第五節(jié)色譜分離技術(shù)第五節(jié)色譜分離技術(shù)1特點(diǎn)色譜分離技術(shù)最大的特點(diǎn)：分離效率高能分離各種性質(zhì)極其類似的物質(zhì)；應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)的分析鑒定的同時(shí)，可用于大量物質(zhì)的分離純化制備；

如：胰島素注射藥品——以凝膠色譜去除胰島素中的二聚體特點(diǎn)色譜分離技術(shù)最大的特點(diǎn)：分離效率高2什么叫作色譜法：色譜法（chromatography）又稱層析法，是利用混合物中各個(gè)組分的化學(xué)、物理性質(zhì)的差異，基于被分離物質(zhì)分子在兩相（一為固定相，一為流動(dòng)相）中分配系數(shù)的微小差別進(jìn)行分離。一、色譜分離技術(shù)的基本概念與理論什么叫作色譜法：一、色譜分離技術(shù)的基本概念與理論3什么叫作色譜法：對(duì)一些結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似化合物的分離，用經(jīng)典的萃取法、沉淀法和結(jié)晶法等難以達(dá)到分離目的時(shí)，用色譜法往往可以收到很好的分離效果。一、色譜分離技術(shù)的基本概念與理論什么叫作色譜法：一、色譜分離技術(shù)的基本概念與理論4色譜分離過(guò)程：被分離的各組分受到固定相的作用力不同（吸附、分配、分子間氫鍵結(jié)合力等）；在流動(dòng)相與固定相發(fā)生相對(duì)移動(dòng)過(guò)程中，當(dāng)待分離的混合物通過(guò)固定相時(shí)，由于各組分的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生作用的能力不同，在兩相中的分配不同；色譜分離技術(shù)的原理：色譜分離過(guò)程：色譜分離技術(shù)的原理：5

色譜分離過(guò)程：與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯越小，向前移動(dòng)的速度快，反之，與固定相相互作用力越強(qiáng)的組分，向前移動(dòng)的速度越慢；進(jìn)行分部收集流出液，即可得到各單一組分，達(dá)到分離目的。色譜分離技術(shù)的原理：色譜分離過(guò)程：色譜分離技術(shù)的原理：6固定相流動(dòng)相色譜柱被分離組分固定相7天然藥物提取工藝課件-色譜分離技術(shù)8是色譜分離過(guò)程的一個(gè)固定介質(zhì)。可以是固體物質(zhì)(如吸附劑、凝膠、離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠、纖維素或樹脂上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附、分配、溶解、交換等作用；它對(duì)色譜分離的效果起著關(guān)鍵的作用。1.固定相是色譜分離過(guò)程的一個(gè)固定介質(zhì)。1.固定相9在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界流體等都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析稱為展層劑。它是層析分離中的重要影響因素之一。2.流動(dòng)相在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體10保留時(shí)間待分離物質(zhì)從進(jìn)樣開始到組分流出濃度最大時(shí)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間，稱為該組分的色譜保留時(shí)間，用tR表示。保留體積待分離物質(zhì)從進(jìn)樣開始到組分流出濃度最大時(shí)所用洗脫液的體積，稱為該組分的保留體積，用vR表示。3.保留時(shí)間和保留體積保留時(shí)間待分離物質(zhì)從進(jìn)樣開始到組分流出濃度最大時(shí)所經(jīng)過(guò)的11死時(shí)間非保留溶質(zhì)從進(jìn)樣開始到流出色譜柱所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為死時(shí)間；用t0表示；死體積

非保留溶質(zhì)從進(jìn)樣開始到流出色譜柱所用的洗脫液的體積，稱為死體積；用v0表示。4.死時(shí)間和死體積死時(shí)間非保留溶質(zhì)從進(jìn)樣開始到流出色譜柱所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為12調(diào)整保留時(shí)間

某種物質(zhì)扣除死時(shí)間后的在色譜柱上的保留時(shí)間稱為該物質(zhì)的調(diào)整保留時(shí)間；調(diào)整保留體積

某種物質(zhì)扣除死體積后的在色譜柱上洗脫所用的洗脫劑的體積稱為該物質(zhì)的調(diào)整保留體積。5.調(diào)整保留時(shí)間和調(diào)整保留時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間某種物質(zhì)扣除死時(shí)間后的在色譜柱上的保留時(shí)間稱為136.容量因子

表示某一溶質(zhì)在色譜柱中任意位置達(dá)到平衡后，該溶質(zhì)在固定相中量和在流動(dòng)相中的量之比。7.塔板理論

色譜柱的理論塔板數(shù)越大，塔板高度越小，色譜柱的分離效率越高。6.容量因子148.分配系數(shù)

在一定的條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中含量（濃度）的比值，常用K表示。9.遷移率（比移值）在一定條件下，在相同的時(shí)間內(nèi)某一組分在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相本身移動(dòng)的距離之比值，常用Rf表示。8.分配系數(shù)在一定的條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中含1510.分辨率（分離度）11.操作容量（交換容量）

在一定條件下，某種組分與固定相反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在固定相上的飽和容量。操作容量大，與固定相的親和力越大，加入樣量可越大。反之，相反。10.分辨率（分離度）16正相色譜：是指固定相的極性高于流動(dòng)相在層析過(guò)程中，非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動(dòng)的速度快，先從柱中洗脫出。12.正相色譜和反相色譜正相色譜：是指固定相的極性高于流動(dòng)相12.正相色譜和反相色17反相色譜：是指固定相的極性低于流動(dòng)相在層析過(guò)程中，極性大的分子比極性小的分子移動(dòng)的速度快，而先從柱中洗脫流出。12.正相色譜和反相色譜12.正相色譜和反相色譜18根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以分為多類：

A.根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類：

紙層析：

以濾紙為基質(zhì)；

薄層層析：是將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進(jìn)行層析；柱層析：

將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進(jìn)行層析。13.層析法的分類根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以分為多類：13.層析法的分類19B.根據(jù)流動(dòng)相的形式分類：液相層析：流動(dòng)相為液體的層析；

氣相層析：流動(dòng)相為氣體的層析；13.層析法的分類B.根據(jù)流動(dòng)相的形式分類：13.層析法的分類20吸附層析：以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間的吸附力不同達(dá)到分離目的；分配層析：是根據(jù)在一個(gè)由兩相同時(shí)存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的；C.根據(jù)分離原理的不同分類：吸附層析：C.根據(jù)分離原理的不同分類：21凝膠過(guò)濾層析：以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析方法；離子交換層析：

以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的一種層析方法；C.根據(jù)分離原理的不同分類：凝膠過(guò)濾層析：C.根據(jù)分離原理的不同分類：22親和層析：

根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對(duì)能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析分離。C.根據(jù)分離原理的不同分類：親和層析：C.根據(jù)分離原理的不同分類：23色譜法

液相色譜法

氣相色譜法平板色譜法

柱色譜法紙色譜法氣液色譜法氣固色譜法分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法排阻色譜法

超臨界流體色譜法親和色譜法薄層色譜法色譜法液相色譜法氣相色譜法平板色譜法柱色譜法紙氣氣分吸24二、吸附色譜法

(adsorptionchromatography)

1.原理：吸附色譜為色譜固定相與流動(dòng)相在相對(duì)移動(dòng)過(guò)程中，溶質(zhì)和溶劑分子在吸附劑表面上的活性位點(diǎn)相互競(jìng)爭(zhēng)的吸附過(guò)程。簡(jiǎn)單的說(shuō):依據(jù)吸附劑對(duì)混合物中各成分吸附性能的不同，使各成分得到分離。

二、吸附色譜法(adsorptionchromat25在天然有機(jī)化合物分離及精制工作中，吸附現(xiàn)象利用得十分廣泛。其中又以固-液吸附用得最多.2.常用吸附劑：

硅膠、氧化鋁、活性炭、聚酰胺.

在天然有機(jī)化合物分離及精制工作中，吸附現(xiàn)象利用得十分廣泛。其263.固-液吸附可分為:

①物理吸附(表面吸附)：

硅膠、氧化鋁及活性炭②化學(xué)吸附③半化學(xué)吸附：聚酰胺層析3.固-液吸附可分為:274.物理吸附的特點(diǎn)：①無(wú)選擇性;②吸附與解吸是可逆的;③速度快;④實(shí)際應(yīng)用最多。5.化學(xué)吸附的特點(diǎn)：①具有選擇性；②吸附十分牢固,有時(shí)甚至是不可逆的。③化學(xué)吸附用得少.4.物理吸附的特點(diǎn)：286.半化學(xué)吸附的特點(diǎn)：

①介于物理吸附與化學(xué)吸附之間的吸附過(guò)程，其吸附力較弱。②半化學(xué)吸附有一定應(yīng)用價(jià)值。如:聚酰胺與黃酮類、醌類等酚性化合物之間的氫鍵吸附屬于半化學(xué)吸附。6.半化學(xué)吸附的特點(diǎn)：29液-固物理吸附色譜是運(yùn)用較多的一種方法，

特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1000的低揮發(fā)性樣品）的分離，

尤其是脂溶性成分。

一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水性化合物等的分離。液-固物理吸附色譜是運(yùn)用較多的一種方法，30吸附色譜的分離效果，決定于吸附劑、溶劑、被分離化合物的性質(zhì)這三個(gè)因素。吸附色譜的分離效果，決定于31天然藥物提取工藝課件-色譜分離技術(shù)32（一）吸附色譜分離中常用的固定相1.氧化鋁：是由氫氧化鋁直接在高溫下脫水制得,因在制備方法和處理方法的差別有堿性中性酸性（一）吸附色譜分離中常用的固定相1.氧化鋁：33（一）吸附色譜分離中常用的固定相堿性氧化鋁pH9-10：適合分離堿性和中性成分，如生物堿；中性氧化鋁pH7.5：適合生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體等化合物；酸性氧化鋁pH4-5：適合酸性物質(zhì)，如酸性色素、

某些氨基酸等；（一）吸附色譜分離中常用的固定相堿性氧化鋁pH9-10：34氧化鋁的吸附機(jī)理：表面上有鋁醇基（Al-OH）羥基的氫鍵作用而吸附化學(xué)物質(zhì)。氧化鋁的吸附機(jī)理：35氧化鋁的活性與含水量密切相關(guān)：活化：在高溫下去除水分，含水量低，活性增強(qiáng)，稱為活化；去活化：加入一定量的水，含水量高，活性降低，稱為去活化。氧化鋁的活性與含水量密切相關(guān)：36a.硅膠，通常用SiO2·xH2O表示，是一種堅(jiān)硬、無(wú)定型鏈狀和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的硅酸聚合物顆粒，約90％的分離工作都可選用硅膠作為吸附劑。2.硅膠a.硅膠，通常用SiO2·xH2O表示，是一種堅(jiān)硬、無(wú)定37b.具有硅氧交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，表面有許多的硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是硅膠具有吸附能力的活性基團(tuán)。c.被分離物質(zhì)由于極性和不飽和程度不同和硅醇基相互作用的程度不同而達(dá)到分離目的。2.硅膠b.具有硅氧交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，表面有許多的硅醇基的多孔性微粒。硅38d.硅膠的羥基存在于硅膠表面較小的空穴中，因此空穴較小而比表面積大的硅膠吸附性能力強(qiáng)。水能與硅膠表面的羥基結(jié)合成水合硅醇基而使得硅膠失去活性；若將硅膠加熱到100℃左右加熱，水能可逆地除去。d.硅膠的羥基存在于硅膠表面較小的空穴中，因此空穴較小而比表39活化：將硅膠在100℃左右加熱，可去除部分水分，增強(qiáng)吸附能力。一般指將硅膠在110℃加熱30min，增強(qiáng)吸附能力，稱為活化。天然藥物提取工藝課件-色譜分離技術(shù)40濕法裝柱法：即將硅膠混懸于裝柱溶劑中，不斷攪拌，待內(nèi)中空氣泡除去后，連同溶劑一起傾入層析柱中，層析柱中硅膠段直徑與長(zhǎng)度之比一般為1:(20-30)。硅膠最好一次傾入，否則由于不同粒度大小的硅膠沉降速度不一、使硅膠柱有明顯的分段現(xiàn)象，影響分離結(jié)果。e.硅膠層析的裝柱：濕法裝柱法：即將硅膠混懸于裝柱溶劑中，不斷攪拌，待內(nèi)中空氣泡41干法裝柱：將所需硅膠一次性全部?jī)A入柱中，然后緊至硅膠高度不再變化即可。欲分離樣品與吸附劑的比例為1:(30-60)e.硅膠層析的裝柱：干法裝柱：將所需硅膠一次性全部?jī)A入柱中，然后緊至硅膠高度不再42濕式加樣：把樣品溶解在少量低極性溶劑中，傾入柱頂后，樣品均勻地吸附在吸附劑的表面，然后用不同的溶劑作洗脫展開。樣品上柱？濕式加樣：樣品上柱？43濕式加樣：*切忌以強(qiáng)極性溶劑或非均相的懸濁體系樣品直接加入注中，這將導(dǎo)致分離實(shí)驗(yàn)的失敗。樣品上柱？濕式加樣：樣品上柱？44干式加樣:將樣品選擇適宜的溶劑溶解，并加入適量的吸附劑充分?jǐn)嚢杈鶆颍軇]發(fā)盡，加適量的流動(dòng)相拌勻再上柱或直接加到柱頂。一般可保持較高的柱效率和實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性。樣品上柱？干式加樣:樣品上柱？45天然藥物提取工藝課件-色譜分離技術(shù)46f.硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析，如酚類、甾體和萜類等。分離效率與其粒度、孔徑、和表面積有關(guān)粒度越小，均勻性越好，分離效率越高；硅膠表面積越大，與樣品之間的相互作用越強(qiáng)，吸附力越強(qiáng)f.硅膠是一種酸性吸附劑，47同時(shí)硅膠又是一種弱酸性陽(yáng)離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當(dāng)遇到較強(qiáng)的堿性化合物，則可因離子交換反應(yīng)而吸附堿性化合物。同時(shí)硅膠又是一種弱酸性陽(yáng)離子交換劑，483.活性炭a.是一種非極性吸附劑。具有非極性的表面b.活性炭主要用于分離水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙。活性炭為吸附作用，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時(shí)，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加。3.活性炭a.是一種非極性吸附劑。具有非極性的表面493.活性炭c.活性炭對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，對(duì)大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。吸附力不容易控制，也沒(méi)有測(cè)定級(jí)別的理想方法，應(yīng)用受到限制。3.活性炭c.活性炭對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，504.聚酰胺a.聚酰胺是由有機(jī)酸和有機(jī)胺經(jīng)聚而成的高分子材料，俗稱尼龍、錦綸。吸附屬于氫鍵吸附，是一種用途十分廣泛的分離方法，極性物質(zhì)和非極性物質(zhì)都適用。b.它的化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，除了在濃HCl，熱甲酸和苯酚等溶劑中可溶解外，不溶于水、醉、丙酮、氯仿、苯、正己烷等各種極性的與非極性的溶劑中。4.聚酰胺a.聚酰胺是由有機(jī)酸和有機(jī)胺經(jīng)聚而成的高分子材料，51聚酰胺的色譜分離機(jī)理比較復(fù)雜。鏈狀的聚酰胺分子上有許多酰胺基團(tuán)，形成活性中心。在非水體系溶劑中它和弱極性分子相互作用，主要表現(xiàn)出吸附色譜的性能，溶劑的洗脫能力從極性小到大而遞增。

c.分離機(jī)理：聚酰胺的色譜分離機(jī)理比較復(fù)雜。鏈狀的聚酰胺分子上有許多酰胺基52但是在極性溶劑和水溶液中，由于酰胺基能與酸、酮、酮、醇、酚及胺等化合物生成氫鍵，因此對(duì)這類化合物，以生成氫鍵能力的強(qiáng)弱而實(shí)現(xiàn)選擇性的分離。

c.分離機(jī)理：但是在極性溶劑和水溶液中，由于酰胺基能與酸、酮、酮、醇、酚及53由于聚酰胺對(duì)物質(zhì)的分離機(jī)理與硅膠等吸附色譜法不同，所選用的展開劑與洗脫劑也不相同。它對(duì)水溶液中樣品的吸附能力最大，即水是洗脫能力最差的溶劑；有機(jī)溶劑醇、丙酮和堿性溶液、甲酰胺等，使酰胺分子生成氫鍵的能力減弱，所以其洗脫能力強(qiáng)。由于聚酰胺對(duì)物質(zhì)的分離機(jī)理與硅膠等吸附色譜法不同，所選用的展54溶劑洗脫能力的順序是：

水＜乙醇＜甲醇＜丙酮＜稀堿(NH4OH)溶液＜甲酰胺＜DMF由于在水溶液中，對(duì)極性有機(jī)物的吸附能力強(qiáng)，恰好利用此性質(zhì)，可對(duì)水中微量強(qiáng)極性有機(jī)物進(jìn)行吸附、富集和分離。溶劑洗脫能力的順序是：55聚酰胺色譜的應(yīng)用聚酰胺對(duì)一般酚類、黃酮類化合物的吸附是可逆的（鞣質(zhì)除外），分離效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色譜特別適合于該類化合物的制備分離。聚酰胺色譜的應(yīng)用聚酰胺對(duì)一般酚類、黃酮類化合物的吸附是可逆的56聚酰胺色譜的應(yīng)用對(duì)生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等其它極性與非極性化合物的分離也有廣泛的用途。聚酰胺色譜的應(yīng)用對(duì)生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等其它極性57聚酰胺色譜的應(yīng)用因?yàn)閷?duì)鞣質(zhì)的吸附特強(qiáng)，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脫鞣質(zhì)處理特別適宜。聚酰胺色譜有薄層色譜和柱色譜兩種方式。聚酰胺色譜的應(yīng)用因?yàn)閷?duì)鞣質(zhì)的吸附特強(qiáng)，近乎不可逆，故用于植物58（二）吸附層析固定相的選擇固定相選擇的原則：主要依據(jù)被分離對(duì)象的性質(zhì)、

分離的目的、固定相的性質(zhì)決定。（二）吸附層析固定相的選擇固定相選擇的原則：59樣品的溶解性：一般情況下，水溶解樣品如糖類等，采用活性炭分離；黃酮類主要用聚酰胺分離；絕大多數(shù)有機(jī)化合物用硅膠和氧化鋁作為固定相分離。被分離對(duì)象的考慮因素包括：樣品的溶解性：被分離對(duì)象的考慮因素包括：60樣品的酸堿性：硅膠略帶酸性，適用中性和酸性物質(zhì)分離；堿性物質(zhì)與硅膠作用，易被吸附，分離效果差。氧化鋁略帶堿性，適用堿性和中性物質(zhì)分離；酸性物質(zhì)與其吸附較牢，分離效果差。被分離對(duì)象的考慮因素包括：樣品的酸堿性：被分離對(duì)象的考慮因素包括：61化合物的極性化合物的極性取決于其分子中的官能團(tuán)的極性和分子結(jié)構(gòu)，物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，其極性不同。通常極性大的物質(zhì)吸附能力強(qiáng)，應(yīng)根據(jù)化合物極性的不同選擇不同的分離介質(zhì)進(jìn)行分離。

被分離對(duì)象的考慮因素：化合物的極性被分離對(duì)象的考慮因素：62官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱官能團(tuán)極性R-COOH大Ar-OHR-OHR-NH2,R-NH-R’,R-N-R`2R-CO-NR2R-CHOR-CO-R’R-CO-OR’R-O-R’小官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱官能團(tuán)極性R-COOH大Ar-OHR-OHR63吸附劑對(duì)組分的作用：選用的固定相必須和待分離對(duì)象不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或不對(duì)被吸附分離的物質(zhì)有破壞作用。如，酸性的硅膠不適合分離堿性物質(zhì)；堿性氧化鋁不能用來(lái)分離酸性的酚類物質(zhì)和黃酮類化合物等。

被分離對(duì)象的考慮因素：吸附劑對(duì)組分的作用：被分離對(duì)象的考慮因素：64（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇在吸附柱層析分離中的流動(dòng)相，在薄層層析中的展開劑，由單一或混合溶劑構(gòu)成。吸附層析過(guò)程實(shí)際上是組分分子與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)占據(jù)吸附劑表面活性中心的過(guò)程。（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇在吸附柱層析分離中的流動(dòng)相，在薄層65（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇所用流動(dòng)相的選擇應(yīng)同時(shí)考慮被分離物質(zhì)的性質(zhì)、吸附劑的活性、展開劑的極性三個(gè)因素。（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇所用流動(dòng)相的選擇應(yīng)同時(shí)考慮66（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇分離極性較強(qiáng)的組分時(shí)：選用吸附劑活性較低的吸附劑，以極性較強(qiáng)的流動(dòng)相洗脫；分離極性較弱的組分時(shí)：選用吸附劑活性較高的吸附劑，以極性較弱的流動(dòng)相洗脫。（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇分離極性較強(qiáng)的組分時(shí)：67易揮發(fā)，毒性小的溶劑，以便于除去溶劑，回收樣品。同時(shí)必須注意溶劑對(duì)樣品中的各種組分以及與吸附劑之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。洗脫液中各餾分的監(jiān)測(cè)．一般采用間斷式定體積收集流出掖，控制流速1-3滴/秒。流動(dòng)溶劑應(yīng)盡量選擇：易揮發(fā)，流動(dòng)溶劑應(yīng)盡量選擇：68以吸附原理為主的硅膠柱，流動(dòng)相的選擇，一般按溶劑的極性由小到大順序加入。常用的有機(jī)溶劑極性由小到大的順序排列：

正己烷＜石油醚＜環(huán)己烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙醋＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水＜乙酸＜甲酸。以吸附原理為主的硅膠柱，流動(dòng)相的選擇，一般按溶劑的極性由小到69（四）吸附層析操作技術(shù)按其操作方式分為：

柱層析薄層層析經(jīng)典的柱層析法：由于樣品容量大，主要用于天然產(chǎn)物的制備分離；薄層層析：更適用于分離分析或少量樣品的分離制備。（四）吸附層析操作技術(shù)按其操作方式分為：70（四）吸附層析操作技術(shù)柱層析：將作為固定相的吸附劑裝在一根層析柱中，從管頂加入流動(dòng)相。使流動(dòng)相由上往下流過(guò)而使各種成分分離并依次流出層析柱的過(guò)程稱為洗脫。在洗脫時(shí)，可在柱的下端依次收集洗脫液進(jìn)行檢查。（四）吸附層析操作技術(shù)柱層析：71柱層析的基本操作:(1)裝柱裝柱的要求：柱子裝得均勻，不能分層，不能有氣泡等否則要重新裝柱；柱子的選擇：柱子的直徑和分離目的而定。一般柱子的直徑:長(zhǎng)度約為1:(10-50);且洗滌干凈；柱層析的基本操作:(1)裝柱72裝柱過(guò)程：關(guān)閉層析柱出水口，裝入1/3柱高的溶劑作緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢倒入柱中，使其沉降約3cm高。打開出水口，控制適當(dāng)流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液（吸附劑的多少根據(jù)樣品的多少而定）。注意：不可干柱、分層，否則需要重新裝柱。裝柱過(guò)程：73柱層析的基本操作:(2)平衡柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強(qiáng)度）平衡柱子。方法：用恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時(shí)的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3-5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。柱層析的基本操作:(2)平衡74柱層析的基本操作:(3)加樣

加樣量的多少直接影響分離的效果。加樣量應(yīng)少于20％的操作容量，體積應(yīng)低于5％的床體積，對(duì)于分析柱層析，一般不超過(guò)床體積的1％。加樣時(shí)應(yīng)緩慢小心將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質(zhì)，以保證基質(zhì)表面平坦。柱層析的基本操作:(3)加樣75柱層析的基本操作

(4)洗脫

【洗脫時(shí)切勿使溶劑流干！】洗脫的方式分為：

簡(jiǎn)單洗脫、分步洗脫、梯度洗脫。柱層析的基本操作(4)洗脫76柱層析的基本操作簡(jiǎn)單洗脫：

始終是用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過(guò)程結(jié)束。適合被分離物質(zhì)對(duì)固定相的親和力差異不大，區(qū)帶的洗脫時(shí)間間隔不長(zhǎng)。柱層析的基本操作簡(jiǎn)單洗脫：77柱層析的基本操作分步洗脫：按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進(jìn)行逐級(jí)洗脫。適合混合物組成簡(jiǎn)單，各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離。柱層析的基本操作分步洗脫：78柱層析的基本操作梯度洗脫：洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可是濃度、極性、離子強(qiáng)度和pH等最常用的是濃度梯度?；旌衔镏懈鹘M分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時(shí)可用。柱層析的基本操作梯度洗脫：79柱層析的基本操作:(5)收集、鑒定及保存由于檢測(cè)系統(tǒng)的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個(gè)純凈的組分。每管的收集量不能太多，一般5ml左右；如分離的物質(zhì)性質(zhì)相似，收集更少量/管。在合并一個(gè)峰的各管溶液之前，還要進(jìn)行鑒定。柱層析的基本操作:(5)收集、鑒定及保存80柱層析的基本操作:(6)基質(zhì)的再生許多基質(zhì)可用反復(fù)使用多次，可回收處理后再用，各種基質(zhì)的再生方法都有各自的方法，根據(jù)不同的處理方法處理基質(zhì)再生。柱層析的基本操作:(6)基質(zhì)的再生81如：聚酰胺柱的再生待樣品中各組分從柱中洗脫后，再進(jìn)一步用甲醇：氨水(1:1)充分洗滌柱子，將柱中吸附殘留的樣品全部解吸；再換用pH3-4的HCl水溶液通過(guò)柱子，使聚酰胺恢復(fù)原有的活性，重復(fù)使用。如：聚酰胺柱的再生待樣品中各組分從柱中洗脫后，82如：聚酰胺柱的再生在以制備分離為目的的實(shí)驗(yàn)中，調(diào)節(jié)溶液的PH值盡量采用稀NaOH和HCl，以免樣品中引進(jìn)其他的陽(yáng)離子和陰離子，對(duì)樣品的紅外圖譜產(chǎn)生干擾。如用NH4OH溶液調(diào)節(jié)pH時(shí)，在樣品中引入了NH4＋離子，在紅外圖1400cm-1處會(huì)出現(xiàn)一尖銳的強(qiáng)蜂，干擾了樣品的紅外圖譜。如：聚酰胺柱的再生在以制備分離為目的的實(shí)驗(yàn)中，83（五）吸附薄層層析薄層層析：簡(jiǎn)便、快速、微量的層析方法。一般將吸附劑涂布到平面如玻璃片上，形成一薄層固定相，在一個(gè)以展開劑飽和的密閉容器內(nèi)，展開劑依靠固定相的毛細(xì)作用和固定相作相對(duì)移動(dòng)，使物質(zhì)發(fā)生分離；這種方法稱薄層層析。（五）吸附薄層層析薄層層析：簡(jiǎn)便、快速、微量的層析方法。84（五）吸附薄層層析薄層層析用的吸附劑與其選擇原則：和柱層析相同，主要區(qū)別在于：薄層層析要求吸附劑的粒度更細(xì)，一般應(yīng)小于10um，粒度均勻用于薄層層析的吸附劑或預(yù)制薄層一般活度要求不宜過(guò)高，以II－III級(jí)為宜。（五）吸附薄層層析薄層層析用的吸附劑與其選擇原則：85（五）吸附薄層層析薄層層析用的展開劑：展開距離隨薄層的粒度粗細(xì)而定；粒度越細(xì)，展開距離相應(yīng)縮短；一般不超過(guò)10cm，否則影響分離效果；（五）吸附薄層層析薄層層析用的展開劑：86（五）吸附薄層層析薄層層析用的展開劑：當(dāng)吸附劑的活度一定時(shí)，多組分樣品的分離取決于展開劑的選擇。中草藥化學(xué)成分在脂溶性成分中大致分為：無(wú)極性、弱極性、中極性與強(qiáng)極性（五）吸附薄層層析薄層層析用的展開劑：87薄層層析薄層層析88特殊薄層

對(duì)于某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，需要采用一些特殊薄層,包括：①熒光薄層②絡(luò)合薄層③酸堿薄層和PH緩沖薄層

特殊薄層對(duì)于某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，需要采用一些89①熒光薄層原因：有些化合物本身無(wú)色，在紫外燈下也不顯熒光，又無(wú)適當(dāng)?shù)娘@色劑；①熒光薄層原因：90①熒光薄層處理：可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光薄層進(jìn)行層析。展層后置于紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點(diǎn)處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。①熒光薄層處理：91①熒光薄層常用的熒光物質(zhì)多為無(wú)機(jī)物。其一是在254nm紫外光激發(fā)下顯出熒光的，如錳激化的硅酸鋅。另一種為在365nm紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光如銀激化的硫化鋅、硫化鋯。

①熒光薄層常用的熒光物質(zhì)多為無(wú)機(jī)物。92②絡(luò)合薄層常用的有硝酸銀薄層，用來(lái)分離碳原子數(shù)相等而其中C=C雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等。②絡(luò)合薄層常用的有硝酸銀薄層，93②絡(luò)合薄層其主要機(jī)理由于C=C鍵能與硝酸銀形成絡(luò)合物，而飽和的C-C鍵則不與硝酸銀絡(luò)合。因此在硝酸銀薄層上，化合物可由于飽和程度不同而獲得分離。②絡(luò)合薄層其主要機(jī)理94②絡(luò)合薄層層析時(shí)：飽和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一個(gè)雙鍵的較含兩個(gè)雙鍵的Rf值高，含一個(gè)三鍵的較含一個(gè)雙鍵的Rf值高。在一個(gè)雙鍵化合物中，順式的與硝酸銀絡(luò)合較反式的易于進(jìn)行。因此，還可用來(lái)分離順?lè)串悩?gòu)體。

②絡(luò)合薄層層析時(shí)：95③酸堿薄層和pH緩沖薄層改變吸附劑原來(lái)的酸堿性，可在鋪制薄層時(shí)采用稀酸或稀堿以代替水調(diào)制薄層。如硅膠帶微酸性：有時(shí)對(duì)堿性物質(zhì)如生物堿的分離不好，如不能展層或拖尾可在鋪薄層時(shí)，用稀堿溶液0.1～0.5NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。③酸堿薄層和pH緩沖薄層改變吸附劑原來(lái)的酸堿性，可在鋪制薄96

（4）薄層層析法應(yīng)用①化學(xué)成分的預(yù)試②化學(xué)成分的鑒定③探索柱層分離的條件（4）薄層層析法應(yīng)用①化學(xué)成分的預(yù)試97①化學(xué)成分的預(yù)試用薄層層析法進(jìn)行中草藥化學(xué)成分預(yù)試，可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件，有針對(duì)性地進(jìn)行。由于在薄層上展層后，可將一些雜質(zhì)分離，選擇性高，可使預(yù)試結(jié)果更為可靠。①化學(xué)成分的預(yù)試用薄層層析法進(jìn)行中草藥化學(xué)成分預(yù)試，98②化學(xué)成分的鑒定以薄層層析法進(jìn)中草藥化學(xué)成分鑒定，最好要有標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行共薄層層析。如用數(shù)種溶劑展層后，標(biāo)準(zhǔn)品和鑒定品的Rf值、斑點(diǎn)形狀顏色都完全相同，則可作初步結(jié)論是同一化合物。但一般需進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對(duì)。

②化學(xué)成分的鑒定以薄層層析法進(jìn)中草藥化學(xué)成分鑒定，最好要有99③探索柱層分離的條件在進(jìn)行柱層分離時(shí)：首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑。在洗脫過(guò)程中各個(gè)成分將按何種順序被洗脫，每一洗脫液中是否為單一成分或混合體，③探索柱層分離的條件在進(jìn)行柱層分離時(shí)：100③探索柱層分離的條件均可由薄層的分離得到判斷與檢驗(yàn)。通過(guò)薄層的預(yù)分離，還可以了解多組分樣品的組成與相對(duì)含量。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件，即可將此條件用于干柱層析。

③探索柱層分離的條件均可由薄層的分離得到判斷與檢驗(yàn)。101中藥的薄層色譜分析中藥的薄層色譜分析102組分移動(dòng)的位置溶劑前沿RARxARf=RA/RxBCDRf值的范圍為0.35>Rf>0.15時(shí)，可達(dá)到分離目的組分移動(dòng)的位置溶劑前沿RARxARf=RA/RxBCDR103（5）制備薄層色譜PTLC

一種是流動(dòng)相靠毛細(xì)管作用力流經(jīng)固定相（傳統(tǒng)的制備型薄層薄層色譜）另一些方法是流動(dòng)相靠外力強(qiáng)制流動(dòng)，如離心薄層色譜和加壓薄層色譜。（5）制備薄層色譜PTLC一種是流動(dòng)相靠毛細(xì)管作用力流經(jīng)104（5）制備薄層色譜PTLC吸附劑:硅膠是最常用的吸附劑。上樣量與吸附劑的厚度有關(guān)。（5）制備薄層色譜PTLC吸附劑:105（5）制備薄層色譜PTLC

上樣:是進(jìn)行PTLC分離的一個(gè)最關(guān)鍵的步驟。上樣前先用樣品溶于少量溶劑，低揮發(fā)性溶劑可引起點(diǎn)樣帶變寬，最好選用揮發(fā)性溶劑（如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等）樣品濃度應(yīng)在5%-10%左右。點(diǎn)樣帶盡可能狹窄，以獲得更好的分離效果點(diǎn)樣可用手工進(jìn)行或自動(dòng)點(diǎn)樣儀。（5）制備薄層色譜PTLC上樣:是進(jìn)行PTLC分離的一106展開劑的選擇及展開:在進(jìn)行PTLC之前應(yīng)用分析型TLC預(yù)試驗(yàn)來(lái)確定展開劑。被分離物質(zhì)的回收：用合適溶劑溶解樣品，濃縮即可。展開劑的選擇及展開:107（六）大孔吸附樹脂大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，具有較好的吸附性能。它的吸附作用是通過(guò)表面吸附、表面電性或形成氫鍵。大孔樹脂吸附分離技術(shù)是采用特殊的吸附劑，選擇地吸附其中的有效成分，去除無(wú)效成分的一種提取精制的新工藝。（六）大孔吸附樹脂大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)人工合成108⑴大孔吸附樹脂的性質(zhì)大孔吸附樹脂多為白色的球狀顆粒．粒度多為20-60目，通常分為非極性、中性和極性三大類，根據(jù)極性大小還可分為弱極性、中等極性和強(qiáng)極性。常用的為苯乙烯型和丙烯腈型，在樹脂合成時(shí)根據(jù)需要引入極性基團(tuán)則成為極性樹脂從而增強(qiáng)吸附能力。⑴大孔吸附樹脂的性質(zhì)大孔吸附樹脂多為白色的球狀顆粒．粒度多109⑴大孔吸附樹脂的性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：大孔吸附樹脂的理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑。對(duì)有機(jī)物的選擇性較好，不受無(wú)機(jī)鹽類及強(qiáng)離子低分子化合物存在的影響。⑴大孔吸附樹脂的性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：110⑵大孔吸附樹脂的分離原理吸附性

范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。篩選原理

本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定。由于吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫而分開。

⑵大孔吸附樹脂的分離原理吸附性范德華引力或生成氫鍵的結(jié)111⑵大孔吸附樹脂的分離原理a.有機(jī)物與無(wú)機(jī)物的分離

一般的吸附樹脂對(duì)溶液中的無(wú)機(jī)離子沒(méi)有任何吸附能力，在吸附混合物時(shí)，有機(jī)物被樹脂吸附，無(wú)機(jī)離子則隨水流出，因而很容易將二者分離。在中藥成分的提取中，此特征使提取物中的重金屬和灼燒灰分降至要求的范圍內(nèi)。⑵大孔吸附樹脂的分離原理a.有機(jī)物與無(wú)機(jī)物的分離112b.解離物與非解離物的分離

吸附樹脂對(duì)有機(jī)解離物與非解離物的吸附能力有很大差異。因此，可將二者分離。如有機(jī)酸在高pH值成鹽，很難被吸附，因此在堿性條件下可把有機(jī)酸分離出來(lái)。

生物堿在酸性介質(zhì)中可以成鹽，因而能通過(guò)調(diào)節(jié)pH值進(jìn)行分離。b.解離物與非解離物的分離113一般有機(jī)物，包括大多數(shù)中藥有效成分，有一定的水溶性，但溶解度不大的物質(zhì)，這些物質(zhì)容易被樹脂吸附。強(qiáng)水溶性物質(zhì)如低級(jí)醇類、低級(jí)胺類、糖及多糖、多數(shù)氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)等，難被普通吸附樹脂吸附。用普通樹脂可很容易地將此兩類物質(zhì)分離。C.一般有機(jī)物與強(qiáng)水溶性物質(zhì)的分離一般有機(jī)物，包括大多數(shù)中藥有效成分，有一定的水溶性，但溶解度114（3）大孔吸附樹脂分離條件的確立1、樹脂的選擇首先，要根據(jù)被分離化合物的分子體積的大小通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適當(dāng)孔徑的樹脂。其次，要根據(jù)分子中是否含有酚羥基、羧基或堿性氮原子來(lái)確定樹脂的型號(hào)和分離條件。（3）大孔吸附樹脂分離條件的確立1、樹脂的選擇1152、洗脫液的選擇

對(duì)非極性大孔吸附樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)。對(duì)中等極性大孔樹脂和極性較大的化合物來(lái)說(shuō)，則用極性較大的洗脫劑為佳。根據(jù)吸附力強(qiáng)弱選用不同的洗脫劑及濃度。為達(dá)到滿意的效果，可通過(guò)幾種洗脫劑濃度的比較來(lái)確定最佳洗脫濃度。實(shí)際工作中甲醇、乙醇、丙酮應(yīng)用較多。2、洗脫液的選擇116⑸在中藥生產(chǎn)中應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)1、縮小劑量，提高制劑的內(nèi)在質(zhì)量

大孔吸附樹脂處理減少提取物中的雜質(zhì)提高效成分的含量，使制劑劑量減小，有利于制成現(xiàn)代劑型的中藥制劑，并便于質(zhì)量控制。⑸在中藥生產(chǎn)中應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)1、縮小劑量，提高制劑的內(nèi)在質(zhì)量1172、減小產(chǎn)品的吸濕性

傳統(tǒng)的提取方法所提的中成藥大部分具有較強(qiáng)的吸潮性，是中藥生產(chǎn)及儲(chǔ)藏中長(zhǎng)期存在的問(wèn)題。而經(jīng)大孔吸附樹脂處理可有效去除吸潮成分，增強(qiáng)產(chǎn)品的穩(wěn)定性。2、減小產(chǎn)品的吸濕性1183、有效去除重金屬

既保證了患者的用藥安全，同時(shí)也解決了中藥重金屬超標(biāo)的難題，為中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)創(chuàng)造了條件。3、有效去除重金屬119活性成分的提取分離

皂甙（人參總皂甙、蒺藜總皂昔）、黃酮（葛根總黃酮、山楂總黃酮等）、內(nèi)酯類生物堿等化合物；⑹大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中的應(yīng)用活性成分的提取分離⑹大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中的應(yīng)用120⑺大孔吸附樹脂的處理市售大孔吸附樹脂一般含有未聚合的單體、致孔劑（多為長(zhǎng)碳鏈的脂肪醇類）、分散劑和防腐劑等雜質(zhì)，使用前必須經(jīng)過(guò)處理。⑺大孔吸附樹脂的處理市售大孔吸附樹脂一般含有未聚合的單體、121⑺大孔吸附樹脂的處理處理方法是：采用乙醇濕法裝柱，隨用乙醇在柱上作流動(dòng)清洗，并不時(shí)檢查流出的乙醇，直至流出的乙醇液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象即可，然后用大量蒸餾水洗去乙醇。⑺大孔吸附樹脂的處理處理方法是：122⑻大孔吸附樹脂柱色譜樣品一般用水溶液上柱。洗脫時(shí)根據(jù)吸附作用強(qiáng)弱不同，選用不同濃度的甲醇、乙醇等含水溶劑，直至純的甲醇、乙醇，乃至丙酮、乙酸乙酯等。對(duì)非極性大孔吸附樹脂，洗脫溶劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)。對(duì)于中等極性的大孔吸附樹脂和極性較大的化合物來(lái)說(shuō)，則以用極性較大的溶劑為宜。

⑻大孔吸附樹脂柱色譜樣品一般用水溶液上柱。123根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離天然有機(jī)化合物分子大小各異，中藥的化學(xué)成分非常復(fù)雜，通常含有無(wú)機(jī)鹽、生物堿、氨基酸和有機(jī)酸、酚類、酮類、皂昔、甾族和萜類化合物以及蛋白質(zhì)、多糖、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、淀粉、纖維素、無(wú)機(jī)鹽等。相對(duì)分子質(zhì)量的分布很寬，從幾十到幾百萬(wàn)道爾頓。故可據(jù)此進(jìn)行分離。下表列出部分中藥所含主要成分的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離天然有機(jī)化合物分子大小各異，124部分中藥主要成分的相對(duì)分子質(zhì)量

部分中藥主要成分的相對(duì)分子質(zhì)量125三、分配色譜

(partitionchromatography)三、分配色譜

(partitionchromatogra126三、分配色譜

(partitionchromatography)分配色譜是利用各組分的分配系數(shù)不同而予以分離的方法。分配色譜中，通常采用一種多孔性固體支持物吸著一種溶劑作為固定相，另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可以沿固定相流動(dòng)，稱為流動(dòng)相。三、分配色譜(partitionchromatograp127三、分配色譜

(partitionchromatography)當(dāng)某溶質(zhì)在流動(dòng)相的帶動(dòng)下流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分配，由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動(dòng)速率也就不相同，從而達(dá)到分離的目的。

三、分配色譜(partitionchromatograp128三、分配色譜

(partitionchromatography)分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值。在色譜條件確定后分配系數(shù)是一常數(shù)，以K表示。三、分配色譜(partitionchromatograp129分配色譜法按照固定相與流動(dòng)相的極性差別分為:正相色譜法反相色譜法分配色譜法130正相色譜法：在正相分配色譜法中，流動(dòng)相的極性小于固定相極性。常用的固定相有氰基與氨基鍵合相，主要用于分離極性及中等極性的分子型物質(zhì)。正相色譜法：在正相分配色譜法中，131反相色譜法：在反相分配色譜法中，流動(dòng)相的極性大于固定相極性。常用的固定相有十八烷基硅烷（ODS）或C8鍵合相。流動(dòng)相常用甲醇-水或乙腈-水。主要用于分離非極性及中等極性的各類分子型化合物。中藥中的各種苷類特別適合用反相色譜法分離。

反相色譜法：在反相分配色譜法中，1322、反相分配色譜(reversephasepartitionchromatography)（1）固定相：石蠟油等弱極性有機(jī)溶劑。（2）流動(dòng)相：水、甲醇等強(qiáng)極性有機(jī)溶劑（3）應(yīng)用：適合于分離脂溶性化合物，如高級(jí)脂肪酸、油脂、游離甾體等。2、反相分配色譜133親油性表面親水性表面硅膠化學(xué)修飾反相色譜是應(yīng)用最廣的色譜法，因?yàn)殒I合相表面的官能團(tuán)不會(huì)流失，流動(dòng)相的極性可以在很大的范圍調(diào)整，再加之由它派生的反相離子對(duì)色譜法和離子抑制色譜法，可以分離有機(jī)酸、堿、鹽等離子型化合物。高效液相色譜（HPLC）最常用的即是反相填料。親油性表面親水性表面硅膠化學(xué)修飾反相色譜是應(yīng)用最廣的色譜法，134第五節(jié)色譜分離技術(shù)第五節(jié)色譜分離技術(shù)135特點(diǎn)色譜分離技術(shù)最大的特點(diǎn)：分離效率高能分離各種性質(zhì)極其類似的物質(zhì)；應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)的分析鑒定的同時(shí)，可用于大量物質(zhì)的分離純化制備；

如：胰島素注射藥品——以凝膠色譜去除胰島素中的二聚體特點(diǎn)色譜分離技術(shù)最大的特點(diǎn)：分離效率高136什么叫作色譜法：色譜法（chromatography）又稱層析法，是利用混合物中各個(gè)組分的化學(xué)、物理性質(zhì)的差異，基于被分離物質(zhì)分子在兩相（一為固定相，一為流動(dòng)相）中分配系數(shù)的微小差別進(jìn)行分離。一、色譜分離技術(shù)的基本概念與理論什么叫作色譜法：一、色譜分離技術(shù)的基本概念與理論137什么叫作色譜法：對(duì)一些結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似化合物的分離，用經(jīng)典的萃取法、沉淀法和結(jié)晶法等難以達(dá)到分離目的時(shí)，用色譜法往往可以收到很好的分離效果。一、色譜分離技術(shù)的基本概念與理論什么叫作色譜法：一、色譜分離技術(shù)的基本概念與理論138色譜分離過(guò)程：被分離的各組分受到固定相的作用力不同（吸附、分配、分子間氫鍵結(jié)合力等）；在流動(dòng)相與固定相發(fā)生相對(duì)移動(dòng)過(guò)程中，當(dāng)待分離的混合物通過(guò)固定相時(shí)，由于各組分的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生作用的能力不同，在兩相中的分配不同；色譜分離技術(shù)的原理：色譜分離過(guò)程：色譜分離技術(shù)的原理：139

色譜分離過(guò)程：與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯越小，向前移動(dòng)的速度快，反之，與固定相相互作用力越強(qiáng)的組分，向前移動(dòng)的速度越慢；進(jìn)行分部收集流出液，即可得到各單一組分，達(dá)到分離目的。色譜分離技術(shù)的原理：色譜分離過(guò)程：色譜分離技術(shù)的原理：140固定相流動(dòng)相色譜柱被分離組分固定相141天然藥物提取工藝課件-色譜分離技術(shù)142是色譜分離過(guò)程的一個(gè)固定介質(zhì)?？梢允枪腆w物質(zhì)(如吸附劑、凝膠、離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠、纖維素或樹脂上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附、分配、溶解、交換等作用；它對(duì)色譜分離的效果起著關(guān)鍵的作用。1.固定相是色譜分離過(guò)程的一個(gè)固定介質(zhì)。1.固定相143在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界流體等都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析稱為展層劑。它是層析分離中的重要影響因素之一。2.流動(dòng)相在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體144保留時(shí)間待分離物質(zhì)從進(jìn)樣開始到組分流出濃度最大時(shí)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間，稱為該組分的色譜保留時(shí)間，用tR表示。保留體積待分離物質(zhì)從進(jìn)樣開始到組分流出濃度最大時(shí)所用洗脫液的體積，稱為該組分的保留體積，用vR表示。3.保留時(shí)間和保留體積保留時(shí)間待分離物質(zhì)從進(jìn)樣開始到組分流出濃度最大時(shí)所經(jīng)過(guò)的145死時(shí)間非保留溶質(zhì)從進(jìn)樣開始到流出色譜柱所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為死時(shí)間；用t0表示；死體積

非保留溶質(zhì)從進(jìn)樣開始到流出色譜柱所用的洗脫液的體積，稱為死體積；用v0表示。4.死時(shí)間和死體積死時(shí)間非保留溶質(zhì)從進(jìn)樣開始到流出色譜柱所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為146調(diào)整保留時(shí)間

某種物質(zhì)扣除死時(shí)間后的在色譜柱上的保留時(shí)間稱為該物質(zhì)的調(diào)整保留時(shí)間；調(diào)整保留體積

某種物質(zhì)扣除死體積后的在色譜柱上洗脫所用的洗脫劑的體積稱為該物質(zhì)的調(diào)整保留體積。5.調(diào)整保留時(shí)間和調(diào)整保留時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間某種物質(zhì)扣除死時(shí)間后的在色譜柱上的保留時(shí)間稱為1476.容量因子

表示某一溶質(zhì)在色譜柱中任意位置達(dá)到平衡后，該溶質(zhì)在固定相中量和在流動(dòng)相中的量之比。7.塔板理論

色譜柱的理論塔板數(shù)越大，塔板高度越小，色譜柱的分離效率越高。6.容量因子1488.分配系數(shù)

在一定的條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中含量（濃度）的比值，常用K表示。9.遷移率（比移值）在一定條件下，在相同的時(shí)間內(nèi)某一組分在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相本身移動(dòng)的距離之比值，常用Rf表示。8.分配系數(shù)在一定的條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中含14910.分辨率（分離度）11.操作容量（交換容量）

在一定條件下，某種組分與固定相反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在固定相上的飽和容量。操作容量大，與固定相的親和力越大，加入樣量可越大。反之，相反。10.分辨率（分離度）150正相色譜：是指固定相的極性高于流動(dòng)相在層析過(guò)程中，非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動(dòng)的速度快，先從柱中洗脫出。12.正相色譜和反相色譜正相色譜：是指固定相的極性高于流動(dòng)相12.正相色譜和反相色151反相色譜：是指固定相的極性低于流動(dòng)相在層析過(guò)程中，極性大的分子比極性小的分子移動(dòng)的速度快，而先從柱中洗脫流出。12.正相色譜和反相色譜12.正相色譜和反相色譜152根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以分為多類：

A.根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類：

紙層析：

以濾紙為基質(zhì)；

薄層層析：是將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進(jìn)行層析；柱層析：

將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進(jìn)行層析。13.層析法的分類根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以分為多類：13.層析法的分類153B.根據(jù)流動(dòng)相的形式分類：液相層析：流動(dòng)相為液體的層析；

氣相層析：流動(dòng)相為氣體的層析；13.層析法的分類B.根據(jù)流動(dòng)相的形式分類：13.層析法的分類154吸附層析：以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間的吸附力不同達(dá)到分離目的；分配層析：是根據(jù)在一個(gè)由兩相同時(shí)存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的；C.根據(jù)分離原理的不同分類：吸附層析：C.根據(jù)分離原理的不同分類：155凝膠過(guò)濾層析：以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析方法；離子交換層析：

以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的一種層析方法；C.根據(jù)分離原理的不同分類：凝膠過(guò)濾層析：C.根據(jù)分離原理的不同分類：156親和層析：

根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對(duì)能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析分離。C.根據(jù)分離原理的不同分類：親和層析：C.根據(jù)分離原理的不同分類：157色譜法

液相色譜法

氣相色譜法平板色譜法

柱色譜法紙色譜法氣液色譜法氣固色譜法分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法排阻色譜法

超臨界流體色譜法親和色譜法薄層色譜法色譜法液相色譜法氣相色譜法平板色譜法柱色譜法紙氣氣分吸158二、吸附色譜法

(adsorptionchromatography)

1.原理：吸附色譜為色譜固定相與流動(dòng)相在相對(duì)移動(dòng)過(guò)程中，溶質(zhì)和溶劑分子在吸附劑表面上的活性位點(diǎn)相互競(jìng)爭(zhēng)的吸附過(guò)程。簡(jiǎn)單的說(shuō):依據(jù)吸附劑對(duì)混合物中各成分吸附性能的不同，使各成分得到分離。

二、吸附色譜法(adsorptionchromat159在天然有機(jī)化合物分離及精制工作中，吸附現(xiàn)象利用得十分廣泛。其中又以固-液吸附用得最多.2.常用吸附劑：

硅膠、氧化鋁、活性炭、聚酰胺.

在天然有機(jī)化合物分離及精制工作中，吸附現(xiàn)象利用得十分廣泛。其1603.固-液吸附可分為:

①物理吸附(表面吸附)：

硅膠、氧化鋁及活性炭②化學(xué)吸附③半化學(xué)吸附：聚酰胺層析3.固-液吸附可分為:1614.物理吸附的特點(diǎn)：①無(wú)選擇性;②吸附與解吸是可逆的;③速度快;④實(shí)際應(yīng)用最多。5.化學(xué)吸附的特點(diǎn)：①具有選擇性；②吸附十分牢固,有時(shí)甚至是不可逆的。③化學(xué)吸附用得少.4.物理吸附的特點(diǎn)：1626.半化學(xué)吸附的特點(diǎn)：

①介于物理吸附與化學(xué)吸附之間的吸附過(guò)程，其吸附力較弱。②半化學(xué)吸附有一定應(yīng)用價(jià)值。如:聚酰胺與黃酮類、醌類等酚性化合物之間的氫鍵吸附屬于半化學(xué)吸附。6.半化學(xué)吸附的特點(diǎn)：163液-固物理吸附色譜是運(yùn)用較多的一種方法，

特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1000的低揮發(fā)性樣品）的分離，

尤其是脂溶性成分。

一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水性化合物等的分離。液-固物理吸附色譜是運(yùn)用較多的一種方法，164吸附色譜的分離效果，決定于吸附劑、溶劑、被分離化合物的性質(zhì)這三個(gè)因素。吸附色譜的分離效果，決定于165天然藥物提取工藝課件-色譜分離技術(shù)166（一）吸附色譜分離中常用的固定相1.氧化鋁：是由氫氧化鋁直接在高溫下脫水制得,因在制備方法和處理方法的差別有堿性中性酸性（一）吸附色譜分離中常用的固定相1.氧化鋁：167（一）吸附色譜分離中常用的固定相堿性氧化鋁pH9-10：適合分離堿性和中性成分，如生物堿；中性氧化鋁pH7.5：適合生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體等化合物；酸性氧化鋁pH4-5：適合酸性物質(zhì)，如酸性色素、

某些氨基酸等；（一）吸附色譜分離中常用的固定相堿性氧化鋁pH9-10：168氧化鋁的吸附機(jī)理：表面上有鋁醇基（Al-OH）羥基的氫鍵作用而吸附化學(xué)物質(zhì)。氧化鋁的吸附機(jī)理：169氧化鋁的活性與含水量密切相關(guān)：活化：在高溫下去除水分，含水量低，活性增強(qiáng)，稱為活化；去活化：加入一定量的水，含水量高，活性降低，稱為去活化。氧化鋁的活性與含水量密切相關(guān)：170a.硅膠，通常用SiO2·xH2O表示，是一種堅(jiān)硬、無(wú)定型鏈狀和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的硅酸聚合物顆粒，約90％的分離工作都可選用硅膠作為吸附劑。2.硅膠a.硅膠，通常用SiO2·xH2O表示，是一種堅(jiān)硬、無(wú)定171b.具有硅氧交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，表面有許多的硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是硅膠具有吸附能力的活性基團(tuán)。c.被分離物質(zhì)由于極性和不飽和程度不同和硅醇基相互作用的程度不同而達(dá)到分離目的。2.硅膠b.具有硅氧交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，表面有許多的硅醇基的多孔性微粒。硅172d.硅膠的羥基存在于硅膠表面較小的空穴中，因此空穴較小而比表面積大的硅膠吸附性能力強(qiáng)。水能與硅膠表面的羥基結(jié)合成水合硅醇基而使得硅膠失去活性；若將硅膠加熱到100℃左右加熱，水能可逆地除去。d.硅膠的羥基存在于硅膠表面較小的空穴中，因此空穴較小而比表173活化：將硅膠在100℃左右加熱，可去除部分水分，增強(qiáng)吸附能力。一般指將硅膠在110℃加熱30min，增強(qiáng)吸附能力，稱為活化。天然藥物提取工藝課件-色譜分離技術(shù)174濕法裝柱法：即將硅膠混懸于裝柱溶劑中，不斷攪拌，待內(nèi)中空氣泡除去后，連同溶劑一起傾入層析柱中，層析柱中硅膠段直徑與長(zhǎng)度之比一般為1:(20-30)。硅膠最好一次傾入，否則由于不同粒度大小的硅膠沉降速度不一、使硅膠柱有明顯的分段現(xiàn)象，影響分離結(jié)果。e.硅膠層析的裝柱：濕法裝柱法：即將硅膠混懸于裝柱溶劑中，不斷攪拌，待內(nèi)中空氣泡175干法裝柱：將所需硅膠一次性全部?jī)A入柱中，然后緊至硅膠高度不再變化即可。欲分離樣品與吸附劑的比例為1:(30-60)e.硅膠層析的裝柱：干法裝柱：將所需硅膠一次性全部?jī)A入柱中，然后緊至硅膠高度不再176濕式加樣：把樣品溶解在少量低極性溶劑中，傾入柱頂后，樣品均勻地吸附在吸附劑的表面，然后用不同的溶劑作洗脫展開。樣品上柱？濕式加樣：樣品上柱？177濕式加樣：*切忌以強(qiáng)極性溶劑或非均相的懸濁體系樣品直接加入注中，這將導(dǎo)致分離實(shí)驗(yàn)的失敗。樣品上柱？濕式加樣：樣品上柱？178干式加樣:將樣品選擇適宜的溶劑溶解，并加入適量的吸附劑充分?jǐn)嚢杈鶆?，溶劑揮發(fā)盡，加適量的流動(dòng)相拌勻再上柱或直接加到柱頂。一般可保持較高的柱效率和實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性。樣品上柱？干式加樣:樣品上柱？179天然藥物提取工藝課件-色譜分離技術(shù)180f.硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析，如酚類、甾體和萜類等。分離效率與其粒度、孔徑、和表面積有關(guān)粒度越小，均勻性越好，分離效率越高；硅膠表面積越大，與樣品之間的相互作用越強(qiáng)，吸附力越強(qiáng)f.硅膠是一種酸性吸附劑，181同時(shí)硅膠又是一種弱酸性陽(yáng)離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當(dāng)遇到較強(qiáng)的堿性化合物，則可因離子交換反應(yīng)而吸附堿性化合物。同時(shí)硅膠又是一種弱酸性陽(yáng)離子交換劑，1823.活性炭a.是一種非極性吸附劑。具有非極性的表面b.活性炭主要用于分離水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙。活性炭為吸附作用，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時(shí)，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加。3.活性炭a.是一種非極性吸附劑。具有非極性的表面1833.活性炭c.活性炭對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，對(duì)大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。吸附力不容易控制，也沒(méi)有測(cè)定級(jí)別的理想方法，應(yīng)用受到限制。3.活性炭c.活性炭對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，1844.聚酰胺a.聚酰胺是由有機(jī)酸和有機(jī)胺經(jīng)聚而成的高分子材料，俗稱尼龍、錦綸。吸附屬于氫鍵吸附，是一種用途十分廣泛的分離方法，極性物質(zhì)和非極性物質(zhì)都適用。b.它的化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，除了在濃HCl，熱甲酸和苯酚等溶劑中可溶解外，不溶于水、醉、丙酮、氯仿、苯、正己烷等各種極性的與非極性的溶劑中。4.聚酰胺a.聚酰胺是由有機(jī)酸和有機(jī)胺經(jīng)聚而成的高分子材料，185聚酰胺的色譜分離機(jī)理比較復(fù)雜。鏈狀的聚酰胺分子上有許多酰胺基團(tuán)，形成活性中心。在非水體系溶劑中它和弱極性分子相互作用，主要表現(xiàn)出吸附色譜的性能，溶劑的洗脫能力從極性小到大而遞增。

c.分離機(jī)理：聚酰胺的色譜分離機(jī)理比較復(fù)雜。鏈狀的聚酰胺分子上有許多酰胺基186但是在極性溶劑和水溶液中，由于酰胺基能與酸、酮、酮、醇、酚及胺等化合物生成氫鍵，因此對(duì)這類化合物，以生成氫鍵能力的強(qiáng)弱而實(shí)現(xiàn)選擇性的分離。

c.分離機(jī)理：但是在極性溶劑和水溶液中，由于酰胺基能與酸、酮、酮、醇、酚及187由于聚酰胺對(duì)物質(zhì)的分離機(jī)理與硅膠等吸附色譜法不同，所選用的展開劑與洗脫劑也不相同。它對(duì)水溶液中樣品的吸附能力最大，即水是洗脫能力最差的溶劑；有機(jī)溶劑醇、丙酮和堿性溶液、甲酰胺等，使酰胺分子生成氫鍵的能力減弱，所以其洗脫能力強(qiáng)。由于聚酰胺對(duì)物質(zhì)的分離機(jī)理與硅膠等吸附色譜法不同，所選用的展188溶劑洗脫能力的順序是：

水＜乙醇＜甲醇＜丙酮＜稀堿(NH4OH)溶液＜甲酰胺＜DMF由于在水溶液中，對(duì)極性有機(jī)物的吸附能力強(qiáng)，恰好利用此性質(zhì)，可對(duì)水中微量強(qiáng)極性有機(jī)物進(jìn)行吸附、富集和分離。溶劑洗脫能力的順序是：189聚酰胺色譜的應(yīng)用聚酰胺對(duì)一般酚類、黃酮類化合物的吸附是可逆的（鞣質(zhì)除外），分離效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色譜特別適合于該類化合物的制備分離。聚酰胺色譜的應(yīng)用聚酰胺對(duì)一般酚類、黃酮類化合物的吸附是可逆的190聚酰胺色譜的應(yīng)用對(duì)生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等其它極性與非極性化合物的分離也有廣泛的用途。聚酰胺色譜的應(yīng)用對(duì)生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等其它極性191聚酰胺色譜的應(yīng)用因?yàn)閷?duì)鞣質(zhì)的吸附特強(qiáng)，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脫鞣質(zhì)處理特別適宜。聚酰胺色譜有薄層色譜和柱色譜兩種方式。聚酰胺色譜的應(yīng)用因?yàn)閷?duì)鞣質(zhì)的吸附特強(qiáng)，近乎不可逆，故用于植物192（二）吸附層析固定相的選擇固定相選擇的原則：主要依據(jù)被分離對(duì)象的性質(zhì)、

分離的目的、固定相的性質(zhì)決定。（二）吸附層析固定相的選擇固定相選擇的原則：193樣品的溶解性：一般情況下，水溶解樣品如糖類等，采用活性炭分離；黃酮類主要用聚酰胺分離；絕大多數(shù)有機(jī)化合物用硅膠和氧化鋁作為固定相分離。被分離對(duì)象的考慮因素包括：樣品的溶解性：被分離對(duì)象的考慮因素包括：194樣品的酸堿性：硅膠略帶酸性，適用中性和酸性物質(zhì)分離；堿性物質(zhì)與硅膠作用，易被吸附，分離效果差。氧化鋁略帶堿性，適用堿性和中性物質(zhì)分離；酸性物質(zhì)與其吸附較牢，分離效果差。被分離對(duì)象的考慮因素包括：樣品的酸堿性：被分離對(duì)象的考慮因素包括：195化合物的極性化合物的極性取決于其分子中的官能團(tuán)的極性和分子結(jié)構(gòu)，物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，其極性不同。通常極性大的物質(zhì)吸附能力強(qiáng)，應(yīng)根據(jù)化合物極性的不同選擇不同的分離介質(zhì)進(jìn)行分離。

被分離對(duì)象的考慮因素：化合物的極性被分離對(duì)象的考慮因素：196官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱官能團(tuán)極性R-COOH大Ar-OHR-OHR-NH2,R-NH-R’,R-N-R`2R-CO-NR2R-CHOR-CO-R’R-CO-OR’R-O-R’小官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱官能團(tuán)極性R-COOH大Ar-OHR-OHR197吸附劑對(duì)組分的作用：選用的固定相必須和待分離對(duì)象不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或不對(duì)被吸附分離的物質(zhì)有破壞作用。如，酸性的硅膠不適合分離堿性物質(zhì)；堿性氧化鋁不能用來(lái)分離酸性的酚類物質(zhì)和黃酮類化合物等。

被分離對(duì)象的考慮因素：吸附劑對(duì)組分的作用：被分離對(duì)象的考慮因素：198（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇在吸附柱層析分離中的流動(dòng)相，在薄層層析中的展開劑，由單一或混合溶劑構(gòu)成。吸附層析過(guò)程實(shí)際上是組分分子與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)占據(jù)吸附劑表面活性中心的過(guò)程。（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇在吸附柱層析分離中的流動(dòng)相，在薄層199（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇所用流動(dòng)相的選擇應(yīng)同時(shí)考慮被分離物質(zhì)的性質(zhì)、吸附劑的活性、展開劑的極性三個(gè)因素。（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇所用流動(dòng)相的選擇應(yīng)同時(shí)考慮200（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇分離極性較強(qiáng)的組分時(shí)：選用吸附劑活性較低的吸附劑，以極性較強(qiáng)的流動(dòng)相洗脫；分離極性較弱的組分時(shí)：選用吸附劑活性較高的吸附劑，以極性較弱的流動(dòng)相洗脫。（三）吸附層析流動(dòng)相的選擇分離極性較強(qiáng)的組分時(shí)：201易揮發(fā)，毒性小的溶劑，以便于除去溶劑，回收樣品。同時(shí)必須注意溶劑對(duì)樣品中的各種組分以及與吸附劑之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。洗脫液中各餾分的監(jiān)測(cè)．一般采用間斷式定體積收集流出掖，控制流速1-3滴/秒。流動(dòng)溶劑應(yīng)盡量選擇：易揮發(fā)，流動(dòng)溶劑應(yīng)盡量選擇：202以吸附原理為主的硅膠柱，流動(dòng)相的選擇，一般按溶劑的極性由小到大順序加入。常用的有機(jī)溶劑極性由小到大的順序排列：

正己烷＜石油醚＜環(huán)己烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙醋＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水＜乙酸＜甲酸。以吸附原理為主的硅膠柱，流動(dòng)相的選擇，一般按溶劑的極性由小到203（四）吸附層析操作技術(shù)按其操作方式分為：

柱層析薄層層析經(jīng)典的柱層析法：由于樣品容量大，主要用于天然產(chǎn)物的制備分離；薄層層析：更適用于分離分析或少量樣品的分離制備。（四）吸附層析操作技術(shù)按其操作方式分為：204（四）吸附層析操作技術(shù)柱層析：將作為固定相的吸附劑裝在一根層析柱中，從管頂加入流動(dòng)相。使流動(dòng)相由上往下流過(guò)而使各種成分分離并依次流出層析柱的過(guò)程稱為洗脫。在洗脫時(shí)，可在柱的下端依次收集洗脫液進(jìn)行檢查。（四）吸附層析操作技術(shù)柱層析：205柱層析的基本操作:(1)裝柱裝柱的要求：柱子裝得均勻，不能分層，不能有氣泡等否則要重新裝柱；柱子的選擇：柱子的直徑和分離目的而定。一般柱子的直徑:長(zhǎng)度約為1:(10-50);且洗滌干凈；柱層析的基本操作:(1)裝柱206裝柱過(guò)程：關(guān)閉層析柱出水口，裝入1/3柱高的溶劑作緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢倒入柱中，使其沉降約3cm高。打開出水口，控制適當(dāng)流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液（吸附劑的多少根據(jù)樣品的多少而定）。注意：不可干柱、分層，否則需要重新裝柱。裝柱過(guò)程：207柱層析的基本操作:(2)平衡柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強(qiáng)度）平衡柱子。方法：用恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時(shí)的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3-5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。柱層析的基本操作:(2)平衡208柱層析的基本操作:(3)加樣

加樣量的多少直接影響分離的效果。加樣量應(yīng)少于20％的操作容量，體積應(yīng)低于5％的床體積，對(duì)于分析柱層析，一般不超過(guò)床體積的1％。加樣時(shí)應(yīng)緩慢小心將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質(zhì)，以保證基質(zhì)表面平坦。柱層析的基本操作:(3)加樣209柱層析的基本操作

(4)洗脫

【洗脫時(shí)切勿使溶劑流干！】洗脫的方式分為：

簡(jiǎn)單洗脫、分步洗脫、梯度洗脫。柱層析的基本操作(4)洗脫210柱層析的基本操作簡(jiǎn)單洗脫：

始終是用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過(guò)程結(jié)束。適合被分離物質(zhì)對(duì)固定相的親和力差異不大，區(qū)帶的洗脫時(shí)間間隔不長(zhǎng)。柱層析的基本操作簡(jiǎn)單洗脫：211柱層析的基本操作分步洗脫：按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進(jìn)行逐級(jí)洗脫。適合混合物組成簡(jiǎn)單，各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離。柱層析的基本操作分步洗脫：212柱層析的基本操作梯度洗脫：洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可是濃度、極性、離子強(qiáng)度和pH等最常用的是濃度梯度?；旌衔镏懈鹘M分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時(shí)可用。柱層析的基本操作梯度洗脫：213柱層析的基本操作:(5)收集、鑒定及保存由于檢測(cè)系統(tǒng)的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個(gè)純凈的組分。每管的收集量不能太多，一般5ml左右；如分離的物質(zhì)性質(zhì)相似，收集更少量/管。在合并一個(gè)峰的各管溶液之前，還要進(jìn)行鑒定。柱層析的基本操作:(5)收集、鑒定及保存214柱層析的基本操作:(6)基質(zhì)的再生許多基質(zhì)可用反復(fù)使用多次，可回收處理后再用，各種基質(zhì)的再生方法都有各自的方法，根據(jù)不同的處理方法處理基質(zhì)再生。柱層析的基本操作:(6)基質(zhì)的再生215如：聚酰胺柱的再生待樣品中各組分從柱中洗脫后，再進(jìn)一步用甲醇：氨水(1:1)充分洗滌柱子，將柱中吸附殘留的樣品全部解吸；再換用pH3-4的HCl水溶液通過(guò)柱子，使聚酰胺恢復(fù)原有的活性，重復(fù)使用。如：聚酰胺柱的再生待樣品中各組分從柱中洗脫后，216如：聚酰胺柱的再生在以制備分離為目的的實(shí)驗(yàn)中，調(diào)節(jié)溶液的PH值盡量采用稀NaOH和HCl，以免樣品中引進(jìn)其他的陽(yáng)離子和陰離子，對(duì)樣品的紅外圖譜產(chǎn)生干擾。如用NH4OH溶液調(diào)節(jié)pH時(shí)，在樣品中引入了NH4＋離子，在紅外圖1400cm-1處會(huì)出現(xiàn)一尖銳的強(qiáng)蜂，干擾了樣品的紅外圖譜。如：聚酰胺柱的再生在以制備分離為目的的實(shí)驗(yàn)中，217（五）吸附薄層層析薄層層析：簡(jiǎn)便、快速、微量的層析方法。一般將吸附劑涂布到平面如玻璃片上，形成一薄層固定相，在一個(gè)以展開劑飽和的密閉容器內(nèi)，展開劑依靠固定相的毛細(xì)作用和固定相作相對(duì)移動(dòng)，使物質(zhì)發(fā)生分離；這種方法稱薄層層析。（五）吸附薄層層析薄層層析：簡(jiǎn)便、快速、微量的層析方法。218（五）吸附薄層層析薄層層析用的吸附劑與其選擇原則：和柱層析相同，主要區(qū)別在于：薄層層析要求吸附劑的粒度更細(xì)，一般應(yīng)小于10um，粒度均勻用于薄層層析的吸附劑或預(yù)制薄層一般活度要求不宜過(guò)高，以II－III級(jí)為宜。（五）吸附薄層層析薄層層析用的吸附劑與其選擇原則：219（五）吸附薄層層析薄層層析用的展開劑：展開距離隨薄層的粒度粗細(xì)而定；粒度越細(xì)，展開距離相應(yīng)縮短；一般不超過(guò)10cm，否則影響分離效果；（五）吸附薄層層析薄層層析用的展開劑：220（五）吸附薄層層析薄層層析用的展開劑：當(dāng)吸附劑的活度一定時(shí)，多組分樣品的分離取決于展開劑的選擇。中草藥化學(xué)成分在脂溶性成分中大致分為：無(wú)極性、弱極性、中極性與強(qiáng)極性（五）吸附薄層層析薄層層析用的展開劑：221薄層層析薄層層析222特殊薄層

對(duì)于某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，需要采用一些特殊薄層,包括：①熒光薄層②絡(luò)合薄層③酸堿薄層和PH緩沖薄層

特殊薄層對(duì)于某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，需要采用一些223①熒光薄層原因：有些化合物本身無(wú)色，在紫外燈下也不顯熒光，又無(wú)適當(dāng)?shù)娘@色劑；①熒光薄層原因：224①熒光薄層處理：可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成