MDR1C3435T基因多態(tài)性與癲癇藥物抗性的關(guān)系探究

分子醫(yī)學(xué)技能實驗設(shè)計組員：王宗明謝詠科馮澤雄石健庭MDR1C3435T基因多態(tài)性與癲癇藥物抗性的關(guān)系探究研究背景癲癇（Epilepsy)：

癲癇是多種病因?qū)е碌囊阅X部神經(jīng)元過度的超同步化發(fā)放所致的突然發(fā)生的短暫性的腦功能障礙?？捎卸喾N原因引起，如腫瘤、外傷、原發(fā)性等。大部分可經(jīng)藥物治療而有效控制甚至痊愈。

研究背景癲癇（Epilepsy)：研究背景藥物抗性癲癇

（Drugresistantepilepsy,DRE)

20%~30%的癲癇患者通過現(xiàn)有的抗癲癇藥物（anti-epilepticdrugs，AEDs）無法達(dá)到有效的治療效果，成為藥物抗性癲癇或稱為難治性癲癇。研究背景藥物抗性癲癇

（Drugresistant研究背景P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）P糖蛋白是一種存在于細(xì)胞膜上的能量依賴性外排泵，可將親脂性藥物泵出細(xì)胞外。 由多耐藥（Multi-drugresistance，MDR）基因MDR1編碼。存在于多種有分泌功能的組織和屏障結(jié)構(gòu)中,如腸粘膜、血腦屏障（血管內(nèi)皮、星形膠質(zhì)細(xì)胞）。

研究背景P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）研究現(xiàn)狀Pgp與DRE的關(guān)系：不同原因引起的DRE患者相比一般癲癇患者，腦組織中Pgp表達(dá)量明顯升高。動物實驗得到相似的結(jié)果。Pgp高表達(dá)的實驗動物腦組織中藥物濃度降低。Pgp拮抗劑部分或完全逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。研究現(xiàn)狀Pgp與DRE的關(guān)系：研究現(xiàn)狀MDR1基因多態(tài)性與DRE：26號外顯子中的MDR1基因3435C>T?？捎绊懯改c上皮細(xì)胞中Pgp表達(dá)量與活性，從而影響藥物的吸收。與DRE的關(guān)系存在矛盾的結(jié)果。研究現(xiàn)狀MDR1基因多態(tài)性與DRE：設(shè)計思路排除干擾，“純化”結(jié)果：病因藥物年齡種族性別

……設(shè)計思路排除干擾，“純化”結(jié)果：研究目的與意義明確MDR1C3435T基因多態(tài)性對癲癇耐藥性的影響。排除癲癇病因及藥物種類對結(jié)果的影響。對癲癇耐藥理論研究及指導(dǎo)臨床對不同基因型病人的用藥均有一定意義。研究目的與意義明確MDR1C3435T基因多態(tài)性對癲癇耐藥實驗方法PCR-RFLP限制性片段長度多態(tài)性分析實驗方法PCR-RFLP實驗試劑與儀器試劑：血漿微量DNA提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠電泳所用試劑、PCR反應(yīng)所需酶及引物儀器：離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、電泳槽、染色缸、漂洗缸、紫外檢測儀、EP管、微量移液器實驗試劑與儀器試劑：血漿微量DNA提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝實驗步驟研究對象：不同病因、不同藥物治療的癲癇患者正常對照志愿者漢族取外周血5ml分組標(biāo)準(zhǔn)：患者以用藥后癲癇發(fā)作頻率是否低于用藥前50%實驗步驟研究對象：實驗步驟基因型檢測（PCR-RFLP法）：外周血DNA提取PCR擴(kuò)增酶切瓊脂糖凝膠電泳實驗步驟基因型檢測（PCR-RFLP法）：實驗步驟1.外周血DNA提?。喝】鼓?ml3000rpm×15min，取上清100μl加入200μlDP1液，充分混勻，靜10min加入300μlDP2液，顛倒混勻12000rpm×10min,取上清加等量異戊醇，10000rpm×10min，去上清75%乙醇洗滌，溶于10μlTE緩沖液實驗步驟1.外周血DNA提?。簩嶒灢襟E2.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：10×buffer 5μl4種dNTP混合物（每種2.5mmol/L）

4μl引物：MDR-1F(5’-ACTCTTGTTTTCAGCTGCTTG-3’)0.67μMMDR-1R(5’-AGAGACTTACATTAGGCAGTGACTC-3’)0.67μM模板DNA 2μlTaqDNA聚合酶(3U/μl) 1μlMg2+(25mmol/L) 3μl去離子水

32μl實驗步驟2.PCR擴(kuò)增實驗步驟2.PCR擴(kuò)增取五支PCR反應(yīng)管（內(nèi)有緩沖液、原料、引物、聚合酶），分別加入已經(jīng)處理好的標(biāo)本DNA2ul。6000rpm×5s離心。放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。實驗步驟2.PCR擴(kuò)增實驗步驟2.PCR擴(kuò)增PCR程序初次變性94℃5min循環(huán)33次

變性94℃30s

復(fù)性56℃20s

延伸72℃

30s末次延伸72℃5min最終將得到231bp包含3435核苷酸的基因片段。實驗步驟2.PCR擴(kuò)增實驗步驟3.酶切：向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶

Sau3AI37℃過夜。實驗步驟3.酶切：實驗步驟4.瓊脂糖凝膠電泳：（1）瓊脂糖凝膠板的制備：1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。實驗步驟4.瓊脂糖凝膠電泳：實驗步驟4.瓊脂糖凝膠電泳：（2）電泳樣品液的制備：用移液器分別吸取五管中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。

（3）電泳：打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，電泳約30min-60min。（4）染色與檢測：將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。

將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護(hù)罩，打開紫外燈，觀察。實驗步驟4.瓊脂糖凝膠電泳：觀察指標(biāo)觀察特異性條帶。野生型等位基因（即C）被切割為163bp和68bp的兩個片段。突變等位基因（即T）不被切割，僅得到一條231bp片段。觀察指標(biāo)觀察特異性條帶。觀察指標(biāo)CCCTTT68bp163bp231bp觀察指標(biāo)CCCTTT68bp163bp231bp結(jié)果分析統(tǒng)計藥物抗性癲癇組、普通癲癇組與正常對照組中各基因型所占的比例。χ2分析。再依據(jù)癲癇的病因及所用藥物再分組，做組內(nèi)及組間比較。結(jié)果分析統(tǒng)計藥物抗性癲癇組、普通癲癇組與正常對照組中各基因型預(yù)期結(jié)果在癲癇病因及所用藥物形同的組內(nèi)，普通癲癇患者與藥物抗性癲癇患者的基因型有統(tǒng)計學(xué)差異，藥物抗性癲癇患者中TT基因型的比例更高。預(yù)期結(jié)果在癲癇病因及所用藥物形同的組內(nèi)，普通癲癇患者與藥物抗分析設(shè)計亮點及創(chuàng)新之處：方法簡便易行。排除了藥物及病因?qū)嶒灲Y(jié)果的影響。不足之處：所需樣品量過大，不易得到。創(chuàng)新性不強。分析設(shè)計亮點及創(chuàng)新之處：主要參考文獻(xiàn)P.Kwanetal.AssociationbetweenABCB1C3435Tpolymorphismanddrug-resistantepilepsyinHanChinese.[J].Epilepsy&Behavior,2007,11(1):112–117.SamarI.Hamdyetal.GenotypeandallelefrequenciesofTPMT,NAT2,GST,SULT1A1andMDR-1intheEgyptianpopulation.[J].LtdBrJClinPharmacol,2003,55(6):560–569.I.Mosyaginetal.AssociationofABCB1geneticvariants3435C>Tand2677G>TtoABCB1mRNAandproteinexpressioninbraintissuefromrefractoryepilepsypatients.[J].Epilepsia,2008,49(9):1555–1561.A.Shahwanetal.ThecontroversialassociationofABCB1polymorphismsinrefractoryepilepsy:AnanalysisofmultipleSNPsinanIrishpopulation.[J].EpilepsyResearch,2007,73(2):192—198.J.R.Hughes.Oneofthehottesttopicsinepileptology:ABCproteins.Oneofthehottesttopicsinepileptology:ABCproteins.Theirinhibitionmaybethefutureforpatientswithintractableseizures.[J].NeurologicalResearch,2008,30(9):920—925.主要參考文獻(xiàn)P.Kwanetal.AssociatiMDR1C3435T基因多態(tài)性與

癲癇藥物抗性的關(guān)系探究ANY

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癲癇藥物抗性的關(guān)系探THANKYOU!THANKYOU!MDR1C3435T基因多態(tài)性與癲癇藥物抗性的關(guān)系探究

分子醫(yī)學(xué)技能實驗設(shè)計組員：王宗明謝詠科馮澤雄石健庭MDR1C3435T基因多態(tài)性與癲癇藥物抗性的關(guān)系探究研究背景癲癇（Epilepsy)：

癲癇是多種病因?qū)е碌囊阅X部神經(jīng)元過度的超同步化發(fā)放所致的突然發(fā)生的短暫性的腦功能障礙?？捎卸喾N原因引起，如腫瘤、外傷、原發(fā)性等。大部分可經(jīng)藥物治療而有效控制甚至痊愈。

研究背景癲癇（Epilepsy)：研究背景藥物抗性癲癇

（Drugresistantepilepsy,DRE)

20%~30%的癲癇患者通過現(xiàn)有的抗癲癇藥物（anti-epilepticdrugs，AEDs）無法達(dá)到有效的治療效果，成為藥物抗性癲癇或稱為難治性癲癇。研究背景藥物抗性癲癇

（Drugresistant研究背景P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）P糖蛋白是一種存在于細(xì)胞膜上的能量依賴性外排泵，可將親脂性藥物泵出細(xì)胞外。 由多耐藥（Multi-drugresistance，MDR）基因MDR1編碼。存在于多種有分泌功能的組織和屏障結(jié)構(gòu)中,如腸粘膜、血腦屏障（血管內(nèi)皮、星形膠質(zhì)細(xì)胞）。

研究背景P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）研究現(xiàn)狀Pgp與DRE的關(guān)系：不同原因引起的DRE患者相比一般癲癇患者，腦組織中Pgp表達(dá)量明顯升高。動物實驗得到相似的結(jié)果。Pgp高表達(dá)的實驗動物腦組織中藥物濃度降低。Pgp拮抗劑部分或完全逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。研究現(xiàn)狀Pgp與DRE的關(guān)系：研究現(xiàn)狀MDR1基因多態(tài)性與DRE：26號外顯子中的MDR1基因3435C>T。可影響十二指腸上皮細(xì)胞中Pgp表達(dá)量與活性，從而影響藥物的吸收。與DRE的關(guān)系存在矛盾的結(jié)果。研究現(xiàn)狀MDR1基因多態(tài)性與DRE：設(shè)計思路排除干擾，“純化”結(jié)果：病因藥物年齡種族性別

……設(shè)計思路排除干擾，“純化”結(jié)果：研究目的與意義明確MDR1C3435T基因多態(tài)性對癲癇耐藥性的影響。排除癲癇病因及藥物種類對結(jié)果的影響。對癲癇耐藥理論研究及指導(dǎo)臨床對不同基因型病人的用藥均有一定意義。研究目的與意義明確MDR1C3435T基因多態(tài)性對癲癇耐藥實驗方法PCR-RFLP限制性片段長度多態(tài)性分析實驗方法PCR-RFLP實驗試劑與儀器試劑：血漿微量DNA提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠電泳所用試劑、PCR反應(yīng)所需酶及引物儀器：離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、電泳槽、染色缸、漂洗缸、紫外檢測儀、EP管、微量移液器實驗試劑與儀器試劑：血漿微量DNA提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝實驗步驟研究對象：不同病因、不同藥物治療的癲癇患者正常對照志愿者漢族取外周血5ml分組標(biāo)準(zhǔn)：患者以用藥后癲癇發(fā)作頻率是否低于用藥前50%實驗步驟研究對象：實驗步驟基因型檢測（PCR-RFLP法）：外周血DNA提取PCR擴(kuò)增酶切瓊脂糖凝膠電泳實驗步驟基因型檢測（PCR-RFLP法）：實驗步驟1.外周血DNA提?。喝】鼓?ml3000rpm×15min，取上清100μl加入200μlDP1液，充分混勻，靜10min加入300μlDP2液，顛倒混勻12000rpm×10min,取上清加等量異戊醇，10000rpm×10min，去上清75%乙醇洗滌，溶于10μlTE緩沖液實驗步驟1.外周血DNA提取：實驗步驟2.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：10×buffer 5μl4種dNTP混合物（每種2.5mmol/L）

4μl引物：MDR-1F(5’-ACTCTTGTTTTCAGCTGCTTG-3’)0.67μMMDR-1R(5’-AGAGACTTACATTAGGCAGTGACTC-3’)0.67μM模板DNA 2μlTaqDNA聚合酶(3U/μl) 1μlMg2+(25mmol/L) 3μl去離子水

32μl實驗步驟2.PCR擴(kuò)增實驗步驟2.PCR擴(kuò)增取五支PCR反應(yīng)管（內(nèi)有緩沖液、原料、引物、聚合酶），分別加入已經(jīng)處理好的標(biāo)本DNA2ul。6000rpm×5s離心。放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。實驗步驟2.PCR擴(kuò)增實驗步驟2.PCR擴(kuò)增PCR程序初次變性94℃5min循環(huán)33次

變性94℃30s

復(fù)性56℃20s

延伸72℃

30s末次延伸72℃5min最終將得到231bp包含3435核苷酸的基因片段。實驗步驟2.PCR擴(kuò)增實驗步驟3.酶切：向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶

Sau3AI37℃過夜。實驗步驟3.酶切：實驗步驟4.瓊脂糖凝膠電泳：（1）瓊脂糖凝膠板的制備：1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。實驗步驟4.瓊脂糖凝膠電泳：實驗步驟4.瓊脂糖凝膠電泳：（2）電泳樣品液的制備：用移液器分別吸取五管中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。

（3）電泳：打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，電泳約30min-60min。（4）染色與檢測：將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。

將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護(hù)罩，打開紫外燈，觀察。實驗步驟4.瓊脂糖凝膠電泳：觀察指標(biāo)觀察特異性條帶。野生型等位基因（即C）被切割為163bp和68bp的兩個片段。突變等位基因（即T）不被切割，僅得到一條231bp片段。觀察指標(biāo)觀察特異性條帶。觀察指標(biāo)CCCTTT68bp163bp231bp觀察指標(biāo)CCCTTT68bp163bp231bp結(jié)果分析統(tǒng)計藥物抗性癲癇組、普通癲癇組與正常對照組中各基因型所占的比例。χ2分析。再依據(jù)癲癇的病因及所用藥物再分組，做組內(nèi)及組間比較。結(jié)果分析統(tǒng)計藥物抗性癲癇組、普通癲癇組與正常對照組中各基因型預(yù)期結(jié)果在癲癇病因及所用藥物形同的組內(nèi)，普通癲癇患者與藥物抗性癲癇患者的基因型有統(tǒng)計學(xué)差異，藥物抗性癲癇患者中TT基因型的比例更高。預(yù)期結(jié)果在癲癇病因及所用藥物形同的組內(nèi)，普通癲癇患者與藥物抗分析設(shè)計亮點及創(chuàng)新之處：方法簡便易行。排除了藥物及病因?qū)嶒灲Y(jié)果的影響。不足之處：所需樣品量過大，不易得到。創(chuàng)新性不強。分析設(shè)計亮點及創(chuàng)新之處：主要參考文獻(xiàn)P.Kwanetal.AssociationbetweenABCB1C3435Tpolymorphismanddrug-resistantepilepsyinHanChinese.[J].Epilepsy&Behavior,2007,11(1):112–117.SamarI.Hamdy