1.基因敲除技術(shù)的常見種類2.基因敲除技術(shù)的主要篩選策略3.基因敲除技術(shù)的應(yīng)用基因敲除技術(shù)與生物制藥Geneknockoutskillandbio-pharmaceuticals基因敲除技術(shù)與生物制藥基因敲除是將基因組中特定的一個基因去除、替換或滅活,然后從細胞水平或整體觀察該基因的功能。基因靶向、基因打靶、基因中斷技術(shù)、基因剔除2007年諾貝爾醫(yī)學與生理學獎，是現(xiàn)代生物學研究熱點中的熱點。Geneknockoutskillandbio-pharmaceuticals具有位點專一性強、打靶后目的片段可以與染色體DNA共同穩(wěn)定遺傳的特點。常規(guī)基因工程與基因敲除的區(qū)別；內(nèi)切酶和連接酶聯(lián)合使用可以實現(xiàn)“基因敲除”；同源重組與基因敲除的關(guān)系；糾正人體缺陷基因一直是人類的夢想。1.1原核生物的Red系統(tǒng)Exo：結(jié)合在DNA雙鏈末端，5’→3’降解單鏈。1.基因敲除技術(shù)的常見種類1.1.1Red重組系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)三個基因編碼三個蛋白：Exo、Beta、GamBeta蛋白：緊緊地結(jié)合在單鏈DNA3′突出端，

防止DNA被單鏈核酸酶降解，介導(dǎo)互補單鏈DNA的退火，引發(fā)重組。Gam蛋白：與宿主的RecBCD復(fù)合體結(jié)合、抑制宿主

外切核酸酶活性，阻止外源線性DNA片

段被降。1.1.2Red重組系統(tǒng)的種類Wanner重組系統(tǒng)：將Exo、Beta、Gam整合到細菌質(zhì)粒中。主要有pkd20和pKd46兩種質(zhì)粒。Court重組系統(tǒng)：將Exo、Beta、Gam整合到細菌的染色體中。

1.1.3Red重組的機理Exo蛋白5’3’3’5’3’5’Beta蛋白3’5’3’5’被敲除和替換的區(qū)段1.1.4Red重組的實驗方案第二步，誘導(dǎo)宿主細胞表達Exo、Bata和Gam蛋白，并制備成感受態(tài)細胞,然后與PCR擴增獲得的線性DNA片段混和電轉(zhuǎn)化;（Court重組為例）第一步，

PCR合成被敲除基因的同源片段，寡核苷酸的5′端有30～50bp與靶基因末端同源，3′端有20bp與靶基因的末端同源；第三步，線性PCR產(chǎn)物與宿主靶基因的同源序列發(fā)生替換,完成重組。Court重組為例的原理1.2小鼠Cre-LoxP系統(tǒng)Cre：重組酶，專門設(shè)別LoxP位點。LoxP：34個堿基，左側(cè)13個堿基與右側(cè)13個堿基反向互補，中間8個堿基為間隔序列。ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATAACTTCGTATATATTGAAGCATAT來自E.coli噬菌體P1的cre基因編碼，Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀，甚至超螺旋。1.2.1Cre-LoxP系統(tǒng)結(jié)構(gòu)該系統(tǒng)由重組酶Cre基因和LoxP核苷酸序列組成。1.2.3Cre-LoxP系統(tǒng)的實驗方案（1）在胚胎干細胞（ES）中通過置換型載體進行同源重組，向基因組靶位點引入選擇標記基因，并在其兩側(cè)引入兩個同向排列的Loxp位點。將該ES細胞打入假孕母鼠中，發(fā)育成“floxed小鼠”。（2）顯微注射方法獲得轉(zhuǎn)基因“Cre小鼠”，此轉(zhuǎn)基因小鼠在特定的啟動子下表達Cre重組酶。（3）“Cre小鼠”跟“floxed小鼠”交配，Cre重組酶會切掉Loxp位點之間的靶基因和1個Loxp位點，從而達到靶基因的失活或敲除。此外，還可以從細胞水平進行Cre-LoxP系統(tǒng)實驗。外源基因轉(zhuǎn)座酶外源基因突起復(fù)合物外源基因整合到染色體的其他位置基因轉(zhuǎn)座常伴隨著基因缺失、重排等，因而可以應(yīng)用到基因敲除。1.3.2基因敲除與RNAi的關(guān)系RNAi是指通過雙鏈RNA介導(dǎo)特異性降解靶mRNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默的現(xiàn)象。RNAi是從轉(zhuǎn)錄水平抑制基因的作用，也可以看作是基因敲除的一種形式。DNAmRNAPro2.基因打靶的主要篩選策略2.1PCR篩選方法2.2啟動子缺失篩選2.3poly-A缺失篩選在基因敲除載體的目的片段中插入啟動子缺失的選擇基因neo（neomycin,新霉素抗性基因

）。Poly-A缺失篩選的載體設(shè)計與啟動子缺失的設(shè)計基本相同，此處neo基因轉(zhuǎn)錄終止信號。如果打靶載體和細胞基因組發(fā)生同源重組，則選擇基因能在靶位點的基因啟動子的驅(qū)動之下表達產(chǎn)物，使陽性細胞具有新霉素抗性。正向選擇基因neo插入載體的目的片段中,負選擇基因HSV-tk(HumanSemianVirus-thymidinekinase)置于目的片段的外側(cè)。2.4正負篩選策略HSV-tk基因是負選擇基因，含有HSV-tk(胸苷激酶蛋白)的重組細胞在GANC培養(yǎng)基中不能存活。胸苷激酶蛋白（TK）可使無毒性的丙氧鳥苷（GANC）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账岫鴼⑺兰毎?。同源重組時，載體的同源區(qū)發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除，所以在同源重組時，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失。neo基因有雙重作用,一方面形成靶位基因的插入突變，同時作為正向篩選的標記。3.基因敲除技術(shù)的應(yīng)用2.1在人類疾病動物模型方面的應(yīng)用Incerti通過敲除法去除小鼠OA1基因,眼科檢查顯示眼球底部黑色素不足,臨床癥狀表現(xiàn)與人的眼球白化癥相似,從而用來研究OA1的發(fā)病機制。2.2基因和蛋白功能研究方面的應(yīng)用Id蛋白能在早期分化階段阻扼B淋巴細胞的成熟，研究Id蛋白基因敲除的小鼠有助于我們進一步了解Id蛋白對B淋巴細胞生理功能的調(diào)節(jié)作用。2.5免疫學方面的應(yīng)用近年來,出現(xiàn)了幾十種免疫分子基因敲除動物模型,例如:TCR基因敲除后,小鼠胸腺發(fā)育不全，脾中B細胞增多，免疫球蛋白u鏈基因被敲除后B細胞發(fā)育受阻。2.6治療措施研究方面的應(yīng)用載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠易患動脈粥樣硬化(AS)，大劑量持續(xù)注射內(nèi)抑素全組蛋白能夠有效的抑制ApoE基因敲除鼠AS的發(fā)展，ApoE主要由肝臟合成，但其他組織細胞如巨噬細胞也有較強的合成能力，由于巨噬細胞來源于造血細胞，因此可以通過骨髓移植來增加ApoE的合成，這樣就可以糾正高脂血癥，防止AS的發(fā)生。將引起超急性排斥反應(yīng)的半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除，用此方法培育的動物的器官可以移植到人體而無排斥反應(yīng)。人類器官移植在人類疾病治療中起舉足輕重的作用，但有兩大問