免疫組化的原理張斌天津醫(yī)科大學免疫組化原理免疫組化的原理

免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。原理：組織或細胞內的某種化學物質（待檢測物）抗原

免疫動物

抗體檢測（免疫組織化學）

熒光素酶金、銀顆粒P-ERK：一抗：鼠來源的單克隆抗體.鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法直接法將熒光、酶、金直接標記在一抗上進行顯色，沒有聯結系統、未用橋抗體。優(yōu)點：特異性高、非特異染色輕。缺點：敏感性低，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來標記間接法將標記物標記在橋聯抗體上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上產生的多克隆抗體，其酶標抗體必須是針對兔優(yōu)點：敏感性高，只需少數幾種動物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺點：特異性差PAP法

過氧化酶-抗過氧化酶法組成：一抗是針對靶抗原的特異性抗體二抗是聯結抗體，一面聯結一抗，另一面聯結PAP復合物三抗是以過氧化物酶為抗原，在與一抗同種動物身上誘發(fā)產生的抗體，并與辣根過氧化物酶形成復合物（PAP）PAP法

（過氧化酶-抗過氧化酶法）優(yōu)點：PAP復合物中含酶更多，且是一種非標記的免疫組化方法，敏感性更高PAP復合物常來自兩種不同的動物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色可用于福爾馬林固定的石蠟切片親和素生物素酶親和素有四個生物素分子特異性結合部位，其結合力強，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結合親和素-生物素復合物是一個三維空間的結構，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統相連接，產生多級放大，從而提高此生物反應的敏感性和特異性AB復合物多用于ABC法的免疫組化中親和素—生物素復合物（ABC）酶標親和素在AB復合物中，酶是標記在生物素上，而后與親和素合成復合物。在標記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強的結合力，因此LSAB法比ABC法更敏感多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯結的由HRP標記的多聚物辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應過程:HRP+H2O2

HRP?H2O2

有色分子終末產物+HRP

DAB（電子供體）

HRP：酶

H2O2：底物

HRP?H2O2：酶?底物復合物受氫體為過氧化氫；供氫體較多包括DAB；

抗體抗原的結合是肉眼看不見的，顯色系統的目的就是使這種看不見的反應變?yōu)榭吹靡?，從而確定抗原的存在及其定位，顯色系統由酶、底物加上顯色劑組成，若顯色劑為DAB，則出現棕褐色細顆粒沉淀DAB(3,3-二氨基聯苯胺顯色液)配法:DAB50mg0.1mPBS100ml30%H2O230-40ulPBS的PH和離子強度的使用免疫組化原理及流程介紹建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M中性及弱堿性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點在于顯色系統的差異：間接酶標法：利用標記于橋聯抗體的酶PAP法：利用PAP復合物ABC法：利用AB復合物LSAB法:利用直接標記于親和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體

其目的都是設法提高免疫組化染色的敏感性顯示系統三免疫組化的基本流程免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化2.封閉內源性過氧化物酶3.抗原修復、暴露抗原決定簇4.封閉非特異性蛋白5.一抗孵育

6.二抗孵育

7.SP反應

8.顯色9.復染、脫水、透明、封片

2.封閉內源性過氧化物酶免疫組化原理及流程介紹2.封閉內源性過氧化酶其主要目的是降低內源性過氧化物酶的活性。在傳統的ABC法和SP法中，免疫組化反應結果容易受到內源性過氧化物酶的干擾，必須用過氧化氫等進行滅活。免疫組化原理及流程介紹3.抗原修復暴露抗原決定簇

由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。免疫組化原理及流程介紹4.封閉特異性蛋白組織切片上有些剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續(xù)結果的假陽性。封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中有一些動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發(fā)生結合。

一抗孵育條件在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關。一般37度1-2h，或4度過夜和從冰箱拿出后常溫復溫45min。免疫組化原理及流程介紹1.防止脫片；2.使抗原抗體結合更穩(wěn)定。免疫組化原理及流程介紹6.二抗孵育二抗:可以和一抗結合，并帶有可以被檢測出的標記(如帶熒光、放射性、化學發(fā)光或顯色基團），作用是檢測一抗。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。免疫組化原理及流程介紹7.SP反應SP染色法即鏈霉素抗生物素蛋白生物素過氧化酶連接法。該法是ABC法基礎上的進一步改良。免疫組化原理及流程介紹9、復染、脫水、透明、封片復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，經常用的試劑為蘇木素。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返藍即可。1,鹽酸酒精:使用濃度1%36-38%鹽酸：1ml75%乙醇：99ml2,氨水：使用濃度為0.2%25-28%:0.2ml

自來水:100ml3，素木精染色原理素木精為堿性天然燃料，可使核著色。細胞核內染色質的成分主要為DNA，在DNA的雙螺旋結構中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋外側帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的素木精堿性染料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。素木精在堿性溶液中呈藍色。4，鹽酸酒精的分化作用：染色后，用某些特定的溶液將組織過多結合的染色劑脫去，這個過程為分化作用。所用的溶液稱為分化液。酸能破壞蘇木精的醌型結構，使組織與色素分離而退色。經蘇木精染色后，必須用