去甲氯胺酮半抗原及其全抗原的合成與鑒定摘要】在低溫條件下，去甲氯胺酮與琥珀醛酸反響，合成了半抗原羧基-去甲氯胺酮，電噴霧質(zhì)譜鑒定結(jié)果說明，目的半抗原合成成功；通過碳二亞胺法將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原，紅外光譜法鑒定結(jié)果說明，人工抗原合成成功，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定說明去甲氯胺酮半抗原與牛血清白蛋白的偶聯(lián)比為11∶1。經(jīng)動(dòng)物免疫，獲得高效價(jià)特異性多克隆抗體，抗血清效價(jià)可達(dá)5.12×104?！娟P(guān)鍵詞】去甲氯胺酮；半抗原；人工抗原；合成；鑒定synthesisandidentifiatinfhaptenandpleteantigenfnrketaineyａｎｇting-ｔing，zｈａｏhun-ｃheng，sｈｅｎｘia-ｐing，tａｎｂ-ｃhang，zｏｕｐan-ｋun，ａｎｇｈuai-ｍing,lｉｕｌing-ｙun，ｅｉｃha，ｗｅｉｗan-li，hejin-hai，ujie，zhangdng-sheng，zｈａｏｘia-ｌian〔jiangsusueiirbilgyresearh.，ltd.，uxi214063)(uxiuniipalpubliseuritybureau，uxi214002)(zhenjianguniipalpubliseuritybureau，zhenjiang212001)(jiangyinuniipalpubliseuritybureau，jiangyin214405)yanhenguniipalpubliseuritybureau，yanheng224001)abstratunderlteperaturenditins，thehaptenarbxyl-nrketaineassynthesizedbyreatingnrketaineandsuinaldehydeaid.identifiatinresultusingeletrsprayinizatinassshedthehaptenassuessfullysynthesized.theartifiialantigennfiredbyinfraredspetrspyasdevelpedbynjugatinghaptentarrierprteinsitharbdiiide(ed)ethd.atrix-assistedlaserdesrptininizatintiefflightassspetretry(aldi-tf-s)shedthattheratifhaptentbsaas11∶1.theantibdyithhightiter(5.12×104)asprduedafteriuningtrabbits.keyrdsnrketaine；hapten；artifiialantigen；identifiatin1引言氯胺酮〔ketaine，ket〕是一種通過靜脈給藥的短效麻醉劑，其進(jìn)入血循環(huán)后大局部進(jìn)入腦組織，然后再分布于全身組織中，肝、肺和脂肪內(nèi)的藥物濃度也較高。由于ket是毒品“k粉〞的主要成分，近年來，其非法濫用現(xiàn)象嚴(yán)重。由于ket代謝的半衰期較短，攝入體內(nèi)后，代謝生成去甲基氯胺酮(nrketaine，nket)、去氫去甲基氯胺酮(dehydrnrketaine，dhnk)，因此在生物檢材〔如血液、尿液、毛發(fā)等〕中代謝物的含量比擬高[1,2]，作為檢測(cè)指標(biāo)，ket代謝物(主要是nket)的檢測(cè)比ket的檢測(cè)更加重要，而且對(duì)嫌疑人是否吸食ket確實(shí)認(rèn)更加有效。目前，檢測(cè)ket及其代謝物的分析方法主要有：氣相色譜法〔g〕、氣-質(zhì)聯(lián)用法〔g-s〕、高效液相色譜法〔hpl〕、液-質(zhì)聯(lián)用法〔l-s〕、高效毛細(xì)管電泳法〔hpe〕酶聯(lián)免疫吸附法〔elisa〕等[3~11]。由于常規(guī)儀器分析不適于批量樣品的挑選檢測(cè)，關(guān)于nket的免疫分析技術(shù)國(guó)內(nèi)迄今尚未見相關(guān)報(bào)道。本文設(shè)計(jì)合成了nket的半抗原，并與牛血清白蛋白〔bsa〕和卵清蛋白〔va〕偶聯(lián)得到人工抗原，經(jīng)免疫新西蘭大白兔后，獲得高效價(jià)的特異性多克隆抗體，為建立nket的免疫學(xué)檢測(cè)方法提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。2實(shí)驗(yàn)局部2.1儀器與試劑spetrni1.70紫外可見光分光光度計(jì)〔意大利gb公司〕；nexus670型傅立葉變換紅外光譜儀〔nilet公司〕；vyagerdestr基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜〔美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司〕；k3酶標(biāo)儀〔雷勃公司〕。去甲氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品〔英國(guó)tris公司〕；牛血清白蛋白〔bsa，siga公司〕、卵清蛋白〔va，siga公司〕；弗氏完全、不完全佐劑〔北京生物制品研究所〕；四甲基聯(lián)苯胺〔tb〕、羊抗兔igg〔北京博奧森〕；其他試劑均為分析純。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1半抗原合成取10gnket、3g氰基硼氫化鈉〔nabh3n〕或40μl15%琥珀醛酸溶液，分別參加6，1和1l混合溶劑(四氫呋喃-吡啶為5∶1，ｖ／ｖ〕至完全溶解，于4℃冰箱放置備用；將琥珀醛酸溶液逐滴參加到nket溶液中，4℃下磁力攪拌，反響5in；再逐滴參加nabh3n溶液，將反響混合物在4℃下磁力攪拌2~3h，直至反響完全后，將反響物低溫〔40℃〕旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，所得產(chǎn)物即為nket半抗原〔羧基-nket〕。2.2.2人工抗原的合成取上述nket半抗原13.8g，溶于1ln,n-二甲基甲酰胺〔df〕溶液中，滴加50g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺〔ed，溶于0.5lh2〕，攪拌反響20in后，將該反響液滴加至20gbsa〔溶于10lh2中〕立即參加52gn-羥基硫代琥珀酰亞胺〔sulf-nhs〕，室溫下攪拌過夜。pbs透析48h，冷凍枯燥。包被抗原〔nket-va〕的合成方法同上。合成道路見圖解1。圖解1去甲氯胺酮人工抗原合成道路〔略〕shee1reatinsheefsynthesisfrnrketaine(nket)antigen2.2.3半抗原和人工抗原的構(gòu)造鑒定所得的nket半抗原和免疫抗原〔nket-bsa〕的分子構(gòu)造鑒定分別采用質(zhì)譜法〔s-esi〕和紅外光譜法〔ir〕確證。2.2.4抗體制備及效價(jià)測(cè)定以偶聯(lián)物nket-bsa為免疫抗原免疫雄性新西蘭大白兔，1g/kg體重。根底免疫采用背部皮下多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫采用四肢內(nèi)部肌肉注射，間接酶聯(lián)免疫吸附法〔ielisa〕測(cè)定效價(jià)合格后，頸動(dòng)脈放血，別離抗血清，采用飽和硫酸銨沉淀法[7]純化抗體，制成凍干粉，于－20℃保存。采用elisa法測(cè)定純化抗體的效價(jià)。3結(jié)果與討論3.1半抗原分子構(gòu)造的鑒定經(jīng)l-s法〔如圖1〕分析得出，l圖譜中8.71in對(duì)應(yīng)的峰是過剩的反響物，而9.45in對(duì)應(yīng)的峰經(jīng)s法分析結(jié)果可知，分子離子峰/z312〔[310+2h]+〕，分子離子峰/z308〔[310－2h]－〕，因此，質(zhì)譜分析結(jié)果初步說明反響產(chǎn)物為目的化合物，即nket半抗原。圖１nket半抗原的hpl-s圖譜〔略〕fig.１hpl-sspetrufnkethapten3.2人工抗原nket-bsa構(gòu)造鑒定采用固體kbr壓片，對(duì)nket-bsa凍干粉、bsa和nket進(jìn)展ir測(cè)定。如圖２所示。通過比擬bsa和nket-bsa的紅外吸收光譜發(fā)現(xiàn)，在2800~3400－1區(qū)域以及1500~1700－1區(qū)域具有相似的吸收，此為蛋白質(zhì)中氨基酸的特征吸收，說明合成的nket-bsa化合物具有bsa的特征官能團(tuán)。將nket-bsa與nket的紅外光譜進(jìn)展比擬，在600~1200－1之間，出現(xiàn)了明顯的nket半抗原特征峰,而bsa在此處無明顯吸收，說明nket-bsa具有nket的特征官能團(tuán),根本判斷nket-bsa人工免疫原已經(jīng)合成成功。圖２nket，nket-bsa及bsa的ir圖譜〔略〕fig.２irspetrafnket，nket-bsaandbsa3.3人工抗原偶聯(lián)比的測(cè)定將所得免疫抗原〔nket-bsa〕通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜〔aldi-tf-s〕進(jìn)展偶聯(lián)比的測(cè)定得測(cè)定偶聯(lián)物分子量約為68685da，計(jì)算得1分子bsa約與11分子nket半抗原偶聯(lián)，即nket半抗原與bsa的偶聯(lián)比為11∶1。3.4抗體效價(jià)根據(jù)方陣滴定原理，采用間接elisa法測(cè)定抗nket抗體的效價(jià)。當(dāng)包被抗原濃度為2.0g/l時(shí)，抗血清效價(jià)可達(dá)5.12×104。本研究選擇從氨基部位進(jìn)展衍生化，以琥珀醛酸作為衍生劑，以混合溶劑〔四氫呋喃-吡啶，5∶1，v/v〕作為反響溶劑，低溫反響得到產(chǎn)物。研究結(jié)果說明，本方法是一種新的nket半抗原合成方法，可以滿足實(shí)驗(yàn)室少量合成半抗原的需要。人工抗原nket-bsa的合成，采用碳二亞胺法，經(jīng)兩步反響得到偶聯(lián)物，并通過ir和aldi-tf-s進(jìn)展了鑒定。經(jīng)動(dòng)物免疫獲得抗nket的多克隆抗體，當(dāng)包被抗原濃度為2.0g/l時(shí)，抗血清效價(jià)可達(dá)5.12×104?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1liuxia-xing〔劉小興〕，xingyng-hua〔熊勇華〕.hinapublihealth〔中國(guó)公共衛(wèi)生〕，2022，23〔5〕：629~6312hitepf，ayl，trevraj.anesthesilgy.，1982，56〔2〕:119~1363jiangzha-lin〔姜兆林〕，panjun-hang〔潘俊昌〕，yali-juan〔姚麗娟〕，zhayan-jun〔趙彥軍〕.jurnalfjiangxipubliseurityllege〔江西公安?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)〕，2022，〔2〕：74~754lufang〔羅芳〕，liuying〔劉穎〕.prensisieneandtehnlgy〔刑事技術(shù)〕，2022，〔1〕：19~215henli-li〔陳禮莉〕，lialin-huan〔廖林川〕，lien-jia〔李雯佳〕，huanglu-ya〔黃璐瑤〕，yanyu-yi〔顏有儀〕，yanglin〔楊林〕，axia-na〔馬曉娜〕，herng〔何榮〕.jurnalffrensiediine〔法醫(yī)學(xué)雜志〕，2022，24〔1〕：38~426shenxia-ping〔沈笑平〕，hejin-ei〔何金梅〕，duli〔竇莉〕.hin.j.phar.anal.〔藥物分析雜志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