為供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊。人們已經(jīng)利用生物體自身的熒光或者將有機熒光染料標記到所研究的對象上，成功地應用于核酸檢測、蛋白質(zhì)結構、功能分析、免疫分析及細胞器結構功能檢測等諸多方面。（傳統(tǒng)有機熒光染料吸收光譜窄，發(fā)射光譜常常伴有拖尾，這樣會影響供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊程度，而且供、受體發(fā)射光譜產(chǎn)生相互干擾。最新的一些報道將發(fā)光量子點用于共振能量轉(zhuǎn)移研究,克服了有機熒光染料的不足之處。相對于傳統(tǒng)有機熒光染料分子，量子點的發(fā)射光譜很窄而且不

4、拖尾，減少了供體與受體發(fā)射光譜的重疊，避免了相互間的干擾；由于量子點具有較寬的光譜激發(fā)范圍，當它作為能量供體時，可以更自由地選擇激發(fā)波長，可以最大限度地避免對能量受體的直接激發(fā)；通過改變量子點的組成或尺寸，可以使其發(fā)射可見光區(qū)任一波長的光，也就是說它可以為吸收光譜在可見區(qū)的任一生色團作能量供體，并且保證了供體發(fā)射波長與受體吸收波長的良好重疊，增加了共振能量轉(zhuǎn)移效率。）以 GFP 的兩個突變體CFPcyan fluorescent proteinYFP（yellow fluorescent protein）為例簡要說明其原理：CFP 的發(fā)射光譜與 YFP的吸收光譜有相當?shù)闹丿B，當它們足夠接近時，

5、用CFP 的吸收波長激發(fā)，CFP 的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至 YFP的發(fā)色基團上，所以 CFP 的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的 6 如要研究兩種蛋白質(zhì) a 和b 間的相互作用，可以根據(jù)FRET 原理構建融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（cyan fluorescent protein bYFP（yellow fluorescent protein用 CFP 吸收波長433 nm 作為激發(fā)波長，實驗靈巧設計，使當?shù)鞍踪|(zhì)a與 b 沒有發(fā)生相互作用時，CFP 與 YFP相距很遠不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而

6、檢測到的是 CFP 的發(fā)射波長為 476 nm 的熒光；但當?shù)鞍踪|(zhì) a與 b 發(fā)生相互作用時，由于蛋白質(zhì)b 受蛋白質(zhì)a 作用而發(fā) CFP 與 YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是 YFP的發(fā)射波長為 527 nm 的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉(zhuǎn)基因技術使其在細胞內(nèi)表達，這樣就可以在活細胞生理條件下研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用。二、FRET技術的應用隨著生命科學研究的不斷深入，對各種生命現(xiàn)象發(fā)生的機制，特別是對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的研究變得尤為重要。而要想在這些方面的研究取得重大突破，技術進步又是必不可少的。一些傳統(tǒng)的研究方法不斷發(fā)展，為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用

7、的研究提供了極為有利的條件，但同時這些研究手段也存在不少缺陷：如酵母雙雜交、磷酸化抗體、免疫熒光、放射性標記等方法應用的前提都是要破碎細胞或?qū)毎斐蓳p傷，無法做到在活細胞生理條件下實時的對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進行動態(tài)研究。FRET 技術的應用結合基因工程等技術正好彌補了這一缺陷，下面是 FRET 技術在相關生命科學領域中的具體應用。1、檢測酶活性變化（1）活細胞內(nèi)檢測蛋白激酶活性蛋白質(zhì)磷酸化是細胞信號轉(zhuǎn)導過程中的重要標志，研究其中的酶活性是研究信號通路的一個重要方面。以前酶活性測定主要是利用放射性以及免疫化學發(fā)光等方法，但前提都是要破碎細胞，用細胞提取物測定酶活性，還無法做到活細胞

8、內(nèi)定時、定量、定位的觀測酶活 FRET 方法就可以很好的解決這個問題：如 zhang 等人利用 FRET 原理設計了一種新的探針（一種融合蛋白）：新探針包含一個對已知蛋白激酶特異性的底物結構域，一個與磷酸化底物結構域相結合的磷酸化識別結構域。這個探針蛋白的兩端是 GFP 的衍生物 CFP與 ，利用 FRET 原理工作。當?shù)孜锝Y構域被磷酸化后，分子內(nèi)部就會發(fā)生磷酸化識別結構域與其結合而引起的內(nèi)部折疊，兩個熒光蛋白相互靠近就會發(fā)生能量遷移。如果磷酸酶進行作用將其去磷酸化，分子就會發(fā)生可逆性的變化。該研究小組3-4用幾組嵌合體來研究四種已知蛋白激酶的活性：PKA（protein kinase A）、

9、SrcAbl 、 EGFR（epidermalgrowth factor receptor FRET 來檢測激酶活性變化。對細胞進行生長因子處理后，幾種酪氨酸激酶都在幾分鐘內(nèi)被激活，檢測到 25%-35%的活性變化。用 forskolin激活 PKA能增強 FRET 25%-50%的變化，激酶在整個細胞質(zhì)范圍內(nèi)被激活。如果將報導探針加上核定位信號使之定位于核中，則 FRET 變化被極大的延遲了，這也說明了 PKA作用的區(qū)域性。由此可見，利用 FRET 方法可以很好的觀察活細胞內(nèi)酶活性變化，并且能做到定時、定量、定位，是一種非常有效的研究手段。（2）關于細胞凋亡的研究細胞凋亡過程大致可以分為三個

10、不同的階段：起始期細胞通過不同途徑接受多種與凋亡有關的信號；整合期多種信號在此整合，細胞做出生存或死亡的決定；執(zhí)行期一旦cysteinylaspartate-specific proteaseCaspase）在細胞凋亡的執(zhí)行期發(fā)揮關鍵作用，近年來對其研究成 FRET 技術的出現(xiàn)對此的研究提供了更為有利的條件：ReikoOnuki等人利用 FRET 技術研究了 Caspase8與 Bid蛋白之間的相互作用，Caspase8 活化后作用 Bid蛋白，使其裂解成兩個片段，然后羧基片段轉(zhuǎn)移到線粒體使其釋放細胞色素 C 誘發(fā)細胞凋亡。研究者將 Bid蛋白兩端分別與 CFP 與 YFP融合，精心設計使其在

11、沒有被裂解前剛好可以發(fā)生 FRET，當 Bid蛋白被裂解后 FRET 效應自然消失。所以是一種很好的檢測Caspase8 酶活性方法，而且當 Bid蛋白與 CFP 與 YFP融合之后仍能行使正常的功能，當融合物在細胞內(nèi)被裂解后，連接 CFP 的片段轉(zhuǎn)移到線粒體，通過 CFP熒光可以很清楚的觀測到其在細胞內(nèi)的定位。另外 Markus Rehm6與 Kiwamu Takemoto7等人利用FRET 技術設計了可以反映 Caspase3 酶活性變化的融合報告蛋白,通過此報告蛋白證實了在細胞凋亡過程中 Caspase3 酶活性變化是一個非常迅速的過程。2、關于膜蛋白的研究（1）受體激活效應在細胞膜上的

12、橫向擴散膜蛋白的研究一直都是信號通路研究中的重點和難點。當細胞膜局部受外界刺激后，相應受體被激活然后向細胞內(nèi)傳導信號，可是在這之前是否會有細胞膜上的橫向效應呢？近來 Peter 等人8在Science 上報道：細胞膜局部受刺激后，膜受體活化效應可迅速擴展到整個細胞膜。他們將膜受體 （epidermal growth factor receptor）與 GFP融合，抗活化后的 EGFR抗體用 Cy3 染料標記，刺激因子EGF（epidermal growth factor）用Cy5 染料標記，這樣可以很明顯的看到 EGF 在細胞膜上的局部分布。當 EGF 作用細胞后，EGFR活化并與其抗體結合，

13、于是 GFP與 Cy3 染料充分接近發(fā)生FRET，利用此方法可以很明顯的觀測到細胞膜局部受刺激后，受體活化效應迅速擴散到整個細胞膜。（2）膜蛋白的定位修飾我們知道膜蛋白是定位在細胞膜上不同的亞區(qū)域中，例如脂質(zhì)筏（lipid rafts）和小窩（caveolae），小窩包含著豐富膽固醇、鞘磷脂和信號蛋白。那么這些蛋白怎樣到達它們的目的地呢？Zacharias 等在 Science 上報道，?；阋允惯@些蛋白定位在脂質(zhì)筏。他們的研究是通過 FRET（fluorescence resonance energy transfer）技術，用GFP 的突變體CFPcyanfluorescent prot

14、ein）和 （yellow fluorescent protein）來進行。因為這些蛋白并沒有細胞內(nèi)定位序列，所以研究者將各種?；揎椀拿舾行蛄屑釉谶@些蛋白上，研究它們在細胞膜上的分布。因為分布的微結構域非常小，所以當 CFP 和 YFP共分布在同一個微結構域時，就可以用 FRET 來觀測到。研究者最初是用激酶 Lyn 的?；蛄屑釉谶@些熒光蛋白上，使 myristoyl和 palmitoyl側鏈鏈接在 CFP 和 YFP的氨基端。結果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的 FRET 信號非常強，用能去除膽固醇而使小窩和脂質(zhì)筏消失的 （5-methyl-cyclodextrin）處理也不能使熒光消失，所以這說明熒光蛋

15、白已經(jīng)非常牢固的結合在了一起。然后研究者用荷電的基團代替熒光蛋白上疏水的基團時，發(fā)現(xiàn)聚體形成被抑制了。3、細胞膜受體之間相互作用外界刺激因素向細胞內(nèi)的信號傳遞一般認為通過其在胞膜上的受體，當配體與受體結 Fas 及其同源物TNFR(均為胞膜上的三聚體受體)的研究發(fā)現(xiàn)：它們都可以在無配體存在的情況下自發(fā)組裝，并介導信號傳遞，引發(fā)細胞凋亡。其中在鑒定 Fas 發(fā)生三聚體化的實驗中使用了FRET 技術：將Fas 分別與CFP與 YFP融合，利用此項技術可以很方便的觀測到 Fas 單體是否發(fā)生聚合。Yogesh Patel等人研究兩種遞質(zhì)多巴胺與抑生長素。發(fā)現(xiàn) SSTR5（the type 5 som

16、atostatinreceptor）與D2R（type 2 dopamine receptor）共同分布在大鼠腦中的一些神經(jīng)元中，他們將兩者共表達，發(fā)現(xiàn)加入多巴胺能的激活劑能增強 SSTR5 與 somatostatin 胺拮抗劑能抑制 SSTR5 D2R 能恢復 SSTR5 突變體與腺苷環(huán)化酶的偶聯(lián)。這不由是人們想到：兩種受體之間是否存在某種聯(lián)系呢？終于，應用 FRET 技術（SSTR5用紅色染料標記，D2R 用綠色染料標記）發(fā)現(xiàn)了兩者之間的直接相互作用。而且當兩受體的配體都存在時才出現(xiàn) FRET，說明兩受體被激活時才發(fā)生相互作用。4、細胞內(nèi)分子之間相互作用Rho 家族的小G 蛋白通過調(diào)節(jié)肌

17、動蛋白的多聚化調(diào)控著重要的生理功能，象其他信號分子一樣，這些GTPase 的效應在時間和空間上都非常集中，那么如何檢測它們活性的時空動力學呢? Klaus Hahn等在 Science 上報道了一種新的技術 FLAIR（fluorescence activationindicator for Rho proteins）可很好的解決這個問題：他們將PAK1的能結合并激活 Rac-GTP的 domain PDB與熒光染料 Alexa GFP與 Rac當 Rac與 PDB相互作用時，GFP 和 Alexa就會足夠接近以致發(fā)生 FRET。這種方法能夠?qū)崟r的檢測到在一個活的細胞中 Rac 的定位改變與Rac 激活之間的關系。Matsuda 等人在 Nature上報道關于細胞內(nèi) Ras和 Rap1 FRET 們將 Ras 和 Raf的 R