第三章基因的克隆方法1前言

基因是生物染色體上的一段DNA序列，具有轉(zhuǎn)錄、翻譯成某種蛋白質(zhì)調(diào)控生物生命活動的功能。2基因的表達過程mRNA翻譯成蛋白質(zhì)基因組DNA3如何獲得基因？——即基因的克隆方法基于基因產(chǎn)物的基因克隆方法基于基因加標簽的基因克隆方法基于基因序列的基因克隆方法基于基因圖譜的基因克隆方法4一、基于基因產(chǎn)物的基因克隆方法mRNA翻譯成蛋白質(zhì)1、根據(jù)蛋白質(zhì)序列克隆目的基因2、根據(jù)基因表達差異（mRNA）克隆基因5原理：根據(jù)蛋白質(zhì)上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后設(shè)計探針或引物從基因組文庫或cDNA文庫中分離出相應(yīng)的基因。1、蛋白質(zhì)序列克隆法6實用性：分離純化蛋白質(zhì)十分困難CysMetAspGluMetLysArgAsnIleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA

C

T

GATG

G

G

T

T

C據(jù)某段氨基酸序列推導(dǎo)可能的核苷酸序列注意！密碼子有簡并性現(xiàn)象！72、根據(jù)基因表達差異（mRNA）克隆基因基因表達的差異表現(xiàn)：一是基因表達的種類的不同；二是基因表達水平的改變。8差減雜交（SH）抑制性差減雜交（SSH）差異顯示PCR（DDRT-PCR）DNA代表性差異分析（DNARDA）擴增限制性片段長度多樣性（AFLP）cDNA微陣列已發(fā)展的相應(yīng)基因克隆方法：9

差減雜交（SH）最早由Lamar和Palmer于1984年提出并用于雄鼠Y染色體的DNA研究。超聲波打斷雌鼠的DNA（過量100倍）(XX)MboI完全消化雄鼠的DNA

(XY)變性、復(fù)性去除共有序列BamHI酶切表達載體連接、轉(zhuǎn)化、測序分析缺點：技術(shù)要求高，耗時，工作量大NO.1NO.2NO.310SH在mRNA研究上的應(yīng)用機理：

!!不足之處：重復(fù)性差，靈敏度低，回收的cDNA量有限。特異表達基因的樣本（TS）無特異表達基因的樣本（RS）提取mRNA提取mRNAcDNAcDNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄過量雜交TS的CDNA純化、富集、擴增去除過量的RS的cDNA及雜交分子11

基因突變體的研究：如基因的表達與不表達；

基因時空表達的研究：如根、莖、葉；

不同處理條件下的基因表達差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。差減雜交技術(shù)的應(yīng)用方面：121.2.2抑制性差減雜交（SSH）Tester樣本mRNADriver樣本mRNASfiIAcDNAcDNASfiIBAB混合，變性雜交過量ABPCR擴增5`3`13應(yīng)用基因突變體的研究：如基因的表達與不表達基因時空表達的研究：如根、莖、葉不同處理條件下的基因表達差異：如施肥與不施肥、光照與不光照141.2.3差異顯示PCR（DDRT-PCR）最先由Liang等于1992年報道，目前已廣泛在實驗室使用。主要原理：利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3`端設(shè)計象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時結(jié)合5`端的隨機引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴增。5`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA155`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT1617具體操作：1、提取mRNA；2、特定引物（12分之一）反轉(zhuǎn)錄；3、特定引物和RP結(jié)合RT-PCR；4、把不同處理的樣品擴增產(chǎn)物按引物組合分別進行電泳比較DNA帶，從而找出差別DNA。18缺點：假陽性條帶多，對低豐度的基因表達不容易檢測。工作量大。無法定量研究。擴出的條帶往往是3`端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。19

優(yōu)點：簡便、靈敏、高效、省時，能快速顯示mRNA的組成。所需的mRNA量少。各樣本mRNA的差異可同時進行比較。擴出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等。20二、基于基因加標簽的基因克隆方法原理：主要是在生物基因組中插入外源的一段DNA，使生物體產(chǎn)生某種突變表型，然后反過來利用這段外源已知的DNA片段來克隆基因的方法。21外源DNA基因組染色體DNA基因A產(chǎn)生突變型分類：T-DNA標簽法轉(zhuǎn)座子標簽法。22T-DNA標簽法克隆基因技術(shù)路線：農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個體。建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫.用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。把陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體進行功能互補及進行測序分析。23野生株轉(zhuǎn)基因株目的基因染色體T-DNA染色體T-DNA探針篩選轉(zhuǎn)基因文庫作探針篩選野生株基因文庫構(gòu)建基因組文庫基因苗構(gòu)建基因組文庫基因苗陽性克隆目的基因獲得陽性克隆基因序列分析，確定為基因陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體，確定基因功能24轉(zhuǎn)座子標簽法轉(zhuǎn)座子又稱轉(zhuǎn)座因子或者跳躍因子，實際上也是DNA片段，它可以在生物的染色體組中移動，從染色體的一個位點跳到另一個位點，或從一條染色體跳到另一條染色體上，引起基因功能的改變。25轉(zhuǎn)座子標簽法最早是美國玉米育種家1951年發(fā)現(xiàn)，起初不被認同，1967年在大腸桿菌的半乳糖操縱子中證實后得到認同。根據(jù)DNA的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座的機理，分為兩大家族：轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子，前者如玉米的Ac/Ds系統(tǒng)和spm因子，后者如果蠅的copia因子。26轉(zhuǎn)座子根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可以分為簡單轉(zhuǎn)座子和復(fù)雜轉(zhuǎn)座子簡單轉(zhuǎn)座子：可以直接插入到其他位置,也叫插入序列。復(fù)雜轉(zhuǎn)座子：攜帶有其它基因或遺傳標記。結(jié)構(gòu)共同點：兩端含有20-40個核苷酸的倒置重復(fù)序列。含有可編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。應(yīng)用：以Ac/Ds系統(tǒng)為例27Ac/Ds系統(tǒng)操作原理把Ac，Ds分別轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)化體。把Ac轉(zhuǎn)化體同Ds轉(zhuǎn)化體進行雜交得到F1代，然后自交得到F2、F3代分離群體，找出穩(wěn)定突變個體。用Ds做probe篩選突變體文庫獲得突變基因的部分序列。用上述序列篩選正常個體基因組文庫或cDNA文庫，得到目的基因。28三、基于基因序列的基因克隆方法根據(jù)克隆的策略的不同，基于基因序列的基因克隆方法又可以分為兩種形式：通過分子雜交克隆法和通過PCR擴增基因法291、通過分子雜交克隆法原理：根據(jù)基因序列上的同源保守性，從一種生物中分離獲得的基因用于制作分子探針，從另一種生物的基因文庫中分離出此生物中的同源基因。301）直接從基因組中擴增過程：（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物（3）PCR擴增及產(chǎn)物鑒定2、通過PCR擴增基因法原理：

根據(jù)基因序列結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計基因特異引物，利用PCR技術(shù)直接從生物的基因組或是cDNA中擴增出目的基因。31提取基因組DNAPCR引物設(shè)計真核生物基因組含有內(nèi)含子！此法適合擴增原核生物基因。PCR擴增基因序列分析32（1）提取基因組totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴增及序列分析（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物2）從mRNA中擴增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴增真核生物基因。334、基于基因圖譜的基因克隆方法又稱圖位克隆法，是建立在擁有RFLP等分子標記的連鎖遺傳圖和基因文庫，基因產(chǎn)物未知的一種基因克隆技術(shù)，理論上可以分離任何一個突變基因。34染色體分子標記A分子標記B目的基因陽性克隆轉(zhuǎn)化互補實驗基因圖位克隆示意圖35圖位克隆基因的一般操作過程：通過遺傳分析構(gòu)建與目標基因緊密連鎖的分子標記連鎖圖，達到基因的精細定位。用與目標基因緊密連鎖的兩側(cè)分子標記篩選基因組文庫，構(gòu)建包含目標基因的基因組物理圖譜。目的基因標記1標記2標記3標記4標記536染色體分子標記2分子標記3目的基因基因組物理圖譜進一步精細定位獲得目的基因37通過染色體步移或染色體登陸技術(shù)對目標基因進行進一步精細定位，得到陽性克隆。對陽性克隆轉(zhuǎn)化隱性受體進行功能互補?；蛐蛄袦y定及表達分析等。38影響基因圖位克隆的因素：建立的分子標記遺傳圖中標記與基因之間的距離大小?；蚪M的大小及可能存在的大量的重復(fù)序列?；蚪M文庫的大