1、2022/10/9第7章 色譜分離技術(shù)第1節(jié) 色譜技術(shù)基礎(chǔ)第2節(jié) 吸附色譜第3節(jié) 離子交換色譜第4節(jié) 凝膠色譜本章重點(diǎn)：色譜分離的基本原理色譜分類及相關(guān)概念常用色譜分離技術(shù)的基本操作2022/10/9第1節(jié) 色譜分離技術(shù)基礎(chǔ)一、色譜技術(shù)的基本概念與基本原理概念：色譜技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱，色譜柱均含有固定相和流動(dòng)相，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同，經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），不同物質(zhì)在流動(dòng)相與固定相中的分配不同而遷移速率不同，從而達(dá)到分離的目的。固定相：在色譜分離中固定不動(dòng)、對(duì)樣品產(chǎn)生保留的一相。 流動(dòng)相：與固定相處于平衡狀態(tài)、帶動(dòng)樣品向前移動(dòng)的一相 2022/10/9色譜分

2、離技術(shù)的特點(diǎn)特點(diǎn)：（1） 純化倍數(shù)高（2） 操作規(guī)模小，放大困難（3）終產(chǎn)品純化（4） 操作成本高、適用于價(jià)格昂貴的產(chǎn)品2022/10/9色譜分離的基本原理任何色譜分離過程實(shí)質(zhì)上都是溶質(zhì)隨流動(dòng)相流動(dòng)而遷移的過程，不同溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中的分配比例不同，因而隨流動(dòng)相遷移的速度不同，從而使不同物質(zhì)分離開來。2022/10/95洗脫曲線2022/10/9二、色譜的分類根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理不同的分類凝膠過濾法分配色譜法離子交換色譜分離法吸附色譜法疏水作用色譜分離法金屬螯合色譜分離法共價(jià)作用色譜分離法物理吸附色譜分離法2022/10/9二、色譜的分類根據(jù)固定相的填充形式不同的分類： 柱層

3、析法薄層層析法2022/10/9三、色譜系統(tǒng)的基本組成2022/10/92022/10/9第2節(jié) 吸附色譜一、吸附色譜的原理吸附色譜是以吸附劑為固定相，洗脫液為流動(dòng)相的色譜分離操作?；旌衔镏胁煌奈镔|(zhì)極性不同而使得吸附劑對(duì)其吸附的強(qiáng)度不同，極性不同的物質(zhì)在固定相（吸附劑）和流動(dòng)相（洗脫劑）分布不同，所以洗脫時(shí)遷移速率不同而實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物的分離。2022/10/9第2節(jié) 吸附色譜二、吸附色譜填料2.氧化鋁氧化鋁有酸性、中性及堿性氧化鋁分別適合在酸性、中性、堿性條件下使用。氧化鋁是極性吸附劑，其活性與含水量有關(guān)，含水量大則活性低，氧化鋁層析劑一般是在400處理一段時(shí)間失水形成的。2022/10/9第

4、2節(jié) 吸附色譜二、吸附色譜填料3.大孔樹脂大孔樹脂是一類人工合成的聚合物吸附劑，分為強(qiáng)極性、中等極性和弱極性樹脂，一般弱極性和中等極性樹脂用得較多；大孔樹脂特點(diǎn)：解吸附容易、選擇性好、耐用、適用廣泛。2022/10/9第2節(jié) 吸附色譜三、吸附色譜操作吸附柱色譜（硅膠）層析劑預(yù)處理：濃鹽酸浸泡硅膠612小時(shí)，然后用蒸餾水洗滌硅膠34次，將起進(jìn)行減壓抽濾，后不斷加蒸餾水沖洗。在1小時(shí)之后，抽濾的水呈中性，晾干后，在110烘箱中活化2小時(shí)。 2022/10/9第2節(jié) 吸附色譜三、吸附色譜操作吸附柱色譜（硅膠）裝柱：將處理好的硅膠用適當(dāng)溶劑攪拌均勻，一次性裝入層析柱。（柱上端平整、均勻、嚴(yán)實(shí)、無氣泡）

5、 平衡：用洗脫溶劑洗至基線平穩(wěn)上樣：洗脫：同薄層展開劑2022/10/9第3節(jié) 離子交換色譜一、離子交換概述離子交換過程的本質(zhì)及選擇性 離子交換是離子交換劑上的反離子電離至水溶液中而溶液中其他與固定電荷帶有相反電荷的離子通過靜電吸引力而被吸附在固定電荷，其本質(zhì)上是一個(gè)可逆化學(xué)反應(yīng)（平衡反應(yīng)）。不同離子交換反應(yīng)平衡常數(shù)不同，因而荷點(diǎn)溶質(zhì)分配在離子交換劑與水溶液中的比例不同2022/10/9第3節(jié) 離子交換色譜一、離子交換概述影響離子交換選擇性的因素 （1） 離子電荷數(shù)（化合價(jià)） （2） 離子水合半徑 （3） 離子電荷強(qiáng)弱2022/10/9第3節(jié) 離子交換色譜二、離子交換色譜原理離子交換色譜是以離

6、子交換劑為固定相，洗脫液為流動(dòng)相的色譜分離操作，由于不同物質(zhì)電荷性質(zhì)、數(shù)量、強(qiáng)弱等不同，因而與離子交換劑的固定電荷靜電吸引力不同，使得其在固定相、流動(dòng)相分配不同，因此遷移速率不同而實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物的分離。 2022/10/9第3節(jié) 離子交換色譜三、離子交換色譜操作離子交換劑預(yù)處理陰離子交換劑：酸堿酸 或 堿酸 陽離子交換劑：堿酸堿 或 酸堿 對(duì)于疏水載體骨架構(gòu)成的離子交換劑應(yīng)先用乙醇浸泡，再用水稀，然后再采用相應(yīng)的酸堿處理裝柱、上樣、洗脫基本與吸附色譜相同。2022/10/9第4節(jié) 凝膠色譜二、凝膠色譜的用途：蛋白純化、脫鹽、去除小分子優(yōu)點(diǎn)：操作方便、分離迅速、不影響生物活性三、層析劑葡聚糖凝膠：sephadex G-10/50/75/100/200瓊脂糖凝膠：sepharose (CL)2B/4B/6B聚丙烯酰胺凝膠：Bio-Gel P-2/4/6/10/30選擇凝膠主要注意其分離范圍2022/10/9第4節(jié) 凝膠色譜四、凝膠色譜操作凝膠預(yù)處理 稱取適量的凝膠加入過量