CellEngin7（七）抗體檢測(cè)免疫熒光試驗(yàn)放射免疫試驗(yàn)(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)CellEngin7ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選（八）單克隆抗體的大量制備體內(nèi)法培養(yǎng)法

動(dòng)物體內(nèi)誘生法

優(yōu)缺點(diǎn)1.比較經(jīng)濟(jì)，2.產(chǎn)物量多效價(jià)高，3.還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已經(jīng)污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株，4.缺點(diǎn)是小鼠腹水中混有來(lái)自小鼠的多種雜蛋白，純化難。要點(diǎn)：選用BALB／c小鼠（因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞的兩種親本細(xì)胞都來(lái)自BALB／c小鼠）破壞小鼠腹腔內(nèi)膜（注入細(xì)胞的幾周前，預(yù)先將具有刺激性的有機(jī)溶劑降植烷(pristane)注入腹腔內(nèi)，建立雜交瘤細(xì)胞易于增殖的環(huán)境使雜交瘤細(xì)胞在腹腔內(nèi)增殖良好）注射1xl06雜交瘤細(xì)胞，待生成腹水后再抽取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。一般在接種雜交瘤細(xì)胞后7---12d便能抽取到腹水，抽取幾次，即可達(dá)10ml。體外培養(yǎng)法培養(yǎng)基：多采用RPMll640培養(yǎng)液，添加10％～20％胎牛或小牛血清。特點(diǎn)：由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達(dá)100mg／m1以上，給純化帶來(lái)困難。加入小牛血清又是發(fā)生支原體污染的原因，而且批間質(zhì)量差異太大，直接影響雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。所以，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的無(wú)血清培養(yǎng)法，就是利用白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物來(lái)代替小牛血清。雖然該法可減少污染又有利于單克隆抗體的純化，但產(chǎn)量不高。四、單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展。

第五節(jié)人源單克隆抗體主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細(xì)胞株作為融合親本。現(xiàn)有的細(xì)胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，而且細(xì)胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細(xì)胞十分困難，因?yàn)閷?duì)人來(lái)說(shuō)，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細(xì)胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細(xì)胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過(guò)小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞誘生腹水達(dá)到這一目的，但是人雜交瘤細(xì)胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。EBVEBV轉(zhuǎn)化---融合技術(shù)嵌合抗體技術(shù)人---鼠嵌合抗體就是用人源性抗體的一部分代替鼠源性抗體的一部分，使之保留對(duì)抗原的特異性，又具備與補(bǔ)體和細(xì)胞結(jié)合的功能，并減少異源性蛋白的抗原性。用人源性基因代替鼠源性抗體基因中的Fc區(qū)。因?yàn)镕c區(qū)的主要功能是激活機(jī)體免疫反應(yīng)，也是產(chǎn)生人抗鼠反應(yīng)的部分。研究人員利用編碼人抗體Fc區(qū)的DNA片段替換鼠源性的Fc段DNA。Ig分子的基因結(jié)構(gòu)改型抗體技術(shù)嵌合抗體由鼠可變區(qū)與人穩(wěn)定區(qū)組合而成，因而仍有一定的免疫原性。為降低來(lái)自小鼠可變區(qū)中骨架區(qū)的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗體中與抗原結(jié)合的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）基因用以置換人抗體中相應(yīng)序列。由于這種抗體絕大部分為人源性，只有CDR區(qū)來(lái)自小鼠，因而稱為CDR移植抗體（CDRgraftedantibody）。這種抗體在人體內(nèi)免疫性大為降低

改型抗體技術(shù)鼠源性基因人源性基因Filamentousphage雖有多種外殼蛋白被試用于噬菌體展示，目前主要應(yīng)用的是基因Ⅷ蛋白和基因Ⅲ蛋白。

基因Ⅷ蛋白：外殼主要蛋白，2700個(gè)拷貝，成熟蛋白分子只有50個(gè)氨基酸殘基，其中央有一段疏水區(qū)，當(dāng)噬菌體在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)，所產(chǎn)生的基因Ⅷ蛋白通過(guò)這段疏水區(qū)嵌鑲在細(xì)菌內(nèi)膜上，當(dāng)釋放時(shí)，包被在噬菌體DNA外面。將外源蛋白的基因與基因Ⅷ融合，就會(huì)在噬菌體表面表達(dá)出多個(gè)拷貝的外源蛋白。多價(jià)表達(dá)有利于對(duì)低親和力配體或受體的篩選。

基因Ⅲ蛋白：分子量是42000，含有406個(gè)氨基酸殘基，在病毒感染的細(xì)菌內(nèi)，以其靠近羧基端的23個(gè)氨基酸組成的穿膜區(qū)固定于內(nèi)膜上，氨基端朝向周質(zhì)腔。位于噬菌體顆粒的一端，有3-5個(gè)拷貝，其氨基端第1-198位氨基酸能夠與大腸桿菌的性菌毛結(jié)合，介導(dǎo)噬菌體顆粒對(duì)大腸桿菌的感染，其羧基端部分則與子代噬菌體從細(xì)菌胞內(nèi)釋放過(guò)程有關(guān)。將外源基因與基因Ⅲ融合，在噬菌體表面僅表達(dá)少量外源性蛋白，有利于高親和力配體或受體的篩選。

PhagedisplayofpeptidespVpVIpVIIpIIIpVIIIforeignpeptide噬菌體抗體庫(kù)

將抗體分子片段與噬菌體外殼蛋白融合，使之表達(dá)到噬菌體顆粒表面，就形成了噬菌體抗體。將多樣性可變區(qū)基因組裝到表達(dá)載體內(nèi)，表達(dá)到噬菌體表面得到多樣性噬菌體抗體的集合即噬菌體抗體庫(kù)（phageantibodylibrary）。

單克隆抗體噬菌體抗體

雜交瘤技術(shù)展示技術(shù)宿主細(xì)胞:雜交瘤細(xì)菌篩選范圍:~103107109時(shí)間:幾個(gè)月幾周操作:繁雜相對(duì)簡(jiǎn)單免疫:必須可避免人源抗體:+費(fèi)用:高低生產(chǎn)量:有限無(wú)限基因獲取:再克隆直接應(yīng)用前景:有限不可估

單克隆抗體的應(yīng)用基礎(chǔ)理論研究（生命科學(xué)）發(fā)病機(jī)理的研究疾病的預(yù)防（緊急預(yù)防）疾病的診斷（傳染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病、免疫缺陷?。┘膊〉闹委煟ㄖ委熜钥贵w）——一項(xiàng)重要的生物技術(shù)和一類生物高科技產(chǎn)品單克隆抗體在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用從醫(yī)學(xué)到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用從診斷到預(yù)防和治療MHC細(xì)胞表面分子血型腫瘤相關(guān)抗原和分子抗Ig的同種異型激素、細(xì)胞因子和血漿成分純化干擾素病原生物

傳染性疾病

HIV:急性感染期和晚期:核心抗原p24升高;檢測(cè)抗HIV抗體初篩;

免疫印跡進(jìn)一步確認(rèn);CD4+T細(xì)胞<200/l病情嚴(yán)重

HAV、HBV、HCV:抗體

HFRS:免疫熒光，ELISA（特異性IgM）

腫瘤

多種腫瘤的標(biāo)志物

直腸結(jié)腸癌:CEA

前列腺癌:PSA

原發(fā)性肝癌:AFP

淋巴瘤和白血病:CD分子

自身免疫性和過(guò)敏性疾病自身抗體（抗核抗體、類風(fēng)濕因子）放射免疫測(cè)定法（RIA）檢測(cè)特異性IgE

甲狀腺素、胰島素、生長(zhǎng)激素

其他

血型檢測(cè)：凝集反應(yīng)（直接和間接）早孕:人絨毛膜促性腺激素（hCG）男性不育:抗精子抗體單克隆抗體在臨床診斷中應(yīng)用通用名類型識(shí)別抗原治療疾病CatumaxomabRomovab雙特異性anti-CD3/Epcam結(jié)腸癌ZanolimumabHumax-CD4人抗體,IgGCD4皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤EpratuzumabLymphocide人源,IgG1CD22非何杰金淋巴瘤和某些自身免疫性疾病(如SLE),與CD20mAb聯(lián)用可能會(huì)提高臨床效果MDX-010ipilimumab人抗體,IgGCTLA-4黑素瘤WX-G250Rencarex嵌合,IgG1抗碳酸酐酶Ⅸ晚期腎癌AMG-162denosumab人抗體,IgG2RANKL絕期后骨質(zhì)疏松癥和防止治療腫瘤過(guò)程中激素部分切除治療引起的骨丟失Anti-MRSAmAbAurograb人抗體,scFv抗甲氧芐青鏈素的金黃色葡萄球菌(MRSA)金黃色葡萄球菌感染PexelizumabAlexion;Eculizumab人源,單鏈可變區(qū),scFv補(bǔ)體C5治療心血管術(shù)后合并癥,膜性腎炎,急性心肌梗塞,RAMepolizumab人源,IgG1IL-5特應(yīng)性皮炎,嗜酸細(xì)胞過(guò)多綜合征FDA批準(zhǔn)進(jìn)入Ⅲ期臨床驗(yàn)證的治療性抗體（9種新的靶分子）靶分子抗體種類治療疾病商品名公司批準(zhǔn)時(shí)間CD分子IL-6R人源化抗體（IgG1）阻斷IL-6與IL-6R結(jié)合，治療RA,Castelman病RoActemra/TocilizumabChugai/Roche2009(US2009(EU)日本CD80/CD86CTLA4-Fc阻斷T細(xì)胞活化，治療RAOrencia/abataceptBMS2005(US)2007(EU)EpCAM(CD326)/CD3雙特異性三功能Ab(小鼠/大鼠源性，同時(shí)識(shí)別EpCAM上2個(gè)表位和CD3)通過(guò)ADCC殺傷上皮細(xì)胞腫瘤,治療癌性腹水Removab/CatumaxomabTrion/Fresenius2009(EU)細(xì)胞因子IL-1人抗體Cryopyrin相關(guān)周期性綜合征(CAPS)canakinumabNovartis2009(US)2009(EU)IL-1IL-1RⅠ/IL-1RAP-Fc（異二融合蛋白）Cryopyrin相關(guān)周期性綜合征(CAPS)RilonaceptIL-1/ArcalystRegeneron2008(US)2009(EU)IL-12/IL-23(p40)人抗體（IgG1）抑制Th1和Th17，治療銀屑病Ustekinumab/StelaraCentocor/J&J2009(US)2009(EU)TNF-人源化-Fab-PEG(大腸桿表達(dá),半衰期長(zhǎng))中和TNF-,治療RA，Crohn’s病Certolizumabpegol/CimziaUCB*2009(US)2008(EU)TPOR/MplAMG-531刺激肽-Fc結(jié)合并刺激TPO受體，治療免疫性血小板減少性紫癜（ITP）Nplate/Romiplostim(peptibody)Amgen2008(US)2009(EU)補(bǔ)體C5人源化抗體（IgG）抑制C5裂解為C5a和C5b,阻止攻膜復(fù)合物形成,治療陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿（PNH）Soliris/eculizumabAlexion2007(US)2007(EU)*治療RA：2009（US、EU、加拿大）；治療Crohn’s病：2008(US),2007（瑞士）新近批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)的治療性抗體（2007~2009年）習(xí)題(6)名詞解釋：?jiǎn)慰寺】贵w靶向制劑，噬菌體抗體庫(kù)簡(jiǎn)述單克隆抗體的制備過(guò)程及其主要原理。針對(duì)某一抗原A設(shè)計(jì)一單克隆抗體制備方案。利用細(xì)胞工程制備人源性單克隆抗體的主要方法有哪些？它們的優(yōu)勢(shì)與難點(diǎn)何在？第六章胚胎工程/video/2010/10/N/I/V6H9R7HNI.htmlRobertG.EdwardsRobertG.Edwards因創(chuàng)立體外受精技術(shù)而獲得這一獎(jiǎng)項(xiàng)。愛(ài)德華茲現(xiàn)在是英國(guó)劍橋大學(xué)的名譽(yù)教授。體外受精技術(shù)俗稱試管嬰兒技術(shù)。醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，世界上每十對(duì)夫婦中就有一對(duì)有生育問(wèn)題，而試管嬰兒技術(shù)可以幫助其中絕大多數(shù)夫婦實(shí)現(xiàn)有自己后代的夢(mèng)想。自1978年第一個(gè)試管嬰兒路易絲-布朗呱呱墜地，全球已有400萬(wàn)人通過(guò)試管嬰兒技術(shù)出生，其中許多人通過(guò)自然受精方式生育了下一代。

胚胎發(fā)育的基本過(guò)程和機(jī)制/movie/2011/10/C/Q/M7FLB097N_M7FLB6HCQ.html1受精

受精的發(fā)現(xiàn)過(guò)程：在1875年，比利時(shí)動(dòng)物學(xué)家VanBeneden觀察了兔雌雄原核的融合，首次提出了受精的概念。1951年，美籍華人張民覺(jué)與Austin發(fā)現(xiàn)了精子的獲能，為受精作出了劃時(shí)代的貢獻(xiàn)。到20世紀(jì)60年代以來(lái)，體外受精技術(shù)的發(fā)展使受精已不單全是在母畜體內(nèi)完成之事。1978年，世界首例試管嬰兒誕生。無(wú)性生殖：一個(gè)個(gè)體分裂產(chǎn)生一個(gè)或一個(gè)以上的后代，不經(jīng)過(guò)受精過(guò)程，后代來(lái)自同一親代。孤雌生殖也屬于無(wú)性生殖。如：變形蟲(chóng)、水螅、海星。有性生殖：有兩個(gè)單倍體性細(xì)胞結(jié)合（受精）產(chǎn)生二倍體后代。雌雄同體、雌雄異體、體外受精、體內(nèi)受精二、配子的準(zhǔn)備1、精子獲能（Capacitation）Austin(1951)和張明覺(jué)（1951）報(bào)道了精子的獲能。是指剛射出體外的精子沒(méi)有受精能力，只有在雌性生殖道中，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的成熟，而獲得受精能力的過(guò)程。此過(guò)程精子外膜要發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化等方面的變化。這些變化與雌性生殖道中的物質(zhì)在關(guān)。獲能作用的變化。主要發(fā)生于精子的膜（頂體膜）。若將獲能精子重新置于精漿中，便又失去受精能力，這種叫去能。如果去能精再回到母生殖道中，精子可再次獲能。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，精子獲能不僅可在雌性生殖道中，而且在體內(nèi)的其他部位也能獲能；又發(fā)現(xiàn)不僅能在體內(nèi)獲能，在體外的培養(yǎng)液中。只有獲能的精子才能發(fā)生頂體反應(yīng)。

2、卵子在受精前的準(zhǔn)備卵子排出后，也有類似于精子獲能的成熟過(guò)程或準(zhǔn)備過(guò)程，這一過(guò)程中，卵泡液與開(kāi)管液的混合對(duì)卵子的作用不可忽視，經(jīng)過(guò)幾小時(shí)后，卵子才具有受精能力，剛排出卵子，在管起始部，不會(huì)受精。透明帶表面需出許多終糖殘基，具有識(shí)別同源，精子并與其發(fā)生特異結(jié)合的作用，卵子質(zhì)膜在受精前較不穩(wěn)定。許多形態(tài)和生化變化，認(rèn)為是卵進(jìn)入輸卵管后發(fā)生的，卵外膠膜的形成，與受精有密切關(guān)第，因膜內(nèi)有抗原?？梢?jiàn)，輸卵管分泌物對(duì)卵子在受精前的準(zhǔn)備是需要考慮的。2、受精過(guò)程受精始于精、卵相遇，兩性原核合并形成合子時(shí)結(jié)束。受精是指精卵完成生理成熟后，兩者互相相遇，精子主動(dòng)向卵子內(nèi)部轉(zhuǎn)入，從而出現(xiàn)一系列的復(fù)雜的細(xì)胞化學(xué)的變化過(guò)程，此變化才能使兩者充分結(jié)合成新的接合子。一次大約有3億精子參與受精經(jīng)過(guò)種種障礙的精子終于與卵子相遇精子試圖進(jìn)入卵子

（1）精子穿透放射冠的過(guò)程這是精子入卵的第一道屏障精子經(jīng)頂體反應(yīng)，放出透明質(zhì)酸酶和放射穿透酶，溶解細(xì)胞間的基質(zhì)（膠質(zhì)狀），打開(kāi)一條通道，與透明帶接觸。（2）精子穿過(guò)透明帶精子穿過(guò)放射冠后，以剛暴露的頂體內(nèi)膜附著于透明帶外表面的特異受體上。未獲能和頂體反應(yīng)者不能發(fā)生附著這種附著有著明顯的種間特異性。特異受體位點(diǎn)叫精子受體（recepterforsperm）。精子通常在附著透明帶后5—15分鐘穿過(guò)透明帶。與透明帶接觸部位主要是頭部赤道區(qū)和核帽盾區(qū)，頂體膜落在接觸帶前后。哺乳動(dòng)物地頂體內(nèi)含有20種以上的酶，其中頂體素為穿過(guò)透明帶的主要溶解酶，它在頂體瓜時(shí)被激活。精子在與透明帶結(jié)合不久，頂體酶將透明帶溶出一通道，精子借助自身的運(yùn)動(dòng)穿過(guò)透明帶，經(jīng)路往往是彎曲的，少見(jiàn)垂直成水平穿過(guò)的。（3）精子進(jìn)入卵黃膜：穿入透明帶后先到卵黃周隙，當(dāng)一旦接觸卵黃膜，則精子停止活動(dòng)，接觸膜20分后，便融合一起（中后部質(zhì)膜與黃膜接觸）黃膜表面絨毛抓住精子頭，同時(shí)卵黃旋轉(zhuǎn)，使精子尾也進(jìn)入卵周隙隨后，精卵膜融合，漸使精子包進(jìn)卵膜內(nèi)。在精子頭與卵黃膜融合的同時(shí)，卵子激活，并有一系列反應(yīng)。①皮質(zhì)反應(yīng)（carticalreaction）—精子接黃膜時(shí)，接觸點(diǎn)膜電荷改變并擴(kuò)散整個(gè)膜持續(xù)去極化數(shù)分鐘，在卵黃膜下的皮質(zhì)顆粒向卵子表面移動(dòng)，并與卵黃膜融合，以胞吐方式將其內(nèi)容物排入卵周隙，皮質(zhì)反應(yīng)從入卵處開(kāi)始，迅速擴(kuò)散于膜四周與透明帶這是一種防止卵黃膜再被其他精子穿透的防御性反應(yīng)。皮質(zhì)顆粒內(nèi)容物含有粘性加入了皮質(zhì)顆粒膜透明膜物質(zhì)，可阻止原體酶作用。②卵黃膜反應(yīng)（vitellihereaction）—皮質(zhì)反應(yīng)引起卵黃膜的改組，稱之成封閉作用同時(shí)顆粒內(nèi)容物與卵黃膜緊粘面成一透明膜叫保護(hù)層從而改變卵表面結(jié)構(gòu)，防止第二個(gè)精子進(jìn)入。③透明帶反應(yīng)（zonareaction）皮質(zhì)顆粒內(nèi)容物的釋放，改變了透明帶的性質(zhì)，從而阻止其他粘入穿入，可能內(nèi)容相中的類胰蛋白酶破壞了透明帶上的特異性粘子受體。（兔卵子無(wú)透明帶反應(yīng)）但在貓，周隙中有多精，叫補(bǔ)充精子。（4）原核形成精子入卵后，頭膨大，核疏松膜消失，核內(nèi)其他也消失，在疏松的染色質(zhì)外雙形成新膜，由一個(gè)粘細(xì)胞核成類似體C核，這個(gè)重新形成的核叫雄原核。雌原核的形成類似雄原核，二者同時(shí)發(fā)育，體積上升（可達(dá)原來(lái)20倍）雄原核往往比雌原核大，雌原特點(diǎn)染色質(zhì)分布不均（不對(duì)稱）

（5）、配子配合（合子形成）充分發(fā)育的原核，相向移動(dòng)至卵中央，核仁，膜消失，二者緊密接觸，再迅速收縮，染色體重新組合，至此受精結(jié)束。

3、受精過(guò)程新所需要時(shí)間從排卵至受精結(jié)束：馬24小時(shí)、牛11—30小時(shí)、綿羊38—39小時(shí)、山羊30小時(shí)、貓50小時(shí)。從精子入卵到第一次卵裂：牛20—24小時(shí)、綿羊16—21小時(shí)、貓12—24小時(shí)、兔12小時(shí)、人約36小時(shí)。

四、異常受精1、多精子受精：2個(gè)或2個(gè)以上精子，同時(shí)進(jìn)入卵黃參加受精（僅占1—2%）一般卵子在衰老或阻滯失常是發(fā)生（豬多見(jiàn)，牛、羊偶見(jiàn)）。2、雙雌核受精：極體未排出而發(fā)育成原核。多見(jiàn)于豬。3、雌核發(fā)育或雄核發(fā)育：受精開(kāi)始正常，后來(lái)一方原核不能形成。多倍體，單倍體均在早期死亡。4、孤雌生殖：不經(jīng)配子配合，而卵子核發(fā)育。（生前死亡）。著床高等動(dòng)物個(gè)體發(fā)育全過(guò)程受精卵（動(dòng)物半球細(xì)胞分裂快、細(xì)胞小、細(xì)胞多）囊胚（具囊胚腔）原腸胚動(dòng)物半球細(xì)胞外包植物半球細(xì)胞內(nèi)陷幼體組織、器官分化系統(tǒng)形成（從卵膜中孵化或母體生出）成體溫度等外界因素胚的發(fā)育胚后發(fā)育（具原腸腔、三個(gè)胚層、胚孔）桑椹胚神經(jīng)胚受精卵卵裂期桑椹胚囊胚（內(nèi)含囊胚腔）原腸胚（內(nèi)含原腸腔）胎兒形成：在透明帶內(nèi)進(jìn)行有絲分裂，細(xì)胞數(shù)量不斷增加，但胚胎總體積并不增加，或略有減少。：由具有全能性細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞數(shù)在32個(gè)左右，排列緊密，形似桑椹內(nèi)細(xì)胞團(tuán)：發(fā)育成胎兒各組織滋養(yǎng)層細(xì)胞：發(fā)育成胎膜和胎盤：最初發(fā)育在輸卵管進(jìn)行有絲分裂胚胎發(fā)育滋養(yǎng)層外胚層中胚層內(nèi)胚層原腸腔囊胚期滋養(yǎng)層：發(fā)育成胚胎的附屬結(jié)構(gòu)或胚外結(jié)構(gòu)，胚胎可通過(guò)這些組織從母體中獲得正常發(fā)育所需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞：即胚胎干細(xì)胞，是一種未分化的細(xì)胞，具有全能性，能發(fā)育成完整的胚胎滋養(yǎng)層內(nèi)細(xì)胞團(tuán)囊胚腔囊胚的形成受精卵第一次卵裂第二次卵裂第三次卵裂囊胚囊胚囊胚腔原腸腔原腸胚外胚層中胚層內(nèi)胚層———————內(nèi)胚層——中胚層——原腸胚胚的發(fā)育：按照一定的次序向內(nèi)運(yùn)動(dòng)受精卵——卵裂——囊胚原腸胚的形成

胚胎工程是在胚胎移植技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代生物技術(shù)，在畜牧業(yè)生產(chǎn)和臨床上具有廣泛的應(yīng)用。它主要包括體外受精技術(shù)、胚胎移植技術(shù)、胚胎分割技術(shù)、胚胎冷凍保存技術(shù)和性別控制技術(shù)等。近30年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，胚胎工程技術(shù)也日新月異，在促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展及其相關(guān)領(lǐng)域研究中取得了令人矚目的成就。

1、概念：是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過(guò)程的技術(shù)。一、體外受精技術(shù)2、基本原理：人工模擬體內(nèi)環(huán)境（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、PH等），使初級(jí)卵母細(xì)胞成熟，同時(shí)使精子獲能，最終完成受精作用，并有計(jì)劃地保存胚胎

3、應(yīng)用：①用于研究動(dòng)物生殖細(xì)胞的發(fā)生、受精和胚胎早期發(fā)育機(jī)制；②充分利用優(yōu)良品質(zhì)資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度；③是胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等技術(shù)的不可缺少的組成部分。

1959年，張明覺(jué)以家兔為實(shí)驗(yàn)材料，從一只交配后12h的母兔子宮中沖取精子(即體內(nèi)獲能的精子)，從另外兩只超數(shù)排卵處理母兔的輸卵管中收集卵子，精子和卵子在體外人工配制的溶液中完成受精過(guò)程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受體兔的輸卵管中，其中4只妊娠，并產(chǎn)下15只健康仔兔，這是世界上首批試管動(dòng)物，它們的正常發(fā)育標(biāo)志著體外受精技術(shù)的建立。試管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)嬰兒(Steptoe和Edwards，1978)牛(Brackett等，1982)山羊(Hamda，1985)綿羊(Hanada，1985)豬(Chang等，1986)牛（Parrish等，1986）體外受精技術(shù)主要包括以下幾個(gè)主要方面：精子的采集與獲能;

卵子的回收及成熟培養(yǎng);

體外受精;

受精卵的體外發(fā)育;

試管胚胎的移植等。

在獲能溶液或?qū)Ｓ玫氖芫芤褐型瓿墒芫^(guò)程。

體外受精1.精子的獲能處理張明覺(jué)Austin1951年發(fā)現(xiàn)兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必須在生殖道中停留一段時(shí)間后才具備受精能力，這一現(xiàn)象稱為精子的獲能（capacitation）。

精子的獲能過(guò)程是多時(shí)期、多步驟的復(fù)雜變化過(guò)程，包括兩個(gè)階段，獲能的第一階段是脫出精子表面的抗原物質(zhì)和去能因子（DecapacitationFactors，DF），增強(qiáng)了膜通透性。第二階段是精子細(xì)胞膜蛋白變化，即發(fā)生頂體反應(yīng)。2.卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)

（1）卵母細(xì)胞的采集①超數(shù)排卵

②從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞

③從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞

（2）卵母細(xì)胞的選擇

（3）卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)(1)卵母細(xì)胞的采集①超數(shù)排卵：雌性動(dòng)物用促卵泡素和促黃體素處理后，從輸卵管中沖取成熟卵子可直接與獲能精子受精。在大家畜中，由于操作程序復(fù)雜，成本較高，很少使用。這種方法的關(guān)鍵是掌握卵子進(jìn)入輸卵管和卵子在輸卵管中維持受精能力的時(shí)間，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前沖取。

②從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞：這種方法是借助超聲波探測(cè)儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡直接從活體動(dòng)物的卵巢中吸取卵母細(xì)胞。在家畜中，牛和馬等大家畜常用超聲波探測(cè)儀輔助取卵，其方法是用手從直腸把握卵巢，經(jīng)陰道壁穿刺插入吸卵針，借助B型超聲波圖像引導(dǎo)，吸取大卵泡中的卵母細(xì)胞。按照目前的技術(shù)水平，一頭健康母牛每周可獲得5~10枚卵子。在家畜中，活體采集的卵母細(xì)胞一般要經(jīng)成熟培養(yǎng)后才能與精子受精。這種方法對(duì)擴(kuò)繁優(yōu)良母畜具有重大意義，在有些國(guó)家已用于商業(yè)化生產(chǎn)。

③從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞：

這種方法是從剛屠宰母畜體內(nèi)摘出卵巢，經(jīng)洗滌、保溫（30℃~37℃)后，快速運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細(xì)胞（牛卵泡直徑要求3-10mm）也可對(duì)卵巢進(jìn)行切片，收集卵母細(xì)胞。用此方法獲得的卵母細(xì)胞多數(shù)處于生發(fā)泡期(GV期)，需要在體外培養(yǎng)成熟后才能與精子受精。從廢棄卵巢中采集卵母細(xì)胞的關(guān)鍵是注意卵巢的保溫和防止細(xì)菌污染。因此卵巢從畜體摘取后須放入含有生理鹽水或磷酸緩沖液（PBS）的保溫瓶中；吸卵前卵巢要用生理鹽水或PBS多次洗滌；所用溶液都要添加抗生素。

(2)母細(xì)胞的選擇：

采集的卵母細(xì)胞絕大部分與卵丘細(xì)胞形成卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulusoocytecomplesxCOC）。無(wú)論采用何種方法，采集的COC都要求卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，外圍