1、永川豆豉胰蛋白酶抑制劑的別離純化及其降糖活性研究【關(guān)鍵詞】豆豉；,胰蛋白酶抑制劑；,別離純化；,降糖作用摘要：目的從豆豉中提取胰蛋白酶抑制劑，并討論其降血糖活性。方法以永川豆豉為材料，經(jīng)脫脂，酸性溶液提取，硫酸銨沉淀得到胰蛋白酶抑制劑粗提物，再經(jīng)SephadexG-75凝膠層析得到純化的胰蛋白酶抑制劑，以純化的胰蛋白酶抑制劑給糖尿病小鼠灌胃并觀察其降血糖活性。結(jié)果從豆豉里別離出的胰蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶的抑制率為30%40%；用抑制劑提取液給四氧嘧啶糖尿病模型小鼠連續(xù)灌胃4d，發(fā)現(xiàn)其血糖值明顯低于模型組；觀察小鼠的胰組織病理切片，與糖尿病小鼠比擬，灌胃后的小鼠胰組織明顯得到修復(fù)。結(jié)論豆豉提取液

2、有較明顯的降糖作用。關(guān)鍵詞：豆豉；胰蛋白酶抑制劑；別離純化；降糖作用PurifiatinATrypsinInhibitrfrLbsterSauePrduedinYnghuanandHypglyeiAtinfResearhAbstrat：bjetiveTislateandpurifythetrypsininhibitrfrLbstersaueandinvestigateitshypglyeiatin.ethdsAtrypsininhibitraspurifiedfrthelbstersauefYnghuanbydefatting，extratinithaxidibuffer，preipitati

3、n，hratgraphynSephadexG-75，anditshypglyeiatininieasstudied.ResultsAseriesstudynlbstersaueshedthattheinhibitrhadinhibitinativityfthirtyfrtyperentttrypsin.Inesxalylarbaidedel，thebldgluselevelserereduedafterfurdaystreatedithlbstersaueextratsfYnghuan,parediththedelgrup.nlusinThetrypsininhibitrhashypglyei

4、atin.Keyrds：Lbstersaae；Trypsininhibitr；Islatinandpurifiatin；Hypglyeiatin蛋白酶抑制劑廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，具有抑制蛋白酶的活性的作用，能與相應(yīng)的蛋白酶水解，參與體內(nèi)許多重要生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。其中胰蛋白酶抑制劑具有重要的藥用價(jià)值，對(duì)于急性胰腺炎、肺氣腫、出血性和敗血性休克等疾病有獨(dú)特的療效1。蛋白酶抑制劑被認(rèn)為是植物天然的自我防御體系，是植物抗病基因工程的重要目的基因來(lái)源2。大豆胰蛋白酶抑制劑STI與其它臨床上廣泛應(yīng)用的胰蛋白酶抑制劑具有相似的性質(zhì)，但其生理活性研究還沒(méi)得到足夠的重視。和其他胰蛋白酶抑制劑相比，大豆胰蛋白

5、酶抑制劑具有分子量較孝免疫反響較弱、植物來(lái)源的抑制劑能防止攜帶動(dòng)物病毒、原料來(lái)源廣、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)?shù)玫阶銐虻闹匾暋４蠖挂鹊鞍酌敢种苿┑姆N類有710種，目前研究證明主要有兩種在動(dòng)植物體內(nèi)能抑制胰蛋白酶活力：一種為鮑曼克抑制劑(BBI),是由71個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量為7975，分子內(nèi)有7個(gè)二硫鍵，另一個(gè)為庫(kù)尼茲抑制劑KSTI，分子量約2萬(wàn)，分子內(nèi)有2個(gè)二硫鍵。近年來(lái)國(guó)外報(bào)道發(fā)現(xiàn)低濃度的BBI在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)直腸癌、肝癌等多種癌癥有抑制作用；另有報(bào)道大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對(duì)于糖尿病治療，調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)可能有一定效果3，但未見(jiàn)有降血糖作用的詳盡報(bào)道。因此，對(duì)具有強(qiáng)抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑

6、制劑，從豆豉中別離純化，使其成為抗癌、治療糖尿病及其并發(fā)癥的新藥用于臨床，有非常積極的意義。1儀器與材料DS1高速組織搗碎機(jī)上海標(biāo)本模型廠,KD1042離心機(jī)科大創(chuàng)新股份中佳分公司，722分光光度儀上海精細(xì)科學(xué)儀器，AE240電子天平ETTLER公司；雄性昆明種小鼠體重1822g，永川豆豉(市售咸豆豉)，透析袋，牛胰蛋白酶(1250)、BAPNAHl(購(gòu)自上海維思科貿(mào)),Tris(成都化學(xué)試劑廠消費(fèi))，sephadexG75(上?；瘜W(xué)試劑廠消費(fèi))，四氧嘧啶(Allxan，Siga公司)，葡萄糖試劑盒GLU氧化酶法，液體，北京北化康泰臨床試劑，肝素鈉天津生物化學(xué)制藥廠，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。2

7、方法與結(jié)果2.1豆豉胰蛋白酶抑制劑的別離純化2.1.1豆豉胰蛋白酶抑制劑粗提物的制備大豆胰蛋白酶抑制劑的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由于大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)熱酸環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，一般采用水浸酸提、沉淀再經(jīng)離子交換或凝膠層析純化制得。取2kg永川豆豉，于46恒溫枯燥9h,枯燥后置于干凈托盤(pán)中,把枯燥豆豉粉碎、稱重，然后參加去離子水2L，于0提取15h。15h后于3000r/in離心6in,沉淀?xiàng)壢?搜集上清液。取上清液，參加正己烷正己烷上清液(12)，靜置30in,后用1000l的分液漏斗別離上述混合液,回收正己烷,搜集棕色豆豉提取液。用稀鹽酸20%(v/v)調(diào)豆豉提取液的pH約為

8、4，于55水浴中保溫1h。稱取固體硫酸銨，分次少量參加于水浴的上清液里，使硫酸銨的飽和度為30%，繼續(xù)于55的水浴恒溫15in，離心15in3800r/in，棄去沉淀，留上清液。在上清液里加固體硫酸銨，使硫酸銨的飽和度為55%，55保溫10in，再離心15in，棄去沉淀，搜集上清液。再于上清液里加固體硫酸銨，使硫酸銨溶液的飽和度為70%，55恒溫10in，離心30in12000r/in，棄去上清液，搜集沉淀，用20l磷酸鹽緩沖液pH7.8溶解沉淀,沉淀即為抑制劑粗提物4，于4保存在冰箱里。2.1.2抑制劑粗提物的透析將抑制劑粗提物置于透析袋中蒸餾水充分透析7d，除去鹽分。2.1.3凝膠柱的制備

9、及抑制劑粗提物的純化5取層析柱1660)洗干凈并烘干。稱取12.5gsephadexG75溶解在250l0.05lL-1pH7.8的磷酸緩沖液中，充分混勻后，在100水浴中蒸煮5h，趕走氣泡，將凝膠連續(xù)沿壁緩緩倒入層析柱中，待有2沉淀后，翻開(kāi)柱子下端的出口。穩(wěn)定以后在凝膠的上緣留23緩沖液，并放一個(gè)面積相當(dāng)?shù)臑V紙片，吸出存留緩沖液，參加5l樣品，連上緩沖液，翻開(kāi)出口閥，控制流速在2l/h。流出30l后，用干凈的試管分部搜集23l，檢測(cè)每管的抑制劑活性。2.1.4BAPNA法測(cè)定胰蛋白酶抑制劑活性參考文獻(xiàn)6略加改良，取不同胰蛋白酶抑制劑制備物并與0.2l胰蛋白酶溶液0.1g/l混合，于5lTri

10、sHl緩沖液pH8.0，0.05lL-1中37保溫5in，參加BAPNA2.5l5lL-1，于37恒溫10in，立即參加0.5l33%醋酸溶液終止反響，以不加抑制劑的試樣做對(duì)照，410n處測(cè)定吸光度值。每降低0.1個(gè)A410n為一個(gè)BTI抑制活性單位U。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.圖1豆豉胰蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶的抑制率略由圖1可看到純化過(guò)的豆豉胰蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶的抑制作用是較強(qiáng)的，是一種抑制力較強(qiáng)的抑制劑。2.2抑制劑提取物對(duì)小鼠血糖程度的影響2.2.1實(shí)驗(yàn)性四氧嘧啶糖尿病動(dòng)物模型的建立取雄性昆明種小鼠體重1822g，隨機(jī)分為3組。每組10只，分別為正常對(duì)照組、四氧嘧啶高血糖模型組、抑制劑提

11、取物灌胃組。高血糖模型組及高血糖模型灌胃組禁食10h。按200l/kg的用量，腹腔注射四氧嘧啶。72h后人工斷尾取血，選取空腹血糖值大于11.0lL-1的小鼠作為高血糖模型小鼠。2.2.2豆豉胰蛋白酶抑制劑對(duì)四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖程度的影響高血糖模型灌胃組按每天0.3l/只用量經(jīng)口服灌胃給藥4d。正常組和高血糖模型組每天注射等劑量的生理鹽水。每日觀察小鼠皮毛、活動(dòng)等生長(zhǎng)情況。末次給藥后，所有動(dòng)物禁食10h，按試劑盒方法測(cè)定血糖值。表1豆豉胰蛋白酶抑制劑對(duì)四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖程度的影響略P0.001由表1可見(jiàn)，第1天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型組有所降低，第4天灌胃后的小鼠血糖值比高

12、血糖模型組明顯降低，說(shuō)明豆豉胰蛋白酶抑制劑提取物有較明顯的降血糖作用。2.2.3豆豉胰蛋白酶抑制劑對(duì)胰組織的影響處死小鼠，分別取四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃前后的胰腺組織做病理切片HE染色，顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖23。由圖23可見(jiàn)，四氧嘧啶高血糖模型小鼠胰組織嚴(yán)重病變，灌胃后小鼠胰組織形態(tài)好于四氧嘧啶高血糖模型組織，胰島構(gòu)造較明晰，邊緣與周圍腺胞界限明顯。說(shuō)明豆豉胰蛋白酶抑制劑提取液對(duì)胰島組織有明顯的修復(fù)作用。圖2抑制劑灌胃后小鼠胰組織略圖3四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰組織略3討論據(jù)報(bào)道大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對(duì)于糖尿病治療，調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)有一定效果。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到豆豉胰蛋白酶抑制劑提取液有降低

13、四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的作用。我們尚在本實(shí)驗(yàn)中做了豆豉胰蛋白酶抑制劑對(duì)-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示無(wú)抑制活性作用。提示其降糖機(jī)理可能不是通過(guò)影響胰島素受體后糖代謝的環(huán)節(jié)，而可能是通過(guò)保護(hù)或修復(fù)胰島細(xì)胞及胰島組織促進(jìn)胰島素分泌或釋放起作用的7。可能是豆豉提取液中胰蛋白酶抑制劑對(duì)胰腺產(chǎn)生了一定作用，促進(jìn)胰島素的釋放，從而降低了血液中葡萄糖的濃度，但降糖作用機(jī)理尚有待再進(jìn)一步分析研究。參考文獻(xiàn)：1康莊，王競(jìng)，張年輝，等.菠菜種子胰蛋白酶胰制劑得別離純化與局部性質(zhì)研究J.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2022，172：143.2曾英，蔡玉英，胡金勇，等.波葉青牛膽胰蛋白酶抑制劑的純化及局部性質(zhì)研究J.云南植物研究，2002，241：103.3KennedyAnnR.TheevidenefrsybeanprdutsasanerpreventiveAgentsJ.ThejurnalfNutritin,1995,125：7335.4陳星，劉蕾，劉輝.固定化酶法別離純化大豆胰蛋白酶抑制劑J.食品