腫瘤細胞的培養(yǎng)

Cultivationoftumorcells

腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥的敏感性和癌細胞生物學特性的重要手段。應用體外細胞培養(yǎng)技術進行腫瘤研究具有許多優(yōu)點：

①可免受機體內環(huán)境因素的影響，避免了個體差異性，便于探索各種物理、化學和生物因素對腫瘤細胞生命活動的影響。②既便于從細胞水平上研究腫瘤細胞的結構與功能，又便于從基因及分子水平上研究癌變的發(fā)生機理。③可長期傳代、保存，便于觀察腫瘤細胞生物學特性和遺傳行為的改變。④可用于快速篩選抗癌藥物和研究耐藥機理。一、體外培養(yǎng)腫瘤細胞生物學特性

（－）形態(tài)和性狀LM：細胞形態(tài)不規(guī)則，比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核仁較多。

EM：細胞表面微絨毛多而細密，細胞骨架系統(tǒng)（微絲和微管）排列雜亂。（二）生長增殖

腫瘤細胞在體內、體外具有不受控增殖性。

1、腫瘤細胞在低濃度血清（2～5％）中仍能生長；2、正常細胞轉化后能在低濃度血清中生長；3、癌細胞形成集落的能力（克隆）比正常細胞強。腫瘤細胞有產(chǎn)生促增殖因子的能力分散生長接觸抑制消失（腫瘤細胞、轉化細胞）接觸抑制（正常細胞〕NIH3T3細胞經(jīng)癌基因轉化后出現(xiàn)轉化灶（100×）轉化區(qū)（密集重疊生長）非轉化區(qū)（三）永生性

永生性也稱不死性，在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細胞可無限傳代而不凋亡，體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系（株）都表現(xiàn)有這種特性。體內致瘤性試驗。常用裸鼠或受射線照射過的小鼠，皮下接種一定數(shù)量癌細胞懸液后，如長成腫瘤即表明有致瘤性。（四）惡性（六）異質性

已經(jīng)證明，瘤體周邊的細胞增殖旺盛，中心區(qū)的細胞有的衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)。呈活躍增殖狀態(tài)的細胞稱為腫瘤干細胞。所有腫瘤細胞都是由增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成，屬于異質性。（七）其它

細胞遺傳性：體外培養(yǎng)的腫瘤細胞失去了二倍體核型，呈異倍體或多倍體。依賴性：腫瘤細胞雖有較強的克隆生長能力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存的關系。二、培養(yǎng)方法

（一）取材選癌細胞集中和細胞活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是較好的培養(yǎng)材料。如不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃，但不宜超過24小時。

1、體瘤取材方法：取術后或活檢標本，要盡早浸入無血清培養(yǎng)液保鮮，盡快進行培養(yǎng)。盡可能去除潰瘍及壞死組織，避免細菌、霉菌污染，對取自外露的腫瘤組織，應在培養(yǎng)前在含二性霉素B2μg/mL，青霉素200～1000u/mL，鏈霉素500μg/mL的培養(yǎng)液中浸泡10～20分鐘，再用洗液反復沖洗干凈后，再作培養(yǎng)。2、腔液的取材方法：在無菌條件下采取體腔液(胸水或腹水)，不需加抗凝劑，可直接以1200r/min收集細胞，不要久置，也不要在冰中冷卻，而應盡早接種。3、血液(骨髓)取材法：白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血為研究對象，用肝素抗凝的注射器無菌抽取5～10mL外周血，置于試管中立刻分離培養(yǎng)。1、織塊培養(yǎng)法：37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)接種于事先涂有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶（或皿）中剪碎組織，切成1~2mm3小塊在平皿中用Hanks液洗3次將取得的瘤組織去除脂肪\結締組織及壞死部分2、酶消化法：在上述的碎組織塊中加入0.25%胰蛋白酶或2000u/ml膠原酶；37℃水浴消化30分鐘或更長，去除消化液；洗液洗3次，培養(yǎng)液洗1次后，用完全培養(yǎng)基懸浮制成細胞懸液，計數(shù)；以5×108～10×108/L細胞密度，在含有10%小牛血清的RPMI1640、或DMEM中，在37℃5%CO2下分瓶(或皿)培養(yǎng)。4、脫落細胞法：將新鮮的腫瘤組織去除脂肪和結締組織；洗液洗2次后；用刀片將腫瘤組織切成細薄片，在切割的同時有許多上皮細胞脫落下來,脫落細胞經(jīng)洗滌后；加入完全培養(yǎng)基，便可獲得較純的上層細胞，于培養(yǎng)瓶(或皿)中、37℃5%CO2下培養(yǎng)，每隔2～3天換液，7～10天上皮細胞逐漸長成單層。（三）成纖維細胞的排除

1．機械刮除法：

（1）標記：在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；

（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，刮除無標記空間；

（3）用Hanks液沖洗一兩次；

（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

A瓶主要為成纖維細胞；

B瓶兩類細胞相雜;

C瓶可能主要為癌細胞。

3．消化排除法：

（1）0.25%胰蛋白酶/0.02％EDTA（1：1）混合液消化細胞；

（2）半數(shù)細胞脫落下來后，立即停止消化；

（3）把消化液吸入離心管，離心去上清；（5）向原瓶內也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

（4）制成細胞懸液培養(yǎng)于另瓶；

4．膠原酶消化法：

（1）0.5mg/ml的膠原酶消化，當成纖維細胞被除掉后，即終止消化；

（2）D-Hanks洗滌，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細胞。

（四）提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率措施①完全無細胞游離出或移動。②有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代。③傳數(shù)代后細胞增殖緩慢，經(jīng)過一段停滯期后，才呈現(xiàn)旺盛生長狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細胞系。1、適宜底物：如鼠尾膠原層、飼養(yǎng)細胞層等。2、應用促細胞生長因子：常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。3、動物體媒介培養(yǎng)：采用動物體轉嫁接種成瘤后，再進行培養(yǎng)，常用裸鼠。

裸鼠是來自小鼠的一種變異品種，無毛，缺乏胸腺，有先天性免疫缺陷，接種腫瘤細胞后易生長成瘤，但對外界環(huán)境有害因素的抵抗力也差，易于感染，并懼嚴寒和高溫，難以飼養(yǎng)和繁殖。裸鼠雖無胸腺，體內仍有NK殺傷細胞，對外仍有一定抵抗力，只要飼養(yǎng)環(huán)境基本無菌即可維持動物正常生存。裸鼠培養(yǎng)（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米3小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊；

（2）飼養(yǎng)觀察，待腫瘤生長達較大體積后，剝取出瘤組織；

（3）進行體外培養(yǎng)。

（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細胞數(shù)量增多，細胞培養(yǎng)易于成功。

三、體外培養(yǎng)腫瘤細胞生物學檢測2、形態(tài)觀察：3、細胞生長特點：4、細胞核型分析：1、組織起源:5、軟瓊脂培養(yǎng)：檢測集落形成能力。6、動物致瘤試驗：檢測成瘤能力。7、其他：同位素標記、組織化學成分分析、熒光顯微鏡觀察等。應說明培養(yǎng)材料起源于哪個胚層、器官組織、什么樣供體、何種疾病等，必要時要提供病理診斷鑒定資料。組織起源形態(tài)觀察（1）一般形態(tài)觀察：可做活細胞相差顯微鏡觀察并攝影。主要觀察細胞形狀、大小、核漿比例、染色質和核仁大小、及多少等。（2）超微結構觀察：超微結構觀察有助于比較確切地說明細胞的性質和特點，如注意微絨毛的形態(tài)、多少，橋粒的有無，微絲微管的多少和排列狀態(tài)等。細胞生長特點

（1）細胞生長曲線是測定細胞絕對增長數(shù)值最簡易的方法，是把逐日檢查的數(shù)值繪成圖即為細胞生長曲線。

（2）細胞分裂指數(shù)NormalcellsgrowinmonolayerCancercellsgrowinclumps（3）克隆形成率（接種存活率）克隆形成率：向底物上接種單細胞懸液，貼壁后能形成細胞群或克隆的細胞百分數(shù)，也稱接種存活率，也表示細胞活力?？寺⌒纬陕剩叫纬煽寺?shù)接種細胞數(shù)×100（接種存活率）細胞接種率：細胞被制成分散的懸液后，接種到底物上能貼壁并能存活生長的細胞百分數(shù)值，用以表示細胞群的活力。細胞接種率與細胞活力成正比。細胞接種率＝接種細胞數(shù)×100貼壁存活細胞數(shù)細胞接種密度和克隆形成率有一定關系做接種率測定時，一般在接種后一周進行檢查，每一細胞群數(shù)量達8或10個以上細胞時才能算做一個克隆，用解剖鏡檢查甚好。細胞克隆形成

※（4）細胞周期時間測定應用同位素標記自顯影法。用支持物細胞培養(yǎng)法在細胞進入增生期時用（3H）胸腺嘧啶核苷標記30分鐘后，每間隔30分鐘取材處理，至48小時止。主要觀察和計算細胞分裂相出現(xiàn)的時間，高峰和消失分裂相數(shù)，繪制成圖進行分析。通過同位素自顯影測定細胞周期同時，亦可借以了解DNA合成情況。癌細胞大多為異倍體，多倍體，并有標記染色體。體外培養(yǎng)細胞核型常不穩(wěn)定，應定期檢查?？勺鳛榧毎D化及惡性程度的檢查。4、細胞核型分析5、軟瓊脂培養(yǎng)軟瓊脂培養(yǎng)，特別是雙層軟瓊脂培養(yǎng)，是當前檢測轉化細胞和腫瘤細胞最為常用的方法，與細胞惡性程度有很大的符合率。雙層軟瓊脂培養(yǎng)用來檢測成瘤能力。即向異種動物體內接種細胞懸液，看是否能生長成瘤。受體動物可用小鼠或大鼠。如系一般動物，需做射線照射處理，以壓制動物免疫反應，用乳鼠較好。近年多用裸鼠，優(yōu)點是無需射線照射、比較方便，但裸鼠要求的飼養(yǎng)條件較高。6、動物致瘤試驗由人腫瘤組織來源居多數(shù)。四、腫瘤細胞系或株是現(xiàn)有細胞系中最多的一類;大多由癌細胞建成，呈上皮型細胞;均已傳百代以上;具有不死性和異體接種致瘤性;1、特點：

HeLa：為供體患者的姓名

CHO：中國地鼠卵巢細胞（Chinesehamsterovary）

宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立

NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究所（NationalInstituteofHealth）建立，每隔3天傳代，接種3X105/毫升。2、命名：無統(tǒng)一規(guī)定。3、建立細胞系（或株）的要求：（1）組織來源細胞供體所屬物種個體性別、年齡取材的器官或組織臨床和病理診斷、病歷號（2）細胞生物學檢測：細胞一般和特殊的生物學性狀；細胞接種率應力求證明細胞確系來源于原腫瘤組織；異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實驗。貼壁存活細胞數(shù)＝接種細胞數(shù)×100各種細胞都有自己比較適應的生存環(huán)境，因此應指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量，以及細胞生存的適宜pH等。（3）培養(yǎng)條件和方法：美國建有ATCC、NIGMS和NIA等細胞庫，可接受來自世界各國的已鑒定細胞，但要符合其入庫標準才可接納。ATCC入庫檢測項目組織起源和已傳代數(shù)；凍存液；細胞活力;培養(yǎng)液、培養(yǎng)基、血清、抗生素等；復蘇后細胞生長特性；接種存活率形成克隆數(shù)＝接種細胞數(shù)×100細胞形態(tài)；核型；無菌檢測，包括細菌、真菌、支原體、病毒等；物種檢測：檢測G6P