基因打靶的里程碑事件

——ZFN、TALEN、

CRISPR-CaS姓名：邢亞迪專業(yè)：作物遺傳育種導師：何光華教授基因打靶的里程碑事件

——ZFN、TALEN、

CRISPR1

任何對基因進行特異性修飾的工具都是由兩個部分組成：1DNA特異性識別結合域2核酸內(nèi)切酶活性區(qū)域ZFN

=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶TALEN

=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶CAS9=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶任何對基因進行特異性修飾的工具都是由兩個部分組成2ZFN原理ZFN=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶DNA識別域：由一系列Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般3~4個），每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的三聯(lián)體堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNA。ZFN原理ZFN=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶3TALEN=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶DNA識別域：由一系列TAL蛋白串聯(lián)組成（一般20個左右），每個TAL蛋白識別并結合一個對應的堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNATALEN=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶4TALEN的定義及原理

TALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:

一種源于植物致病菌的靶向基因操作技術。

科學家發(fā)現(xiàn)，來自植物細菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關系,一個模塊單元識別一個堿基，簡單且特異性極好。

通過組合各類模塊，可對任意核苷酸序列進行靶向特異性敲除或內(nèi)源基因的表達調(diào)控。

目前已在人、大鼠、小鼠、豬、羊、斑馬魚、擬南芥及酵母等多類物種中得到成功應用。TALEN的定義及原理TALE（Transcript5全長為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異性識別核苷酸堿基。NG可以識別THD可以識別CNI可以識別ANN可以識別G或A通過這種特異性識別，將多個Tal蛋白組裝在一起，再加上FokI核酸內(nèi)切酶，就可以構成可以識別目的片段的Tale蛋白。全長為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異6TALEN的特異性打靶的原理：一對可以特異性識別靶基因的TALE，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后非特異性核酸內(nèi)切酶Fok1切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）；再通過DNA的自我修復，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。Fok1只有在形成二聚體的時候才有內(nèi)切酶活性。TALEN的特異性打靶的原理：7TALEN介導的基因敲除TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞后，表達兩個融合蛋白，分別與靶位點特異結合，由于兩個TALEN融合蛋白中的FokI臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，在兩個靶位點之間剪切DNA。TALEN介導的基因敲除8TALEN介導的同源重組形成DSB時，同源重組可將需要敲入的序列組合如基因組。TALEN介導的同源重組形成DSB時，同源重組可將9TALEN的技術特點任意敲除，無基因序列、細胞、物種限制，永久失活成功率高，在保證轉(zhuǎn)染效率的前提下，有效性可達95%以上打靶效率高,可完全替代RNAi技術脫靶率低，尚未發(fā)現(xiàn)明顯脫靶效應周期短，只需按照常規(guī)構建質(zhì)粒方法構建Talen質(zhì)粒TALEN的技術特點任意敲除，無基因序列、細胞、物種限制，永10ZFNTALENCRISPRCas三種基因編輯工具課件11CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR序列：

細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences）。Cas：

CRISPR相關基因（CRISPR-associatedgenes）CRISPR-Cas系統(tǒng)是細菌的免疫系統(tǒng)：CRISPR序列能特異性識別外源核酸序列；Cas蛋白的非特異性核酸內(nèi)切酶功能將外源核酸切斷。CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR序列：12兩個質(zhì)粒，一個表達Cas9蛋白，一個表達sgRNA兩個質(zhì)粒，一個表達Cas9蛋白，一個表達sgRNA13CRISPR-Cas9=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶

DNA識別域：向?qū)NA

核酸內(nèi)切酶：Cas9核酸內(nèi)切酶引導RNA由兩部分組成：CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA（transactingCRISPRRNA,tracrRNA)crRNA一端與雙鏈核苷酸互補結合，另一端與tracrRNA互補結合，形成向?qū)NA。CRISPR-Cas9=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶14PAM：NGGCas9蛋白與向?qū)NA結合、組裝的動作是這套位點特異性的基因組修飾過程里的限速步驟。PAM序列為５’－ＮＧＧ－３’

靶序列后面必須為ＮＧＧ才能被向?qū)В遥危磷R別。PAM：NGG15CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求：PAM序列

PAM序列只有３個堿基：ＮＧＧ。

靶序列后面必須為ＮＧＧ才能被向?qū)В遥危磷R別。

在人類基因組中平均每８個堿基就可以出現(xiàn)一個ＮＧＧCRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求：PAM序列

PAM序16最近有研究發(fā)現(xiàn)，crRNA和tracrRNA可以被“改裝”成一個向?qū)NA（single-guideRNA,sgRNA）。這個sgRNA足以幫助Cas9內(nèi)切酶對DNA進行定點切割。而且可以將sgRNA和Cas9裝在同一個表達質(zhì)粒中表達。

這種RNA介導的Cas9酶切作用能夠在多種類型的細胞和生物體內(nèi)正常地行使功能，在完整基因組上的特定位點完成切割反應。最近有研究發(fā)現(xiàn)，crRNA和tracrRNA可以被“改裝”17CRISPR-Cas系統(tǒng)優(yōu)勢ZNF成本高昂，效率低。Cas9的效率是TALEN的5倍。sgRNA全長不超過100bp，構建更容易CRISPR-Cas系統(tǒng)優(yōu)勢ZNF成本高昂，效率低。18基因打靶的里程碑事件

——ZFN、TALEN、

CRISPR-CaS姓名：邢亞迪專業(yè)：作物遺傳育種導師：何光華教授基因打靶的里程碑事件

——ZFN、TALEN、

CRISPR19

任何對基因進行特異性修飾的工具都是由兩個部分組成：1DNA特異性識別結合域2核酸內(nèi)切酶活性區(qū)域ZFN

=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶TALEN

=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶CAS9=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶任何對基因進行特異性修飾的工具都是由兩個部分組成20ZFN原理ZFN=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶DNA識別域：由一系列Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般3~4個），每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的三聯(lián)體堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNA。ZFN原理ZFN=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶21TALEN=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶DNA識別域：由一系列TAL蛋白串聯(lián)組成（一般20個左右），每個TAL蛋白識別并結合一個對應的堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNATALEN=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶22TALEN的定義及原理

TALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:

一種源于植物致病菌的靶向基因操作技術。

科學家發(fā)現(xiàn)，來自植物細菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關系,一個模塊單元識別一個堿基，簡單且特異性極好。

通過組合各類模塊，可對任意核苷酸序列進行靶向特異性敲除或內(nèi)源基因的表達調(diào)控。

目前已在人、大鼠、小鼠、豬、羊、斑馬魚、擬南芥及酵母等多類物種中得到成功應用。TALEN的定義及原理TALE（Transcript23全長為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異性識別核苷酸堿基。NG可以識別THD可以識別CNI可以識別ANN可以識別G或A通過這種特異性識別，將多個Tal蛋白組裝在一起，再加上FokI核酸內(nèi)切酶，就可以構成可以識別目的片段的Tale蛋白。全長為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異24TALEN的特異性打靶的原理：一對可以特異性識別靶基因的TALE，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后非特異性核酸內(nèi)切酶Fok1切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）；再通過DNA的自我修復，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。Fok1只有在形成二聚體的時候才有內(nèi)切酶活性。TALEN的特異性打靶的原理：25TALEN介導的基因敲除TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞后，表達兩個融合蛋白，分別與靶位點特異結合，由于兩個TALEN融合蛋白中的FokI臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，在兩個靶位點之間剪切DNA。TALEN介導的基因敲除26TALEN介導的同源重組形成DSB時，同源重組可將需要敲入的序列組合如基因組。TALEN介導的同源重組形成DSB時，同源重組可將27TALEN的技術特點任意敲除，無基因序列、細胞、物種限制，永久失活成功率高，在保證轉(zhuǎn)染效率的前提下，有效性可達95%以上打靶效率高,可完全替代RNAi技術脫靶率低，尚未發(fā)現(xiàn)明顯脫靶效應周期短，只需按照常規(guī)構建質(zhì)粒方法構建Talen質(zhì)粒TALEN的技術特點任意敲除，無基因序列、細胞、物種限制，永28ZFNTALENCRISPRCas三種基因編輯工具課件29CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR序列：

細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences）。Cas：

CRISPR相關基因（CRISPR-associatedgenes）CRISPR-Cas系統(tǒng)是細菌的免疫系統(tǒng)：CRISPR序列能特異性識別外源核酸序列；Cas蛋白的非特異性核酸內(nèi)切酶功能將外源核酸切斷。CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR序列：30兩個質(zhì)粒，一個表達Cas9蛋白，一個表達sgRNA兩個質(zhì)粒，一個表達Cas9蛋白，一個表達sgRNA31CRISPR-Cas9=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶

DNA識別域：向?qū)NA

核酸內(nèi)切酶：Cas9核酸內(nèi)切酶引導RNA由兩部分組成：CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA（transactingCRISPRRNA,tracrRNA)crRNA一端與雙鏈核苷酸互補結合，另一端與tracrRNA互補結合，形成向?qū)NA。CRISPR-Cas9=DNA識別域+核酸內(nèi)切酶32PAM：NGGCas9蛋白與向?qū)NA結合、組裝的動作是這套位點特異性的基因組修飾過程里的限速步驟。PAM序列為５’－ＮＧＧ－３’

靶序列后面必須為ＮＧＧ才能被向?qū)В遥危磷R別。PAM：NGG33CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求：PAM序列

PAM序列只有３個堿基：ＮＧＧ。

靶序列后面必須為ＮＧＧ才能被向?qū)В遥危磷R別。

在人類基因組中平均每８個堿基就可以出現(xiàn)一個ＮＧＧCRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求：PAM序列

PAM序34最近有研究發(fā)現(xiàn)，crRNA和tracrRNA可以被“改裝”成一個向?qū)NA（single-