1、第三節(jié) 核酸的性質(zhì)一、核酸的水解二、核酸的酸堿性質(zhì)三、核酸的紫外吸收性質(zhì)四、變性、復(fù)性與雜交第三節(jié) 核酸的性質(zhì)1 酸水解堿水解酶水解一、核酸的水解核酸分子中的糖苷鍵磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解 1 酸水解一、核酸的水解核酸分子中的糖苷鍵磷酸二酯鍵可在生物化第一章后半-課件 1 酸水解 糖苷鍵和磷酸鍵都能被酸水解,糖苷鍵比磷酸鍵更容易 嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶的對(duì)酸更不穩(wěn)定,最不穩(wěn)定是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵二、核酸的水解 1 酸水解二、核酸的水解 2 堿水解 DNA和RNA對(duì)堿的耐受程度有很大差別。二、核酸的水解 2 堿水解二、核酸的水解 2 堿水解 DNA和RNA對(duì)堿的耐受程度有很大差別。

2、室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解。 例如，室溫條件下，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解；DNA在同樣條件下則不受影響。二、核酸的水解 2 堿水解二、核酸的水解 二、核酸的水解 3 酶水解 磷酸二酯酶:非特異水解磷酸二酯鍵 核酸酶:特異水解核酸的磷酸二酯鍵 按底物分類:脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶 按底物作用的方式:核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶二、核酸的水解 3 酶水解 雙鏈DNA分子可以被上千種從微生物中分離得到的限制性內(nèi)切酶切斷, 又可以再連接起來(lái)。切斷的過(guò)程不需要能量，而連接的起來(lái)的過(guò)程卻需要2個(gè)分子的ATP。這就是分子克隆和DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)。DN

3、A與限制性內(nèi)切酶 雙鏈DNA分子可以被上千種從微生物中分離得到的限制性大部分限制性內(nèi)切酶識(shí)別的堿基序列為4 6 個(gè)堿基的palindrome 順序。它們?cè)谖⑸锛?xì)胞內(nèi)發(fā)揮的是防御外來(lái)DNA入侵的國(guó)防軍的作用。大部分限制性內(nèi)切酶識(shí)別的堿基序列為4 6 個(gè)堿基的pali二、核酸的酸堿性質(zhì)堿基核苷核苷酸二、核酸的酸堿性質(zhì)堿基生物化第一章后半-課件堿基adenine 4.15, 9.8cytosine 4.5, 12.2guanine 3.2, 9.6thymine 9.9, 13核苷adenosine 3.5, 12.5 deoxyadenosine 3.8cytidine 4.15, 12.5 d

4、eoxycytidine 4.3, 13guanosine 1.6, 9.2 deoxyguanosine 2.5uridine 9.2, 12.5 deoxythymidine 9.8, 13核苷酸AMP 3.7, 6.1 : dAMP 4.4ADP 3.9, 6.3 : -CMP 4.5, 6.3 : dCMP 4.6GMP 2.4, 6.1, 9.4 : dGMP 2.9, 9.7UMP 6.4, 9.5 : dTMP 10.0堿基核苷核苷酸堿基堿基單核苷酸中, 磷酸酯鍵中的磷酸基有二個(gè)解離常數(shù)單核苷酸中, 磷酸酯鍵中的磷酸基有二個(gè)解離常數(shù)多核苷酸中,除了末端一個(gè)磷酸基外, 磷酸二酯鍵中

5、的磷酸基只有一個(gè)解離常數(shù)多核苷酸中,除了末端一個(gè)磷酸基外, 磷酸二酯鍵中的磷酸基只有核苷酸等電點(diǎn) 帶負(fù)電荷核苷酸等電點(diǎn)二、核酸的酸堿性質(zhì)核酸含酸性的磷酸基團(tuán)，又含弱堿性的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離，核酸的等電點(diǎn)比較低（DNA的等電點(diǎn)為4-4.5，RNA的等電點(diǎn)為2-2.5(低)。（核酸在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最?。┖怂嵯喈?dāng)于多元酸，pH大時(shí)，呈陰離子狀態(tài)；-向陽(yáng)極遷移二、核酸的酸堿性質(zhì)核酸含酸性的磷酸基團(tuán)，又含弱堿性的堿基，為天然DNA與變性DNA的滴定曲線是不同的,雙鏈解開(kāi)后堿基即參與酸堿滴定天然DNA與變性DNA的滴定曲線是不同的,雙鏈解開(kāi)后堿基即參 在核酸在260 nm附近有最大吸收峰

6、；據(jù)此特性可以定性和定量檢測(cè)核酸。蛋白質(zhì)在280 nm有一定的吸收峰，因此利用D260/OD280比值可判斷核酸樣品的純度。四、紫外吸收 在核酸在260 nm附近有最大吸收峰；據(jù)此特性可以定性生物化第一章后半-課件生物化第一章后半-課件 增色效應(yīng)：天然DNA分子從雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)閱捂湢顟B(tài)時(shí)，它在在紫外光260nm波長(zhǎng)處的吸收值明顯增加，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。 增色效應(yīng)：天然DNA分子從雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)閱捂湢顟B(tài)時(shí)，RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒(méi)有DNA那樣明顯。天然狀態(tài)的DNA在完全變性后，紫外吸收(260 nm)值增加2540%.而RNA變性后，約增加1.1%。RNA本

7、身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒(méi)減色效應(yīng)：核酸的在260nm的光吸收值通常比各核苷酸成分的光吸收之和少30%-40%，這是有規(guī)律的雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基緊密堆積到一起造成的，此現(xiàn)象稱為DNA減色效應(yīng)。減色效應(yīng)：核酸的在260nm的光吸收值通常比各核苷酸成分的光生物化第一章后半-課件* 四、變性、復(fù)性與雜交* 四、變性、復(fù)性與雜交 是指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，變成無(wú)規(guī)則線團(tuán)的現(xiàn)象。核酸變性其分子中的共價(jià)鍵并沒(méi)有破壞，分子量也不改變，核酸的變性（ denaturation ）(一)DNA的變性 是指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，變成無(wú)規(guī)則線團(tuán)生物化第一章后半-課件D

8、NA的變性的因素 溫度升高；酸堿度改變、 pH（11.3或5.0）；有機(jī)溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；各種射線低離子濃度 DNA的變性的因素 溫度升高；A260值增加粘度下降分子量不變DNA變性后的表現(xiàn)A260值增加DNA變性后的表現(xiàn) DNA熱變性發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過(guò)程中光吸收達(dá)到最大吸收（完全變性）一半（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半）時(shí)的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)或熔解溫度DNA的一個(gè)重要參數(shù)-熔解溫度（Melting Temperature,Tm）：（一般DNA的Tm值在82-95C之間） DNA的一個(gè)重要參數(shù)-熔解溫度（Melting Temp 影響Tm 的因素： 核酸的均一程度，

9、均一性越高的樣品，變性過(guò)程的溫度范圍越小。 Tm與G-C含量成正比。 （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44）-特定的條件下 Tm與介質(zhì)離子強(qiáng)度,成正比。 G-C含量與Tm的關(guān)系G-C含量與Tm的關(guān)系生物化第一章后半-課件變性試劑可以使Tm變低變性試劑可以使Tm變低(二)DNA的復(fù)性變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性；(二)DNA的復(fù)性變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單影響DNA的復(fù)性的因素分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。DNA的復(fù)性需要一定的鹽濃度，增加鹽濃度，復(fù)性速度加快T1/2 Co const影響DNA的復(fù)性的

10、因素T1/2 Co const將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。即淬火。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性，這一過(guò)程也叫退火（annealing) 退火溫度Tm25將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。即淬火。（三）、分子雜交 熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。 DNA單鏈與互補(bǔ)的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。（三）、分子雜交 熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與生物化第一章后半-課件生物化第一章后半-課件Southern B

11、lot：DNA-DNA雜交Northern Blot：DNA-RNA雜交 PCR技術(shù)核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。Southern Blot：DNA-DNA雜交核酸的雜交在分分子雜交的種類Southern Blot：DNA-DNA雜交Northern Blot：DNA-RNA雜交Western Blot：抗原-抗體進(jìn)行雜交原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯出熒光分子雜交的種類Southern Blot：DNA-DNA雜交 第一節(jié) 核酸通論 第二節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu) 第三節(jié) 核酸的物理化學(xué)性質(zhì) 第四節(jié) 核酸的研究方法 第一節(jié) 核酸通論第四節(jié) 核酸的研究方法 一 核酸的分離、提純和定

12、量測(cè)定 二 核酸的超速離心 三 核酸的凝膠電泳 四 核酸的序列測(cè)定第四節(jié) 核酸的研究方法第四節(jié) 核酸的研究方法 一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定 (一)DNA的分離 （二）RNA的分離 (三) 核酸定量測(cè)定第四節(jié) 核酸的研究方法DNA和RNA在細(xì)胞中常以核蛋白形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液中的溶解度不同。 DNA核蛋白 RNA核蛋白0.14mol/L NaCl - + 1-2mol/L NaCl + -(一) DNA的提純和純化DNA和RNA在細(xì)胞中常以核蛋白形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液目前分離DNA方法： 鹽抽提，用苯酚和氯仿去蛋白 SDS/CTAB 氯化銫密度梯度離心目前分離DNA方法：注意：

13、用高溫（180度）或DEPC處理 加入RNasin(二) RNA 的提純和純化注意：用高溫（180度）或DEPC處理(二) RNA 的提純DNA和RNA在細(xì)胞中常以核蛋白形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液中的溶解度不同。 DNA核蛋白 RNA核蛋白0.14mol/L NaCl - + 1-2mol/L NaCl + -DNA和RNA在細(xì)胞中常以核蛋白形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液(三) 定量測(cè)定 紫外分光光度法- 定磷法 定糖法 (三) 定量測(cè)定定磷法: 磷含量相對(duì)恒定, (RNA9.4%; DNA 9.9%) 有機(jī)磷 水解成無(wú)機(jī)磷用濃硫酸或過(guò)氯酸磷酸+鉬酸 磷鉬酸酸性條件還原劑鉬藍(lán)660nm光密度與

14、磷含量成正比定磷法: 磷含量相對(duì)恒定, (RNA9.4%; DNA 9.定糖法 (核酸含糖) 糠醛+甲基苯二酚(地衣酚)鮮綠色(最大670nm)RNA +鹽酸加熱糠醛FeCl3催化劑DNA(在酸性溶液中)+二苯胺加熱藍(lán)色化合物 (最大595nm)定糖法 (核酸含糖)糠醛+甲基苯二酚(地衣酚)鮮綠色(最大6第四節(jié) 核酸的研究方法 一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定 二 核酸的超速離心 三 核酸的凝膠電泳 四 核酸的序列測(cè)定 第四節(jié) 核酸的研究方法超速離心可以分離超螺旋DNA（密度大） ,線性DNA（密度?。┖烷]環(huán)DNA（密度居中）。也可以分離RNA。-最常用的是分離真核生物的染色體DNA與線粒體葉綠

15、體DNA分開(kāi);超速離心 沉降速度沉降常數(shù) S 密度梯度超速離心可以分離超螺旋DNA（密度大） ,線性DNA（密度小三 核酸的凝膠電泳 A：瓊脂糖凝膠電泳 B：聚丙烯酰胺凝膠電泳 三 核酸的凝膠電泳通常，瓊脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺 (polyacrylamide)凝膠被用于核酸的分離研究、鑒定和純化DNA分子。也可以用于蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。通常，瓊脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺 (polyacr瓊脂糖從紅色海藻瓊脂中提取的良好電泳介質(zhì)，是D-和L-半乳糖殘基通過(guò)和糖苷鍵交替構(gòu)成的一種線狀聚合物，瓊脂糖凝膠可以構(gòu)成一個(gè)直徑從50nm到略大于200nm的三維篩孔的通道。其密度由

16、瓊脂糖的濃度決定。A：瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖從紅色海藻瓊脂中提取的良好電泳介質(zhì)，是D-和L-半乳糖A 瓊脂糖凝膠電泳 以瓊脂糖為支持物 操作簡(jiǎn)單、快速，且分離范圍廣 A 瓊脂糖凝膠電泳 以瓊脂糖為支持物DNA在瓊脂糖凝膠的遷移速度 1、核酸分子本身的大小：同分子的摩擦 系數(shù)成反比的2、瓊脂糖的濃度：遷移率與膠濃度成反比3、DNA的構(gòu)型：超螺旋（I）、環(huán)狀（II）、 線狀（III）4、所用的電壓 一般不大于5V/cm,一定范圍 內(nèi)呈正比5、電泳緩沖液DNA在瓊脂糖凝膠的遷移速度 1、核酸分子本身的大?。和肿?溴化乙錠(ethidiumbromide，簡(jiǎn)稱EB)是一種核酸染料，可以插入到DNA或R

17、NA分子的堿基之間，并在260nm波長(zhǎng)的紫外光照射下放射出橘紅色的熒光，可用來(lái)顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。在凝膠電泳中，溴化乙錠染料可對(duì)核酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA譜帶。安全警示：EB是一種強(qiáng)的DNA誘變劑，使用時(shí)盡量避免觸及皮膚。電泳時(shí)有時(shí)使用到較高的電壓，要小心觸電。DNA的凝膠電泳檢測(cè) 溴化乙錠(ethidiumbromDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) +-儀器 電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、移液槍；藥品 Agarose、 loading buffer、 TBE buffer、 EB（溴化乙錠）;上樣緩沖液（6X）配方 0.25% 溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯氰醇

18、、 40%蔗糖；水溶液4保存。DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) +-儀器 電泳儀、電泳槽、PCR擴(kuò)增結(jié)果分析舉例 M 1 2 3 4 5 6 7 MM, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive control.PCR擴(kuò)增結(jié)果分析舉例 M 1 2聚丙烯酰胺凝膠：在由TEMED (N、N、N、N-四甲基乙二胺)催化過(guò)硫酸胺還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線形長(zhǎng)鏈，在交聯(lián)劑N，N-亞甲雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)

19、中，聚丙烯酰胺的交聯(lián)鏈形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，鏈長(zhǎng)和交聯(lián)的程度就決定了凝膠的孔徑，同時(shí)也決定了分離DNA的能力。B 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠：在由TEMED (N、N、N、N-四甲基瓊脂糖凝膠制膠一般將EB直接加入而聚丙烯酰胺凝膠制膠時(shí)不能將染料加入，會(huì)影響聚合。1000bp瓊脂糖凝膠制膠一般將EB直接加入生物化第一章后半-課件1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2DAP 6DAP 12DAP1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5第四節(jié) 核酸的研究方法 一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定 二 核酸的超速離心 三 核酸的凝膠電泳 四 核酸的序列測(cè)定 第四節(jié) 核酸的研究方