1、XXX對帕金森病模型的保護作用及其機制的實驗研究1匯 報 內(nèi) 容2課題背景資料英國內(nèi)科醫(yī)生詹姆斯帕金森博士最早系統(tǒng)描述了帕金森病。為引起人們對這種疾病的重視，自1997年開始，帕金森博士的生日,每年的4月11日被確定為“世界帕金森病日”(World Parkinsons Disease Day)。帕金森病3帕金森?。ú±硖卣髦唬?The common feature of PD is the degeneration of the neural connectionbetween the substantia nigra (SN) and the striatum ( Wooten,1997

2、), two essential brain regions in maintaining normal motor function (Fig. 1 ). 課題背景資料5課題背景資料帕金森?。ú±硖卣髦唬?課題背景資料 黑質(zhì)尚存神經(jīng)元的胞漿內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，亦稱Lewy小 體( LBs) ， LBs主 要 由- 突 觸 核 蛋 白 聚 合 而成。帕金森?。ú±硖卣髦?課題背景資料因此尋求能延緩、阻止甚至逆轉(zhuǎn)神經(jīng)變性過程的藥物，保護神經(jīng)元的損傷已成為臨床期望所在810課題背景資料PQ引起PD的可能毒性機制12 多巴胺能神經(jīng)元可攝取血液中的酪氨酸，后者在胞漿內(nèi)被酪氨酸羥化酶（TH）催化成

3、為多巴（主要為L型），再經(jīng)多巴脫羧酶(DDC) 作用而生成多巴胺（DA），如圖一所示。 課題背景資料多巴胺的合成14課題背景資料二、PQ通過線粒體復合酶I電子傳遞鏈影響能量合成PQ 可 能 通 過 下 述 3種 途 徑導致或誘發(fā)帕金森病15課題背景資料三、上調(diào) 突觸核蛋 白 并 形 成 聚 合 體 突 觸 前 聚集的大量 -synuclein蛋白是PD 患者神經(jīng) 元 內(nèi) 的LBs的主要成分，而LBs 可 能 是 由 于 -synuclein基 因 與PQ相互作用 所 產(chǎn) 生 的。PQ 可 能 通 過 下 述 3種 途 徑導致或誘發(fā)帕金森病16課題背景資料百草枯可能誘導動物模型帕金森病的發(fā)生17

4、 本課題擬從整體和離體水平研究XXX 對 PD 模型中多巴胺能細胞的保護作用及其機制。課題思路整體離體18 行為學檢測(懸掛實驗)：正常小鼠具有攀爬能力,這需要適當?shù)奈樟εc運動協(xié)調(diào)性,我們采用懸掛實驗來檢測小鼠給予PQ后的運動功能障礙。實驗中將小鼠前爪懸掛于距地面30cm水平放置的金屬絲上,記錄從開始懸掛到落地前的時間。將懸掛時間按下述標準評分:0s4s 評0分,5s9s 評1分,10s14s評2分,15s19s評3分,20s24s評4分,25s29s評5分,超過30s評6分1、每天觀察每只小鼠是否有震顫、豎毛、前腿抬高、豎尾、動作緩慢、減少等異常行為2、懸掛法行為學觀察DA 含量的測定HPL

5、C法測黑質(zhì)紋狀體中DA含量測定。病理形態(tài)學觀察 取中腦黑質(zhì)，常規(guī)制片，連續(xù)冠狀切片，分別進行焦油紫染色和TH免疫組化染色，觀察TH陽性細胞的形態(tài)變化。 用圖像分析儀分別對Nissl染色細胞、TH免疫組化染色陽性神經(jīng)元進行計數(shù)，透射電鏡觀察神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)變化。 課題思路20探討 XXX 對PQ 致 C57BL/6 小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護作用課題思路 初步設(shè)想：設(shè)計陰性對照組、百草枯組、XXX處理組（2-3組），根據(jù)XXX化合物特點決定給藥方式、給藥周期以及給藥頻率，觀察行為學指標，并進行病理形態(tài)學觀察，進行DA測定，來探討XXX對PQ致C57BL/6 小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護作用。2

6、1課題思路XXX 對多巴胺能細胞的保護作用機制（抗凋亡作用及其機制研究）23 如果上邊的實驗成立，那么XXX 保護 PC12 細胞免受 PQ神經(jīng)毒性作用的具體信號通路并不是十分清楚。本實驗擬通過 PQ處理 PC12 細胞制備 PD 細胞模型，研究XXX對 PQ所致PC12 細胞損傷的保護作用的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路。課題思路有文獻報道：PI3K/AKT、ERK信號轉(zhuǎn)導通路在神經(jīng)元保護中有著非常重要的作用：24存在疑問26謝謝大家提前祝大家圣誕元旦快樂27Backups283031課題思路有文獻報道：PI3K/AKT、ERK信號轉(zhuǎn)導通路在神經(jīng)元保護中有著非常重要的作用： 磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)

7、/Akt 信號轉(zhuǎn)導通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條參與細胞增殖調(diào)控的重要信號通路。也是在各種損傷應(yīng)激條件下發(fā)揮保護作用的一條重要信號通路，它可以促進氧化應(yīng)激條件下心肌細胞和 PC12 細胞的存活。PI3K 和 Akt 是該通路的中心環(huán)節(jié)。 糖原合成酶-3（Glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是Akt下游的一個激酶，參與調(diào)解細胞代謝過程的許多環(huán)節(jié)，包括糖原合成。GSK-3在靜息細胞呈組成性激活，細胞外刺激可通常通過一些激酶引起GSK-3N末端的絲氨酸殘基的磷酸化可導致其活性抑制，Akt可以通過磷酸化GSK-3抑制其活性。GSK-3可以參與調(diào)解PC12細胞的活性：轉(zhuǎn)染組成性激活

8、的GSK-3可以誘導PC12細胞凋亡；而轉(zhuǎn)染無活性的GSK-3可以抑制凋亡。 胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular- signalregulated kinase，ERK）信號轉(zhuǎn)導通路被認為是與細胞增殖、分化和促進細胞存活密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑，與 PI3K 通路類似，都可以在病理條件下保護促進神經(jīng)元存活。32MPP通過多巴胺轉(zhuǎn)運體（DAT）進入可以直接PC12細胞，能選擇性抑制線粒體復合體I 的活性， 破壞線粒體的呼吸功能，導致PC12細胞內(nèi)ROS的形成、線粒體功能障礙引起一系列的繼發(fā)性改變，最終導致細胞變性、死亡。ROS形成后通過破壞細胞膜脂質(zhì)、裂解DNA進而導致凋亡。3334 P

9、Q其有較強氧化能力, 在NADPH-細胞色素P-450還原酶、NADPH-細胞色素C還原酶、線粒體復合酶I等多種生物酶催化下發(fā)生還原反應(yīng)生成PQ單陽離子自由基(PQ+) 及超氧自由基（O2-）。超氧自由基能從其他脂質(zhì)膜中去掉氫原子, 引發(fā)一系列級聯(lián)生化效應(yīng), 生成活性氧簇( reactive Oxygen species, ROS), 主要有過氧化氫( hydrogen peroxide,H2O2）和羥自由基，引發(fā)細胞毒性效應(yīng), 致膜流動性降低, 通透性增大、脆性增加, 功能下降, 使細胞難以維持生理功能, 對其他自由基的攻擊更加敏感。 黑質(zhì)部位是錐體外系通路的重要環(huán)節(jié), 具有較高的氧化代謝率

10、, 富含高密度的不飽和脂肪酸, 特別易受自由基的攻擊,對PQ的毒性十分易感。百草枯所致PD樣小鼠黑質(zhì)部位存在嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng), 大量氧自由基生成, 使得超氧化物歧化酶( superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione-Px, GSH-Px)過度消耗,多巴胺能神經(jīng)元抗氧化損傷的能力明顯下降。丙二醛為體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物, 組織丙二醛水平間接反映體內(nèi)氧自由基的代謝狀況, 也反映了組織受自由基攻擊程度。PQ引起PD的可能毒性機制課題背景資料35 PQ可經(jīng) 由 血 腦 屏 障(blood brain barrier ，BBB ) 內(nèi)的中性

11、氨基酸載體主動攝取至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，百 草 枯的結(jié)構(gòu)同MPP+ 相 似，可 以 直 接 通 過BBB ，但 是 速 度慢、量也少。在 遞 質(zhì) 轉(zhuǎn) 運 蛋 白如多 巴 胺 轉(zhuǎn) 運 體(dopamine transporter，DAT ) 、L-氨 基酸轉(zhuǎn) 運 體 的 幫 助 下 PQ能夠更容易通過BBB ，達 到 其靶作用位點 。若同 時 攝 入 一 些 小 分 子 氨 基 酸( 如 纈 氨酸苯丙氨酸) 或 左 旋 多 巴，可 以 改 變PQ 的 攝 入 率，從而阻止PQ 在腦內(nèi)的蓄積及其神經(jīng)毒性。 PQ通過能量依賴轉(zhuǎn) 運 入 紋 狀 體 內(nèi)，這 與 PQ在 肺內(nèi)的聚胺攝取 系 統(tǒng) 類 似 。PQ被神經(jīng)末梢迅速攝取后引