1、原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)與融合一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解植物原生質(zhì)體分離、融合基本原理。2、了解并掌握利用PEG原生質(zhì)體融合的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理植物原生質(zhì)體最方便的來源是葉片，因?yàn)槿~片中可以分離出大量 的比較均一的細(xì)胞，而又不致使植物遭到致命的破壞。由于葉肉細(xì)胞 排列疏松，酶的作用很容易達(dá)到細(xì)胞壁。其中酶解法分離原生質(zhì)體是 一個(gè)常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果 膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成 分，除去細(xì)胞壁。許多化學(xué)、物理學(xué)和生物學(xué)方法可誘導(dǎo)原主質(zhì)體融合，現(xiàn)在被廣 泛采用并證明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。PEG為一種高分子化合物，能

2、與水、蛋白質(zhì)、和碳水化合物等一 些基團(tuán)能形成氫鍵。普遍認(rèn)為聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞的膜結(jié) 構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì) 胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而 使細(xì)胞發(fā)生融合。三、實(shí)驗(yàn)用品材料植物葉片(菠菜葉片)儀器倒置顯微鏡，離心機(jī)，過濾篩（100日），漏斗，燒杯，吸管，長注 射針，注射器（510ml）三角瓶、離心管、解剖刀、長、短鑷子、 培養(yǎng)皿、濾紙。試劑纖維素酶2%，果膠酶1% （在0.65mol甘露醇，0.05M氯化鈣和0.1%MES 中，pH 調(diào)至5.66.0），0.16M 氯化鈣溶液（內(nèi)含0.1%MES）Ph5.6, 22%蔗糖溶

3、液，30%聚乙二醇（PEG）溶液，高pH高鈣洗脫液（Ph=9）: 0.1M 氯化鈣、0.1M 梨酶醇、0.5ml/100ml 1molTris，0.24M 氯化鈣四、實(shí)驗(yàn)過程（一）原生質(zhì)體的分離收集取菠菜葉片撕去下表皮，稱0.2g,切成小塊放到10ml酶液中， 在26C下酶解45小時(shí)，或含酶量減半過夜，期間輕輕搖動(dòng)幾次。用100日的過濾篩過濾。用與濾液等體積的0.16mol氯化鈣溶液沖洗過濾篩，使沖洗液 沖入過濾液。濾液用離心機(jī)100300rpm，離心5分鐘，棄上清液。沉淀中加入0.16mol氯化鈣溶液12ml于沉淀，輕搖使之懸 浮，用帶長針頭的注射器自離心管底部輕輕地加入68ml 22%蔗糖

4、溶 液，使之形成界面。靜置待原生質(zhì)體形成一條帶時(shí)棄去上、下液及殘?jiān)梦苁?集原生質(zhì)體。用.0.24Mmol氯化鈣溶液洗滌一次，離心吸取上清液。沉淀中加入12ml.0.16mol氯化鈣溶液懸于沉淀，用血球計(jì) 數(shù)板計(jì)數(shù)，使原生質(zhì)體密度為200000個(gè)/ml。取一滴于載玻片上，低倍鏡觀察原生質(zhì)體的純度和完整性，也 可用熒光顯微鏡檢查。（二）原生質(zhì)體的培養(yǎng)1原生質(zhì)體培養(yǎng)基配方無機(jī)鹽：大量元素濃度；NO -和NH+的比例；Ca2+濃度34有機(jī)成分：維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。激素：NAA、IAA、BA 與2,4-D滲透壓：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生質(zhì)體的滲透壓原則：

5、培養(yǎng)基滲透壓與細(xì)胞滲透壓等滲2原生質(zhì)體培養(yǎng)方法1）液體淺層培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行 培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，對(duì)原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培 養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連 現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè) 細(xì)胞的發(fā)育情況。2）液體一固體雙層培養(yǎng)在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸 浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng) 物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。缺點(diǎn)：不

6、易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程3）固體平板培養(yǎng)即瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點(diǎn)的瓊脂糖可在約30C融化與原 生質(zhì)體混合而不影響原生質(zhì)體的生命活動(dòng)?；旌虾蠛性|(zhì)體 的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：可以跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計(jì)原 生質(zhì)體分裂頻率。缺點(diǎn)：操作要求嚴(yán)格，尤其是混合時(shí)的溫度掌握必需合適， 溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原 生質(zhì)體不易混合均勻。4）瓊脂糖珠培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ul 一滴的 量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng) 基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基 的滲透壓來調(diào)

7、節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。 這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)了原生 質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。（三）原生質(zhì)體融合操作如下圖操作1.取上述原生質(zhì)體液兩滴，間隔5mm滴于載玻片上，靜置10分鐘，使原生質(zhì)體沉淀在載玻片上。2.在兩滴懸液之間加一滴30%聚乙二醇（PEG）溶液，使3滴溶液 相連，室溫下（15C20C）。作用510分鐘，在顯微鏡下觀察原生 質(zhì)體粘連情況。五、實(shí)驗(yàn)記錄兩細(xì)胞融合現(xiàn)象通常分為五個(gè)階段：兩細(xì)胞膜接觸，粘連； 細(xì)胞膜形成穿孔；兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通；通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成 一體；細(xì)胞完全合并，形成一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果用光學(xué)顯微

8、鏡觀察2-3個(gè)細(xì)胞靠近或融合的過程。（觀察時(shí)注意不同 程度的融合現(xiàn)象。通常分為五個(gè)階段。兩細(xì)胞膜接觸，粘連；細(xì) 胞膜形成穿孔；兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通；通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一 體；細(xì)胞完全合并，形成一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。）七、實(shí)驗(yàn)結(jié)論用聚乙二醇作為誘導(dǎo)劑的情況下，兩個(gè)植物細(xì)胞能夠融合，形成 一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。參考文獻(xiàn)邢朝斌，沈海龍，趙星宇，劉巖，黃劍，范少輝.刺五加幼葉原生 質(zhì)體的分離法J.植物生理學(xué)通訊.2006(02)周海霞.滅火原生質(zhì)體融合選育!-ALDC高產(chǎn)菌株(理學(xué)碩士學(xué) 位論文)河北大學(xué)，2004.曹新祥，韓小云.植物組織培養(yǎng)中的pH值J.杭州師范學(xué)院 學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).2003(01)李勇，邢輝，張金芳，王洪利,冀憲領(lǐng)，段祖安.桑樹懸浮細(xì)胞生 長規(guī)律及其生理特性的研究J.蠶業(yè)科學(xué).2007(01)鄭重誼，謝達(dá)平，譚周進(jìn)，等 影響微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)的 因素J.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006 (4)： 35-38$王彥文，黃艷紅，路國兵,王軍妮，牟志美.桑樹葉片愈傷組織的 誘導(dǎo)及不定芽分化影響因素的研究J.蠶業(yè)科學(xué).2006(02) 2003(02)劉偉強(qiáng).桑樹原生質(zhì)體游離與培養(yǎng)J.中國蠶業(yè).2006(02)方文娟，韓烈保，曾會(huì)明.植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響因子研究J. 生物技術(shù)通報(bào).2005(05)張守英，闕國寧.晚松懸浮細(xì)胞系