1、專家論著分子結(jié)構(gòu)與免疫定量分析上海第二醫(yī)科大學(xué)瑞金醫(yī)院盧灣分院南洋放免中心許叔祥教授是婦女妊娠和滋養(yǎng)葉細胞疾病（良、惡性葡萄胎，絨毛膜上皮癌）等診斷、療效隨訪，必不可少的檢測指標，也是婦女生殖激素中測定最多的項目。以往都使用放射免疫法（）測定，自從九十年代開始，由于各種非放免標記免疫技術(shù)的發(fā)展和相應(yīng)自動化儀器的誕生，逐漸替代了方法。在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)兩大問題：（）測定的結(jié)果與現(xiàn)用非放免標記免疫（熒光、發(fā)光、時間分辨熒光等）不相符；（2）診斷妊娠的標準不一致，引起不少實驗室人員和臨床醫(yī)生的費解和不適應(yīng)。實際上這是一次免疫分析技術(shù)的質(zhì)的飛躍，必須深刻的理解和接受。本文擬以從的分子結(jié)構(gòu)和免疫定量分析技

2、術(shù)的發(fā)展來討論這一重要問題。、的分子結(jié)構(gòu)和代謝絨毛膜促性腺激素（）是胎盤合體滋養(yǎng)層細胞所分泌的一種糖蛋白激素，它的主要功能是維持黃體及降低母體淋巴細胞的活動，防止對胎兒的排斥反應(yīng)。其分子量為0由個氨基酸組成，其分子包括aB兩個鏈（亞單位），a鏈分子量為0由個氨基酸組成；B鏈分子量為，由個氨基酸組成。其中a鏈的組成與垂體激素、基本相同；而B鏈其羧酸端的最末個氨基酸與垂體激素不同，為其所獨有。從上可見在免疫分析中，倘若所用抗體與a鏈的位點有結(jié)合，便可能與如上垂體激素，特別是發(fā)生交叉結(jié)合而影響檢測的正確性。反之如能選用專與B鏈特異末端位點結(jié)合的抗體，則可避免與垂體激素的交叉反應(yīng)?？梢蜃甜B(yǎng)層中巨噬細胞

3、分泌的酶降解，使B鏈中第7位氨基酸間裂開，成為裂口分子（，）此酶也可使aB鏈解離，成為游離片段（a和B或B而的最終代謝產(chǎn)物是B鏈的一個分子量僅為的雙鏈多肽核心片段B?？梢娫谘湍蛞褐写嬖谥煌问降牧N分子，但真正有生物活性的僅只一種，即無裂口的整分子（）,只有的活性，而其余分子完全沒有活性。URINEBLOODTllxinicta:hCC圖i的分子及代謝-w不足卜所以測定沒有價值岳在滋養(yǎng)細胞疾病及唐氏癥發(fā)生時,吏血液中、|1U|G胃常升高。正由于裂解常升高，使血液從上可見，要觀察婦女正常的生理妊娠必須測定有生理定代謝片段是沒有意義的。URINEBLOODTllxinicta:hCC時，用速率

4、增高指標不能區(qū)分正常與異常妊娠，可用陰道超聲診斷，不見妊娠囊提示宮外孕。受個體差異的影響，至今尚無排除的絕對最低值，一般可以為參考最低值，因為畢竟極少存在有不分泌的不正常滋養(yǎng)層，所以宮外孕的診斷或排除必須根據(jù)臨床癥狀和實驗資料綜合慎重分析，并用同一方法測定。多篇文獻提示：宮外孕的診斷必須結(jié)合臨床和多種實驗診斷的客觀指標綜合分析，不可能僅憑一項指標作出診斷。、定量檢測對滋養(yǎng)層疾病的診斷與跟蹤的臨床意義臨床上引起增加最明顯的情況見于絨毛膜組織腫瘤患者。此種滋養(yǎng)層細胞源性腫瘤分泌的與妊娠時正常胎盤所合成的相同。正常妊娠頭三個月后，水平不再繼續(xù)增加，跌落到一個較平坦的水平。然而在滋養(yǎng)層細胞瘤患者中，水

5、平可隨瘤的發(fā)展而繼續(xù)升高。血清或尿達而腹部超聲探測無胎心，則強烈提示胎塊妊娠，如卵巢腫瘤、絨毛膜上皮癌、葡萄胎等。定量檢測可用于以上疾病的療效觀測及預(yù)后判斷：外科切除腫塊后，前三周每周測血清或尿C直至恢復(fù)到正常水平，以后一年內(nèi)逐月監(jiān)測，有助于判斷是否復(fù)發(fā)。術(shù)后周水平明顯下跌，如果水平維持在一定的水平或有所上升，應(yīng)該考慮是否有轉(zhuǎn)移性或持續(xù)性疾病。定量可作為妊娠殘留物存在的輔助診斷指標，在胎塊切除、自發(fā)性或誘導(dǎo)性流產(chǎn)、宮外孕手術(shù)治療后，定量監(jiān)測有助于證實滋養(yǎng)層組織的完全清除。消除速率個體差異很大，一般術(shù)后第一天可跌落約1/，2以后數(shù)天中跌落1/，2數(shù)周后可回復(fù)到正常水平。、定量檢測可作為腫瘤標志物

6、的應(yīng)用定量有助于監(jiān)測卵巢胚細胞瘤的治療效果。由于個體差異的關(guān)系，應(yīng)注意測定治療前的值作為基準，與治療后的值相比較，是增加還是減低來判斷療效。定量在診斷或跟蹤絨毛癌上十分有用，大于與不良預(yù)后相聯(lián)系。精原細胞瘤病人的血清或尿水平如高于正常情況提示預(yù)后差，化療劑量應(yīng)提高。非精原細胞瘤占睪丸胚細胞腫瘤的0其和水平均增高。在膀胱癌患者，其水平升高意味著疾病的進展和放射治療的無效。、氏綜合癥氏綜合癥（）死亡率很高，發(fā)生率8隨生育年齡增加顯著升高，但實際上的發(fā)生在歲以上的孕婦。唯一的確診實驗是羊膜穿刺染色體檢查，但是對歲以上孕婦穿刺引發(fā)健康胎兒流產(chǎn)的危險性與發(fā)生率幾乎相當?；嫉娜焉飲D女血清水平比正常平均低5

7、,而對影響最大，血清水平可比正常情況高兩倍，但與正常妊娠間有相當大程度的重疊。妊娠婦女在胎齡周（超生確診）時可定量其血清水平，再按孕婦年齡等計算其危險指數(shù)，超標者再推薦做羊膜穿刺。定量檢測中有關(guān)學(xué)術(shù)問題的交流、現(xiàn)行測定的方法學(xué)中，正常值和臨床診斷值有時不完全相同的原因分析由于各種試劑盒所測的目標不同，所以正常值、臨床診斷值也發(fā)生相應(yīng)變化。正如前面所述的在血和尿液中存在著不同形式的六種分子，所以應(yīng)首先了解該試劑盒檢測的到底是什么分子？整分子、亞基、還是游離片段。例如游離的B增高見于滋養(yǎng)葉細胞癌、唐氏癥、睪丸癌等輔助診斷，不同于妊娠診斷。所以首先要選對試劑盒，同樣測定對象才有可比性，下面會較詳細介

8、紹、G+總試劑盒表達的意思和相互關(guān)系。、常用的名稱和它們之間的關(guān)系目前試劑盒習(xí)慣稱為完整（t總或G等,稱呼上還沒有達到（美國國立臨床實驗室標準化委員會）標準稱呼的要求。免疫化驗較清楚的稱呼可以是：僅測無裂痕一僅僅具有激素功能的（相當于生物效價）無裂痕游離B有激素功能游離B有裂痕和無裂痕總的有裂痕和無裂痕游離B總的游離B等等的量是極低的，所占百分比i所以在妊娠游離B等等的量是極低的，所占百分比i所以在妊娠定量中沒有任何理由專門檢測游離的Bc除非廠方使用二個針對B亞基的單抗去檢測總的時，同時也將游離B亞基也測定在內(nèi)，但游離B亞基對總值沒有多大影響。以上摘譯于及它的游離亞基免疫化驗和代謝即時檢驗快速

9、定量檢測的是總的C它與總的B,B等試劑盒應(yīng)有可比性。、常用報告單位正常參考值及單位間的換算目前存在的幾種報告模式：（）、（毫國際單位毫升）：毫國際單位毫升的報告方式，目前比較常用的一種報告單位。正常參考值：絕大多數(shù)非妊娠婦女血液或尿中的小于，大于等于妊娠陽性。孕期周，周，周，周在妊娠周內(nèi)，妊娠的不同天數(shù)以極快的速度增高。（）、（國際單位升）：妊娠判斷值、正常參考范圍等與相同，只是表達數(shù)量級的不同而已。（）、（微克升）以重量單位作為結(jié)果表達目前已經(jīng)很少用，同樣重量的因其純度不同，免疫活性也隨之不同。因此如用（或/表達水平，必須證明在你的實驗測定中的每含多少國際單位。用表達結(jié)果的試劑盒必須在說明書

10、中注明，在該試劑盒中每相當于多少國際單位。、血清和尿液定量檢測的關(guān)系和特性同一個人在同一時刻的尿與血清的檢測，雖然是二種截然不同的樣品，但其定量結(jié)果之間有很好的一致性，相關(guān)系數(shù)丫,血清濃度在大部分情況下比尿濃度略高；尿液樣品比血清采集容易，深受孕婦歡迎。一般都能滿足臨床需要。由于尿液受飲水量多少等因素的影響，結(jié)果可能有波動。因此血清定量比尿液準確性更好。、定量測試系統(tǒng)和定性妊娠實驗在試劑上的區(qū)別定性妊娠試驗層析法紙條上的干燥膠體金單抗綴合物絕大部分不是由冷凍干燥技術(shù)制備，也不能在高度真空環(huán)境下包裝、運輸、儲存。在儲存、運送過程中難免活性跌落而影響敏感度。膠體金試劑采用先進的凍干保存技術(shù)，能保證

11、凍干膠體金單抗綴合物穩(wěn)定期長達一年以上，復(fù)溶以后也能保證30天的穩(wěn)定。反應(yīng)板的膜選用最好的進口硝酸纖維素膜，吸水材料的滲濾流速也有嚴格的篩選，有最好的顯色準確性。、測試時應(yīng)主意哪些主要問題空白板校準及標本板測試時，傳感器測量頭的部位必須與檢測板孔的位置對準并緊貼板孔防止漏光。操作時按傳感器時應(yīng)用力一致，恰倒好處，初次操作者測定前可多做幾次對準位置、緊貼板孔的練習(xí)，同一板數(shù)次測定，其結(jié)果應(yīng)基本相同，防止人為造成測定結(jié)果值的偏差。據(jù)觀察，發(fā)生測定結(jié)果二次數(shù)據(jù)相差很大，超出技術(shù)指標大都由于傳感器測量頭部未與檢測板孔未緊密對準。造成部分漏光所致。這是引起二次結(jié)果誤差最常見的原因，應(yīng)特別引起注意。有時會

12、出現(xiàn)層析法呈可疑或陰性，而結(jié)果2,此時只要反應(yīng)膜正中有紅色斑點，其結(jié)果不會有誤。試劑和標本從冰箱取出后不能馬上測定，必須在室溫中平衡半小時后再行測定。參與反應(yīng)的試劑和樣品溫度過低必然會影響反應(yīng)結(jié)果，使結(jié)果偏低，影響結(jié)果正確性。尿液標本必須用試劑盒配套的濾紙過濾。高值稀釋測定時，尿液可用生理鹽水稀釋，血清可用健康男性血清或小牛血清稀釋，也可用附在試劑盒中的血清樣品稀釋液稀釋血清樣品。、隨妊娠周數(shù)的增加的濃度快速增高，妊娠周數(shù)應(yīng)如何計算卵子受精是妊娠的開始。由于卵子受精的日期無法準確確定，習(xí)慣上妊娠時間有幾種表達方法：以上次月經(jīng)的第一天作為妊娠的開始；經(jīng)期過期日即按妊娠第二周計算。因排卵日不一定在

13、二次月經(jīng)的正中，每個人月經(jīng)周期的天數(shù)也有很大的不同，有很大的個體差異，在此階段的上升又是高度快速，所以與妊娠周數(shù)對應(yīng)的濃度有較大的變化范圍，因此絕大部分情況下，對定量測定的精度要求過高是完全不必要的。如低于對應(yīng)范圍的低值必須考慮有不正常妊娠的可能，如可能自發(fā)性流產(chǎn)等，此時測定二天后濃度有無顯著上升尤為重要。、曾發(fā)現(xiàn)病人月經(jīng)過期數(shù)天，定性妊娠實驗測為妊娠陽性，過幾天有恢復(fù)月經(jīng)無任何臨床異常情況應(yīng)如何解釋雖然一般濃度2為妊娠陽性。但有時發(fā)現(xiàn)育齡婦女的水平稍許升高，這可能是由于近期的非常早期的自發(fā)性流產(chǎn)引起。約22的%妊娠者在不知曉的情況發(fā)生早期自發(fā)性流產(chǎn)。有許多人未檢查，經(jīng)期過期一段時間又來經(jīng)了。

14、而且月經(jīng)量也較多，這種情況臨床上很多。如果長期維持在低值水平，應(yīng)作進一步檢查了。、低濃度曲線應(yīng)用時注意事項當儀器讀數(shù)V時，如反應(yīng)板膜正中無肉眼可見的淡紅斑點，可直接報告VH不必用低濃度小曲線復(fù)查。當儀器讀數(shù)V時，反應(yīng)膜正中有肉眼可見淡紅色斑點。原檢測板經(jīng)處理后（方法見詳見低濃度曲線應(yīng)用節(jié)）在低濃度曲線下重新檢測濃度，可報告之間的具體單位，供參考。由于濃度增長速率是極快的，病人體液中數(shù)值每小時都在變化，在妊娠與妊娠疾病診斷中過分追求定量的精度是不必要的，我們只要知道其絕對值是否在一個很大的正常范圍，不同天數(shù)間二次測定的是否在不斷上升，后一點更有臨床實用性。0妊娠初期如何用的定量動態(tài)檢測來監(jiān)測胚胎

15、發(fā)育的狀況妊娠初期，孕婦血清或尿液中的濃度直線上升，如增長速率二次相隔檢測，第二次值應(yīng)比第一次增高66左右。例如妊娠婦女，如恰好在二次月經(jīng)日的中間受孕，月經(jīng)過期后第一天約，第七天就可以上升到。按妊娠周數(shù)計算其絕對值正常提示其胚胎生長良好，醫(yī)生和孕婦都可放心。絕對值過低或濃度增高非常緩慢甚至減低應(yīng)引起醫(yī)生高度注意。低濃度重新檢測與大型儀器高濃度自動稀釋再檢測，在試劑消耗上有什么區(qū)別低濃度重新檢測，是用原測試過的反應(yīng)板進行處理后再檢測，不增加用戶成本。大型儀器設(shè)備設(shè)定高濃度自動稀釋模式，每稀釋一次，試劑消耗相當于重新做一次試驗。測定中標本影響因素應(yīng)注意那些問題極個別病人由于標本因素影響的檢測見于下

16、列情況：（1）血清標本由于血脂增高發(fā)生嚴重脂血（2）多種原因?qū)е氯苎臉吮荆?）冰凍后的陳舊性血清未離心去除微小沉淀物（4）尿液標本未作過濾處理由于以上原因，脂血、溶血、血清沉淀物、尿酸鹽類、粘絲等多種物質(zhì)影響試驗中的滲濾速度，也就是較大地改變了反映時間，會影響結(jié)果。如這些物質(zhì)滯留在反應(yīng)板膜孔的表面，阻塞了硝基纖維膜上的微孔，應(yīng)該洗脫滲濾下去的膠體金無法滲透到膜下而去除，嚴重者整個反應(yīng)膜顯示一片紅色反應(yīng)，而不是中間單獨存在的紅色斑點。輕者使背景略微加深，但膜正中的紅色斑點在陽性結(jié)果中還是會有的。這就會使儀器測定值升高。這種情況在陰性中間無斑點時，儀器也可能顯示大于I遇有這種情況，一定首先用肉眼

17、觀測反應(yīng)板正中有無紅色斑點，如無紅色斑點，而整個反應(yīng)膜呈現(xiàn)整體紅色，儀器顯示大于以上，必須將標本重新處理后再測定。在任何情況下，無紅色斑點不能報陽性結(jié)果!正常參考值及懷孕不同時間的國內(nèi)參考值TOC o 1-5 h z不同孕期的正常參考值，國外資料詳見r本手冊P6,以下國內(nèi)資料摘自衛(wèi)生部醫(yī)政司，全國臨床檢驗操作規(guī)程年月第版，P2正常情況下血清濃度：V5。孕婦孕周：孕周：孕周：孕周：孕周：孕周：孕周：孕周：該書強調(diào)“由于各廠商的產(chǎn)品不同以及各地區(qū)的實驗室差異，各實驗室應(yīng)建立自己的參考值”。 HYPERLINK l bookmark36 定量檢測標準操作規(guī)程（）1、產(chǎn)品名稱通用名：人絨毛膜促性腺激素

18、（HCG）金標法快速定量檢測試劑盒;商品名：HCGDOT。2、規(guī)格體外診斷試劑盒，40人份/盒。3、反應(yīng)原理、配套儀器及產(chǎn)品性能本試劑反應(yīng)原理為固相的夾心法免疫試驗。HCG由和二個亞基構(gòu)成。待測樣品血清或尿，流經(jīng)本試劑盒的反應(yīng)板中的硝基纖維素膜時，其中所含的HCG能為膜上固定的抗HCG單抗特異性地捕獲，并專一性地與紅色膠體金HCG單抗綴合物結(jié)合呈紅色斑點，斑點紅色強度可用儀器定量測試，它與樣品中HCG濃度呈正比。本試劑盒以國家標準HCG為參比，制備儀器內(nèi)存標準曲線，可快速定量尿和血清中的HCG。本試劑的配套儀器UppergoldU2金標法定量讀數(shù)儀，定量值為100-15000mIU/ml，小于

19、100時無法讀出，顯示為100mIUHCG/ml”此時可用肉眼判斷，凡反應(yīng)板無肉眼可見紅色斑點，測定值應(yīng)為25；凡有顯色斑點，25mIUHCG/ml測定值100mIUHCG/ml。4、產(chǎn)品組份組份及試驗用具名稱主要活性成分濃度數(shù)量1.反應(yīng)板單抗、致敏濃度1.52.0mml快2.封閉液17溶液1X6.0ml3.洗滌液7.2X7.0ml.金標液凍干品單抗膠體金綴合物、小牛血清白蛋白12X2.3ml5.復(fù)溶液0.66氯化鈉1X5.0ml6.一次性漏斗0只7.濾紙6.0cmX6.0cm（張.說明書1份5、使用目的和適用范圍本產(chǎn)品在配套的UppergoldU2金標法定量讀數(shù)儀上可定量測定血清、尿中的HCG,定量范圍為100-15000mIUHCG/ml，在診斷妊娠同時可判讀滋養(yǎng)層功能和妊娠疾病。6、測定范圍：儀器測定定量值為100-15000mIUHCG/ml。7、操作方法、試劑盒處理：從冷藏處取出試劑盒放入實驗室，室溫平衡半小時，精密量取復(fù)溶液2.3ml,加入1瓶金標液凍干品中，搖勻。、尿標本測定將待測定的尿標本倒入已裝好濾紙的漏斗中進行過濾將反應(yīng)板平放于實驗臺上，于反應(yīng)孔內(nèi)滴加2滴封閉液，待完全滲入在反應(yīng)孔內(nèi)加過濾后尿液標本300l待完全滲入后，加入2滴洗滌液在反應(yīng)孔內(nèi)加金標液100l待完全滲入后，再加洗