1、關(guān)于分子生物學常用技術(shù)第1頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四分子生物學常用技術(shù) 凝膠電泳 分子雜交 聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù) DNA的物理圖譜 DNA序列測定 基因芯片第2頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第一節(jié) 凝膠電泳(gel electrophoresis)電泳概念基本原理 Q 6r : 遷移率 Q : 電荷量 r : 粒子半徑（分子量） : 介質(zhì)粘度 第3頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四電泳的用途分離鑒定純度測定分子量凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 第4頁，共130頁，2022年，5月2

2、0日，14點24分，星期四一、瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis) 分離核酸原理 操作要點 應用范圍第5頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（一）分離核酸原理 電荷效應 分子篩效應 分子構(gòu)象第6頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四1. 電荷效應 核酸是兩性電解質(zhì) pH = 3.5 , 正電荷 pH = 8.08.3 , 負電荷，正極第7頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第8頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四2.分子篩效應 小分子移動快 ，大分子移動慢第9頁，共

3、130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四3. 分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋線狀DNA開環(huán)DNA +-第10頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（二）操作要點支持物 凝膠濃度的選擇 DNA分子量標準 電泳緩沖液 樣品制備 電泳條件 DNA電泳染色 DNA片段的回收 第11頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四1. 支持物第12頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四商品化的瓊脂糖第13頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四瓊脂糖種類普通低熔點高純高篩分熔點8090幾十V/cm溫度：1525 第25頁，共1

4、30頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四潛水電泳第26頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四7.電泳染色 溴乙錠(ethidium bromide, EB) 結(jié)構(gòu)及染色原理 染色方法加入凝膠液中 電泳結(jié)束后染色 第27頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四EB染色原理第28頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第29頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四紫外燈下顯色第30頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四8. DNA片段的回收低熔點瓊脂糖法 透析袋電洗脫法(5kb) D

5、EAE-纖維素膜法(0.55kb)第31頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（三）應用范圍 DNA的分離、純化和鑒定 限制性酶切圖譜分析 重組體的分離、鑒定 雜交分析 PCR產(chǎn)物的分離鑒定 第32頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四瓊脂糖凝膠電泳第33頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 分離原理 操作要點 優(yōu)點 應用范圍第34頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（一）分離原理 電荷效應 分子篩

6、效應第35頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四PAGE支持物單體丙烯酰胺(Acr) 交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis) 催化劑過硫酸胺(AP) 加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)第36頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四聚丙烯酰胺凝膠第37頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（二）操作要點凝膠的分類 凝膠濃度的選擇 凝膠液的配制 凝膠中DNA的檢測DNA片段的回收 第38頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四1. 凝膠的分類非變性凝膠：dsDNA變性凝膠: ssDNA尿素甲酰胺SDS第39頁

7、，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四2. 凝膠濃度的選擇第40頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第41頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四3. 凝膠液的配制 試劑(ml)制備濃度(%) 3.5 5.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml第42頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四PAGE裝置第43頁，共1

8、30頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第44頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第45頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第46頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四電 泳第47頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四4. 凝膠中DNA的檢測溴乙錠染色法 銀鹽染色法 甲醛 還原放射自顯影法 Ag+DNA Ag（黑褐色） 第48頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四5.DNA片段的回收壓碎浸泡法 1kb 純度高，回收率低第49頁，共130頁，2022年，5月20日，14點

9、24分，星期四（三）PAGE優(yōu)點機械強度好、化學穩(wěn)定性高分辨率高 載樣量大 回收的DNA純度高 第50頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（四）PAGE應用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR產(chǎn)物鑒定 蛋白質(zhì)的檢測和分析 第51頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第二節(jié) 分子雜交分子雜交的基本原理固相支持物探針幾種常用雜交技術(shù)第52頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四一、分子雜交的基本原理 核酸的變性和復性第53頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四分子雜交DNA-DNA第

10、54頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四DNA-RNA第55頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四雜交條件 靶分子 探針 雜交袋 雜交爐第56頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四雜交種類被檢核酸種類和方法 原位雜交斑點雜交Southern雜交Northern雜交Western雜交 反應介質(zhì) 液相雜交 固相雜交()第57頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四二、固相支持物 固相支持物的特性結(jié)合能力強不影響雜交反應結(jié)合牢固 非特異性吸附少 機械性能良好 第58頁，共130頁，2022年，5月20日，14點2

11、4分，星期四固相支持物的種類 硝酸纖維素濾膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龍膜(nylon membrane)第59頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四1.硝酸纖維素濾膜 特點吸附ssDNA和RNA 雜交信號本底低 不足不適于重復雜交濾膜較脆 不適于電轉(zhuǎn)移印跡法 對DNA小片段(缺口翻譯 操作簡便 DNA/cDNA 探針 第69頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第70頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四DNA的5末端標記(5end labeling) 堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶 標

12、記原理 制備寡核苷酸探針 制備短的DNA/RNA探針 第71頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四DNA的5末端標記第72頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四四、Southern 雜交Southern blotting/DNA blotting1975年，Edwen Southern等印跡(blotting) : 轉(zhuǎn)移 blot: a spot or mark, esp. of ink blotting 第73頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四1. 印跡的方法 毛細管轉(zhuǎn)移法 電轉(zhuǎn)移法 真空轉(zhuǎn)移法 第74頁，共130頁，20

13、22年，5月20日，14點24分，星期四毛細管轉(zhuǎn)移法 第75頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四電轉(zhuǎn)移法第76頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四真空轉(zhuǎn)移法第77頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第78頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四2. Southern 雜交的步驟第79頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四3. Southern 雜交的應用基因的定性及定量分析基因的酶切圖譜分析基因突變分析 RFLP第80頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四五、

14、Northern 雜交 RNA blotting 步驟 總RNA/mRNA變性電泳分離轉(zhuǎn)移雜交放射自顯影/化學顯色 應用檢測組織/細胞中mRNA的大小、量 比較不同組織/細胞中基因的表達情況 第81頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四Northern 雜交第82頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四六、Western 雜交免疫印跡(immunoblotting) SDS轉(zhuǎn)移蛋白第一抗體標記的第二抗體(探針)檢測 應用蛋白質(zhì)的定性定量分析第83頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第84頁，共130頁，2022年，5月20日，1

15、4點24分，星期四免疫印跡第85頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四 Southern,Northern & Western待測物質(zhì) 支持物 探針 轉(zhuǎn)移方式Southern DNANC 單鏈核酸 毛細管/電/真空 Northern RNANC/尼龍 單鏈核酸 毛細管/電/真空 Western 蛋白質(zhì)NC/PVDF 抗體電轉(zhuǎn)移 第86頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四七、原位雜交(in situ hybridization)定義種類細胞內(nèi)原位雜交組織切片原位雜交 基本程序 細胞/組織固定預雜交雜交沖洗 雜交信號檢測 分析結(jié)果 第87頁，共130頁

16、，2022年，5月20日，14點24分，星期四組織切片第88頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第89頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四八、斑點雜交(dot hybridization)第90頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第三節(jié) PCR技術(shù) 聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction, PCR)PCR的發(fā)展簡史PCR的基本原理和步驟PCR的影響因素PCR的種類PCR的應用第91頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四一、PCR的發(fā)展簡史 1971年,Korana提出核酸體

17、外擴增的設想 1985年, Mullis 等發(fā)明了PCR技術(shù) 1988年, PE-Cetus公司推出了第一臺PCR儀 第92頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四二、PCR的基本原理和步驟基本原理DNA復制 三個步驟變性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(extension) 第93頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四PCR的原理第94頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四PCR的擴增產(chǎn)物cycle 12345n長片段 246810短片段 002822長短 21222324252n第95頁，共130

18、頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四標準的PCR反應體系 10X 擴增緩沖液： 10ul 模板DNA: 0.12ug 引物： 各0.21umol/L 4種dNTP: 各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U 總體積： 100ul第96頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第97頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四三、PCR的影響因素 模板 引物 Taq DNA聚合酶 4種dNTP Mg2+ 循環(huán)條件 第98頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四模板 DNA RNAcDN

19、A 對模板的純度要求低第99頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四引物長度：1530nt G+C含量：4060% 堿基的隨機分布 避免引物自身和引物之間的互補 引物的3端 引物的5端 引物濃度：0.21umol/L 第100頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四Taq DNA聚合酶 2.5U/100ul 20保存 最后加 第101頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四底物 4種dNTP 的濃度相等終濃度：200umol/L 第102頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四Mg2+ 濃度: 1.52.0mmol

20、/L 過高: 非特異擴增 過低 : 反應產(chǎn)物減少 第103頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四循環(huán)條件變性溫度和時間: 9096, 3060s 退火溫度和時間: 4060, 3060sTm=4(G+C)+2(A+T) 延伸溫度和時間7075 (72 )1kb, 1min; 34kb , 34min; 10kb,15min循環(huán)次數(shù): 2535 第104頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四四、PCR的種類反轉(zhuǎn)錄PCR原位PCR(in situ PCR)實時PCR(real time PCR)重組PCR(recombinant PCR)錨定PCR(an

21、chored PCR)反向PCR(inverse PCR)第105頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四原位PCR原位雜交PCR程序 固定細胞/組織樣品PCR前處理PCR擴增原位雜交及檢測 第106頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四實時PCR的原理第107頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四五、PCR的應用分子生物學研究臨床醫(yī)學第108頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四分子生物學研究基因克隆 DNA序列測定基因的體外定點突變 突變分析(PCR-SSCP) 基因定量 第109頁，共130頁，2022

22、年，5月20日，14點24分，星期四臨床醫(yī)學病原體診斷 遺傳病的基因診斷 腫瘤檢測 法醫(yī)學 第110頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第四節(jié) DNA序列測定 Sanger 雙脫氧鏈終止法(1977) Maxam-Gilbert化學裂解法(1977) 第111頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四Sanger 雙脫氧鏈終止法 原理DNA復制 反應條件 模板引物 dNTP（其中一種帶放射性標記） ddNTP DNA聚合酶第112頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四DNA的復制第113頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四2,3-雙脫氧核苷酸(ddNTP)第114頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第115頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第116頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四DNA測序操作第117頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四DNA自動測序 第118頁，共130頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四DNA自動測序儀第119頁，共130頁，2022年，5月20日，