第七章放射免疫分析試劑盒的制備一、概要二、放射免疫分析試劑盒主要組分的制備技術(shù)三、典型放射免疫分析試劑盒的制備四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展第七章一、概要1

放射性同位素在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

γ相機(jī)1體內(nèi)診斷（核醫(yī)學(xué)影像學(xué))SPECTPET2治療（放射治療藥物、種子源）

3體外檢測（放射免疫分析）

2一、概要概要概念與原理主要的放射標(biāo)記免疫分析方法放射標(biāo)記免疫分析方法的特點(diǎn)一、概要概要概念與原理3◆放射免疫分析技術(shù)（RIA）是基于免疫分析的特異性與放射性測量的高靈敏性而建立的一種超微量分析方法，能夠定量檢測生物體內(nèi)成百上千種活性物質(zhì)，是現(xiàn)代生物、醫(yī)學(xué)和臨床診斷的重要手段。1概念與原理以放射性核素（主要為125I,57Co,3H,14C等）標(biāo)記抗原，抗體，配基或受體，在體外條件下，經(jīng)過不同的結(jié)合反應(yīng)（競爭或非競爭性的），再將結(jié)合和未結(jié)合的標(biāo)記物分開，測量其放射性活度，從而計(jì)算各種生物活性物質(zhì)的含量。

◆基本原理◆放射免疫分析技術(shù)（RIA）是基于免疫分析的特異性與放射性測4抗原(Antigen)：能刺激動物機(jī)體的免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與其發(fā)生特異性反應(yīng)（結(jié)合）的物質(zhì)。一般為異種或異體物質(zhì)（即機(jī)體的免疫活性細(xì)胞從未接觸過的異物）。完全抗原：具有上述兩種特性，即單獨(dú)能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，又能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合生成抗原-抗體復(fù)合物。大多為大分子量的蛋白質(zhì)。半抗原(HalfAntigen,Hapten)：單獨(dú)不能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，但能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞起特異性結(jié)合反應(yīng)生成抗原-抗體復(fù)合物的物質(zhì)。與載體結(jié)合后注入動物體內(nèi)能誘導(dǎo)抗體形成，即成為完全抗原。抗原(Antigen)：能刺激動物機(jī)體的免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生5抗體(Antibody)：由抗原誘導(dǎo)形成的一種血清球蛋白，與抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。特異性(Specificity)：抗體抗原反應(yīng)具有特異性，即一種抗體（抗原）只能與相應(yīng)的抗原（抗體）結(jié)合，不能與其它無關(guān)的抗原（抗體）結(jié)合。哺乳動物IgGIgAIgM人體IgGIgAIgMIgDIgE抗體(Antibody)：由抗原誘導(dǎo)形成的一種血清球蛋白，與6主要的放射免疫分析方法放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）

免疫放射量度分析（Immunoradiometricassay,IRMA）

受體放射性配體結(jié)合分析（ReceptorRadio-ligandBondingAssay,PRLBA）

放射受體分析（Radio-ReceptorAssay,RRA）2主要的放射標(biāo)記免疫分析方法主要的放射免疫分析方法放射免疫分析（Radioimmunoa71958-1960年由YalowRSandBresonSA創(chuàng)建，為最早的放射標(biāo)記免疫分析方法。（1977年獲得了諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎）。

原理：用放射性核素標(biāo)記抗原，標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原同時競爭結(jié)合物（如抗體）上有限的結(jié)合位點(diǎn)。然后將結(jié)合與未結(jié)合的游離抗原分離，測定其放射性分布，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中待測物的含量。1)放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）Ag*+Ag+AbAg*-Ab+

Ag-Ab游離物（F）復(fù)合物（B）1958-1960年由YalowRSandBre8對于RIA，應(yīng)滿足以下條件：◆抗原是純一的，只由一種化學(xué)成分組成；◆抗體也僅由一種化學(xué)成分組成；◆抗原與抗體均為單價(jià)，即一分子抗原只能和一分子抗體反應(yīng)；◆標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗原具有相同的物理-化學(xué)性質(zhì)；◆抗原-抗體反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律；◆反應(yīng)達(dá)到平衡；◆結(jié)合抗原和未結(jié)合的游離抗原能完全分開，且不破壞反應(yīng)平衡；◆能準(zhǔn)確測量結(jié)合抗原和游離抗原之比，或結(jié)合抗原與總抗原之比。對于RIA，應(yīng)滿足以下條件：◆抗原是純一的，只由一種化學(xué)成9K1Ag+AbAgAb

k-1

K（親和常數(shù)）==(AgAb）/[Ag][Ab]

k-1

b/f=（AgAb）/(Ag)=K(Ab)b/f=K(AbT-B)K1K1Ag+AbAgAbK（親和10放射免疫分析的Scatchard圖放射免疫分析的Scatchard圖112)免疫放射量度分析（Immunoradiometricassay,IRMA）

在RIA基礎(chǔ)上建立起來的標(biāo)記免疫分析方法。原理：用放射性核素標(biāo)記抗體，以過量的標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合建立的方法.

免疫放射量度分析原理示意圖2)免疫放射量度分析（Immunoradiometric12IRMA劑量反映曲線RIA反映曲線IRMA劑量反映曲線RIA反映曲13RIA與IRMA反應(yīng)式比較方法反應(yīng)式分離方法RIAAg*+Ag+AbAg*-Ab+

Ag-Ab（定量抗體）液相分離固相分離IRMAAg+Ab*Ag-Ab*+

Ab*Ag+Ab*+固相Ab固相Ab-Ag-Ab*+Ab*（過量抗體）免疫吸附劑或固相分離RIA與IRMA的工作原理主要區(qū)別RIAIRMA1競爭性免疫結(jié)合分析2反應(yīng)體系中有抗原、標(biāo)記抗原和抗體3標(biāo)記抗原4在標(biāo)準(zhǔn)曲線劑量反應(yīng)體系中結(jié)合率越大，劑量越小，反之，則越大5免疫結(jié)合反應(yīng)慢1非競爭性免疫結(jié)合分析2反應(yīng)體系中有固相抗原、抗原與標(biāo)記抗體3標(biāo)記抗體4在標(biāo)準(zhǔn)曲線劑量反應(yīng)體系中隨結(jié)合率增高劑量值也隨之增大5免疫結(jié)合反應(yīng)快RIA與IRMA反應(yīng)式比較方法反應(yīng)式分離方法Ag*+Ag+14特點(diǎn)特異性很強(qiáng)，即使化學(xué)結(jié)構(gòu)很接近；靈敏度高，可達(dá)10-14mol/L;精確度較高，放射性活度探測不易受干擾；應(yīng)用范圍較廣，適用于多種化學(xué)結(jié)構(gòu)；操作簡單，分析速度快，樣品不需預(yù)處理。3放射標(biāo)記免疫分析方法的特點(diǎn)特點(diǎn)特異性很強(qiáng)，即使化學(xué)結(jié)構(gòu)很接近；3放射標(biāo)記免疫分析方法15主要組分標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)品抗血清分離劑質(zhì)控血清二、放射標(biāo)記免疫試劑盒主要組分的制備技術(shù)主要組分標(biāo)記物二、放射標(biāo)記免疫試劑盒主要組分的制備技術(shù)16（一）標(biāo)記物的制備技術(shù)核素半衰期衰變方式及分支比主要射線及能量(keV,%)生產(chǎn)方式3H12.3yβ-(100)β-18.61(100)6Li(n,a)3H14C5730yβ+(99.8)EC(0.2)β-155(100)14N(n,p)14C35S87.5dβ-(100)β-167.4(100)35Cl(n,p)35S57Co271.8dIT(100)γ122(85.5)56Fe(d,n)57Co75Se119.8dEC(100)γ136(58)74Se(n,r)75Se125I60.1dEC(100)γ28-35124Xe(n,r)125Xe125I可用于放射免疫分析的放射性核素射線易于探測半衰期適中易于標(biāo)記（一）標(biāo)記物的制備技術(shù)衰變方式及分支比主要射線及能量(keV17蛋白質(zhì)的I標(biāo)記直接氧化親電法間接標(biāo)記法氯胺T法（Chloramine-T,Ch-T）酶促標(biāo)記法Iodogen(氯甘尿法)Bolton-Hunter（BH）方法其它間接標(biāo)記法1125I的標(biāo)記蛋白質(zhì)的I標(biāo)記直接氧化親電法氯胺T法（Chloramine-182標(biāo)記物的分離純化分離純化方法離子交換色譜法凝膠色譜(Sephadex)法薄層色譜法高效液相色譜(HPLC)2標(biāo)記物的分離純化分離純化方法離子交換色譜法193標(biāo)記物的質(zhì)量鑒定質(zhì)量評價(jià)參數(shù)核素(125I)利用率放化純(≥85%)比活度(≥80%)免疫活性(過量抗體結(jié)合率)4標(biāo)記物的穩(wěn)定性及貯存條件多肽類標(biāo)記物通常采用冷凍干燥方法貯存;小分子化合物及單抗標(biāo)記物可以液體狀態(tài)貯存;標(biāo)記物通常在2-8℃條件下保存，有效期約５周。3標(biāo)記物的質(zhì)量鑒定質(zhì)量評價(jià)參數(shù)核素(125I)利用率4標(biāo)20（二）抗原和抗體的制備技術(shù)１免疫原（抗原）的制備免疫原的制備采用生化技術(shù)提取(人體器官或體液）采用偶聯(lián)技術(shù)制備親和層析法分子篩法離子交換法高效液相色譜法（二）抗原和抗體的制備技術(shù)１免疫原（抗原）的制備免疫原的制備212抗體制備抗體多克隆抗體單克隆抗體◆動物種屬選擇動物家兔綿羊豚鼠等2抗體制備抗體多克隆抗體◆動物種屬選擇動物家兔22◆免疫增強(qiáng)劑注射方式皮內(nèi)注射皮下注射腹腔注射靜脈注射凡可增強(qiáng)被免疫動物免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)均可稱為免疫增強(qiáng)劑，其種類眾多。◆免疫注射部位背部腹股溝足墊◆免疫增強(qiáng)劑注射方式皮內(nèi)注射凡可增強(qiáng)被免疫動物免疫應(yīng)答23◆抗血清的質(zhì)量鑒定質(zhì)量鑒定親和性特異性滴度◆抗體貯存抗血清加入0.1%-0.2%防腐劑，按需要量分裝、凍干，-50℃貯存?！艨寡宓馁|(zhì)量鑒定質(zhì)量鑒定親和性◆抗體貯存抗血清加入0.1%24（三）單克隆抗體的制備

1975年由Kohler和Milsten采用雜交瘤技術(shù)第一次獲得。

基本原理：利用動物脾細(xì)胞即淋巴細(xì)胞可以分泌特異抗體，而骨髓瘤能夠在體外連續(xù)培養(yǎng)的性質(zhì)，將兩種細(xì)胞在融合劑（通常為PEG）的作用下進(jìn)行融合，獲得既可分泌特異抗體又可在體外連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞。因此，這種雜交瘤細(xì)胞就能在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生大量單一類型的高純度抗體。單克隆抗體是僅由一種類型的細(xì)胞制造出來的抗體，對應(yīng)于多克隆抗體/多株抗體——由多種類型的細(xì)胞制造出來的一種抗體。（三）單克隆抗體的制備1975年由Kohler和Mil25小鼠免疫細(xì)胞融合篩選克隆化擴(kuò)大培養(yǎng)注如小鼠誘發(fā)腹水單克隆抗體制備過程質(zhì)量鑒定抗體滴度親和常數(shù)交叉反應(yīng)免疫球蛋白類型、亞類小鼠免疫細(xì)胞融合篩選克隆化擴(kuò)大培養(yǎng)注如小鼠誘發(fā)腹水單克隆26特點(diǎn)高度勻質(zhì)性高度特異性來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)缺點(diǎn)熱穩(wěn)定性較差親和性較低價(jià)格較高與多克隆抗體比較特點(diǎn)高度勻質(zhì)性缺點(diǎn)熱穩(wěn)定性較差與多克隆抗體比較27（四）分離劑分離劑的作用是將分析體系中游離部分與結(jié)合部分進(jìn)行有效的分離，直接影響RIA測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。分離劑PR試劑(雙抗體與聚乙二醇沉淀法)磁性分離劑試管固相法分離效果好操作簡便易于大批量自動化分析（四）分離劑分離劑的作用是將分析體系中游離部分與結(jié)合部28（五）標(biāo)準(zhǔn)品與參考血清的制備1標(biāo)準(zhǔn)品要求與被測物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和免疫活性來源充足、價(jià)格便宜穩(wěn)定、均勻一致量值準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)純品制備（被測物質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚、可用化學(xué)方法合成）類似物制備（被測物質(zhì)結(jié)構(gòu)不確定、難以用化學(xué)方法合成）（五）標(biāo)準(zhǔn)品與參考血清的制備1標(biāo)準(zhǔn)品要求與被測物具有相同292參考血清一般含一個或幾個分析物，是免疫分析中用來比較和評價(jià)不同測定系統(tǒng)的偏倚和重復(fù)性的血清，也是用于內(nèi)部或外部質(zhì)量評價(jià)的主要試劑。作用計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差（批內(nèi)、批間精密度）分析誤差原因并進(jìn)行處理監(jiān)督放免試劑盒穩(wěn)定性判斷分析數(shù)據(jù)可靠性要求與待測物質(zhì)相近配制的濃度應(yīng)在測定的工作范圍之內(nèi)（配制高、中、低三種劑量水平）穩(wěn)定、數(shù)量能滿足較長時間使用2參考血清一般含一個或幾個分析物，是免疫分析中用來比30（六）數(shù)據(jù)處理與分析方法的有效性評估評估的內(nèi)容特異性靈敏度精密度準(zhǔn)確性健全性穩(wěn)定性非特異結(jié)合最大結(jié)合（六）數(shù)據(jù)處理與分析方法的有效性評估評估的內(nèi)容特異性31三、幾種典型放射免疫分析試劑盒的制備（一）甲狀腺素放射免疫分析試劑盒的制備（二）游離甲狀腺素FT4試劑盒的制備（三）人血清促甲狀腺激素免疫放射分析試劑盒的制備三、幾種典型放射免疫分析試劑盒的制備（一）甲狀腺素放射免疫分32四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展國際市場市場規(guī)模接近300億美元，近期每年增長率在7-9%左右。特點(diǎn)◆

檢測品種多，達(dá)近千種，并且還在持續(xù)增加；◆

同一公司有多個產(chǎn)品技術(shù)平臺；◆多種免疫分析方法并存，相互競爭，相互補(bǔ)充；◆

大公司產(chǎn)品系列全，小公司產(chǎn)品有特色；◆

高度集成、自動化的儀器診斷與簡單、快速便于普及的快速診斷。四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展國際市場特點(diǎn)33國內(nèi)◆

200余廠家；

北京北方生物技術(shù)研究所濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司北京科美東雅生物技術(shù)有限公司原子高科股份有限公司◆

100余種系列產(chǎn)品；◆市場規(guī)模40億元（國內(nèi)與國外各占一半）；◆年增長率10-16%；國內(nèi)34面臨的挑戰(zhàn)◆酶免疫分析(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)◆時間分辨熒光免疫分析(Time-resolvedFluoroimmunoassay,TRF)◆化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminesentimmunoassay,CLIA）面臨的挑戰(zhàn)◆酶免疫分析(Enzyme-linkedim35放射免疫分析和非放射免疫分析技術(shù)性能比較種類RIAELISATRFIACLIA示蹤物

125I酶Eu3+酶，吖啶酯反應(yīng)條件液固固固固操作程序簡易簡易簡易簡易分析自動化否否可可分離B、F離心、洗滌洗滌洗滌洗滌穩(wěn)定性高較差高高標(biāo)記物有效期短較長長長影響因素少多多少溫育時間長較短長較短價(jià)格低低高高政策環(huán)境較嚴(yán)格寬松寬松寬松放射免疫分析和非放射免疫分析技術(shù)性能比較種類RIAELIS36傳統(tǒng)的RIA使用市場可能會逐漸縮?。☆A(yù)計(jì)在未來十年中，體外診斷技術(shù)將會快速發(fā)展，并出現(xiàn)放免、酶免、化學(xué)發(fā)光、時間分辨熒光以及金標(biāo)試紙條、生物芯片等多種體外診斷試劑優(yōu)勢互補(bǔ)，各自在不同領(lǐng)域廣泛應(yīng)用共存，國內(nèi)和國外廠家紛爭的競爭局面。傳統(tǒng)的RIA使用市場可能會逐漸縮?。☆A(yù)計(jì)在37第七章放射免疫分析試劑盒的制備一、概要二、放射免疫分析試劑盒主要組分的制備技術(shù)三、典型放射免疫分析試劑盒的制備四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展第七章一、概要38

放射性同位素在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

γ相機(jī)1體內(nèi)診斷（核醫(yī)學(xué)影像學(xué))SPECTPET2治療（放射治療藥物、種子源）

3體外檢測（放射免疫分析）

39一、概要概要概念與原理主要的放射標(biāo)記免疫分析方法放射標(biāo)記免疫分析方法的特點(diǎn)一、概要概要概念與原理40◆放射免疫分析技術(shù)（RIA）是基于免疫分析的特異性與放射性測量的高靈敏性而建立的一種超微量分析方法，能夠定量檢測生物體內(nèi)成百上千種活性物質(zhì)，是現(xiàn)代生物、醫(yī)學(xué)和臨床診斷的重要手段。1概念與原理以放射性核素（主要為125I,57Co,3H,14C等）標(biāo)記抗原，抗體，配基或受體，在體外條件下，經(jīng)過不同的結(jié)合反應(yīng)（競爭或非競爭性的），再將結(jié)合和未結(jié)合的標(biāo)記物分開，測量其放射性活度，從而計(jì)算各種生物活性物質(zhì)的含量。

◆基本原理◆放射免疫分析技術(shù)（RIA）是基于免疫分析的特異性與放射性測41抗原(Antigen)：能刺激動物機(jī)體的免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與其發(fā)生特異性反應(yīng)（結(jié)合）的物質(zhì)。一般為異種或異體物質(zhì)（即機(jī)體的免疫活性細(xì)胞從未接觸過的異物）。完全抗原：具有上述兩種特性，即單獨(dú)能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，又能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合生成抗原-抗體復(fù)合物。大多為大分子量的蛋白質(zhì)。半抗原(HalfAntigen,Hapten)：單獨(dú)不能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，但能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞起特異性結(jié)合反應(yīng)生成抗原-抗體復(fù)合物的物質(zhì)。與載體結(jié)合后注入動物體內(nèi)能誘導(dǎo)抗體形成，即成為完全抗原?？乖?Antigen)：能刺激動物機(jī)體的免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生42抗體(Antibody)：由抗原誘導(dǎo)形成的一種血清球蛋白，與抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。特異性(Specificity)：抗體抗原反應(yīng)具有特異性，即一種抗體（抗原）只能與相應(yīng)的抗原（抗體）結(jié)合，不能與其它無關(guān)的抗原（抗體）結(jié)合。哺乳動物IgGIgAIgM人體IgGIgAIgMIgDIgE抗體(Antibody)：由抗原誘導(dǎo)形成的一種血清球蛋白，與43主要的放射免疫分析方法放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）

免疫放射量度分析（Immunoradiometricassay,IRMA）

受體放射性配體結(jié)合分析（ReceptorRadio-ligandBondingAssay,PRLBA）

放射受體分析（Radio-ReceptorAssay,RRA）2主要的放射標(biāo)記免疫分析方法主要的放射免疫分析方法放射免疫分析（Radioimmunoa441958-1960年由YalowRSandBresonSA創(chuàng)建，為最早的放射標(biāo)記免疫分析方法。（1977年獲得了諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎）。

原理：用放射性核素標(biāo)記抗原，標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原同時競爭結(jié)合物（如抗體）上有限的結(jié)合位點(diǎn)。然后將結(jié)合與未結(jié)合的游離抗原分離，測定其放射性分布，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中待測物的含量。1)放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）Ag*+Ag+AbAg*-Ab+

Ag-Ab游離物（F）復(fù)合物（B）1958-1960年由YalowRSandBre45對于RIA，應(yīng)滿足以下條件：◆抗原是純一的，只由一種化學(xué)成分組成；◆抗體也僅由一種化學(xué)成分組成；◆抗原與抗體均為單價(jià)，即一分子抗原只能和一分子抗體反應(yīng)；◆標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗原具有相同的物理-化學(xué)性質(zhì)；◆抗原-抗體反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律；◆反應(yīng)達(dá)到平衡；◆結(jié)合抗原和未結(jié)合的游離抗原能完全分開，且不破壞反應(yīng)平衡；◆能準(zhǔn)確測量結(jié)合抗原和游離抗原之比，或結(jié)合抗原與總抗原之比。對于RIA，應(yīng)滿足以下條件：◆抗原是純一的，只由一種化學(xué)成46K1Ag+AbAgAb

k-1

K（親和常數(shù)）==(AgAb）/[Ag][Ab]

k-1

b/f=（AgAb）/(Ag)=K(Ab)b/f=K(AbT-B)K1K1Ag+AbAgAbK（親和47放射免疫分析的Scatchard圖放射免疫分析的Scatchard圖482)免疫放射量度分析（Immunoradiometricassay,IRMA）

在RIA基礎(chǔ)上建立起來的標(biāo)記免疫分析方法。原理：用放射性核素標(biāo)記抗體，以過量的標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合建立的方法.

免疫放射量度分析原理示意圖2)免疫放射量度分析（Immunoradiometric49IRMA劑量反映曲線RIA反映曲線IRMA劑量反映曲線RIA反映曲50RIA與IRMA反應(yīng)式比較方法反應(yīng)式分離方法RIAAg*+Ag+AbAg*-Ab+

Ag-Ab（定量抗體）液相分離固相分離IRMAAg+Ab*Ag-Ab*+

Ab*Ag+Ab*+固相Ab固相Ab-Ag-Ab*+Ab*（過量抗體）免疫吸附劑或固相分離RIA與IRMA的工作原理主要區(qū)別RIAIRMA1競爭性免疫結(jié)合分析2反應(yīng)體系中有抗原、標(biāo)記抗原和抗體3標(biāo)記抗原4在標(biāo)準(zhǔn)曲線劑量反應(yīng)體系中結(jié)合率越大，劑量越小，反之，則越大5免疫結(jié)合反應(yīng)慢1非競爭性免疫結(jié)合分析2反應(yīng)體系中有固相抗原、抗原與標(biāo)記抗體3標(biāo)記抗體4在標(biāo)準(zhǔn)曲線劑量反應(yīng)體系中隨結(jié)合率增高劑量值也隨之增大5免疫結(jié)合反應(yīng)快RIA與IRMA反應(yīng)式比較方法反應(yīng)式分離方法Ag*+Ag+51特點(diǎn)特異性很強(qiáng)，即使化學(xué)結(jié)構(gòu)很接近；靈敏度高，可達(dá)10-14mol/L;精確度較高，放射性活度探測不易受干擾；應(yīng)用范圍較廣，適用于多種化學(xué)結(jié)構(gòu)；操作簡單，分析速度快，樣品不需預(yù)處理。3放射標(biāo)記免疫分析方法的特點(diǎn)特點(diǎn)特異性很強(qiáng)，即使化學(xué)結(jié)構(gòu)很接近；3放射標(biāo)記免疫分析方法52主要組分標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)品抗血清分離劑質(zhì)控血清二、放射標(biāo)記免疫試劑盒主要組分的制備技術(shù)主要組分標(biāo)記物二、放射標(biāo)記免疫試劑盒主要組分的制備技術(shù)53（一）標(biāo)記物的制備技術(shù)核素半衰期衰變方式及分支比主要射線及能量(keV,%)生產(chǎn)方式3H12.3yβ-(100)β-18.61(100)6Li(n,a)3H14C5730yβ+(99.8)EC(0.2)β-155(100)14N(n,p)14C35S87.5dβ-(100)β-167.4(100)35Cl(n,p)35S57Co271.8dIT(100)γ122(85.5)56Fe(d,n)57Co75Se119.8dEC(100)γ136(58)74Se(n,r)75Se125I60.1dEC(100)γ28-35124Xe(n,r)125Xe125I可用于放射免疫分析的放射性核素射線易于探測半衰期適中易于標(biāo)記（一）標(biāo)記物的制備技術(shù)衰變方式及分支比主要射線及能量(keV54蛋白質(zhì)的I標(biāo)記直接氧化親電法間接標(biāo)記法氯胺T法（Chloramine-T,Ch-T）酶促標(biāo)記法Iodogen(氯甘尿法)Bolton-Hunter（BH）方法其它間接標(biāo)記法1125I的標(biāo)記蛋白質(zhì)的I標(biāo)記直接氧化親電法氯胺T法（Chloramine-552標(biāo)記物的分離純化分離純化方法離子交換色譜法凝膠色譜(Sephadex)法薄層色譜法高效液相色譜(HPLC)2標(biāo)記物的分離純化分離純化方法離子交換色譜法563標(biāo)記物的質(zhì)量鑒定質(zhì)量評價(jià)參數(shù)核素(125I)利用率放化純(≥85%)比活度(≥80%)免疫活性(過量抗體結(jié)合率)4標(biāo)記物的穩(wěn)定性及貯存條件多肽類標(biāo)記物通常采用冷凍干燥方法貯存;小分子化合物及單抗標(biāo)記物可以液體狀態(tài)貯存;標(biāo)記物通常在2-8℃條件下保存，有效期約５周。3標(biāo)記物的質(zhì)量鑒定質(zhì)量評價(jià)參數(shù)核素(125I)利用率4標(biāo)57（二）抗原和抗體的制備技術(shù)１免疫原（抗原）的制備免疫原的制備采用生化技術(shù)提取(人體器官或體液）采用偶聯(lián)技術(shù)制備親和層析法分子篩法離子交換法高效液相色譜法（二）抗原和抗體的制備技術(shù)１免疫原（抗原）的制備免疫原的制備582抗體制備抗體多克隆抗體單克隆抗體◆動物種屬選擇動物家兔綿羊豚鼠等2抗體制備抗體多克隆抗體◆動物種屬選擇動物家兔59◆免疫增強(qiáng)劑注射方式皮內(nèi)注射皮下注射腹腔注射靜脈注射凡可增強(qiáng)被免疫動物免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)均可稱為免疫增強(qiáng)劑，其種類眾多?！裘庖咦⑸洳课槐巢扛构蓽献銐|◆免疫增強(qiáng)劑注射方式皮內(nèi)注射凡可增強(qiáng)被免疫動物免疫應(yīng)答60◆抗血清的質(zhì)量鑒定質(zhì)量鑒定親和性特異性滴度◆抗體貯存抗血清加入0.1%-0.2%防腐劑，按需要量分裝、凍干，-50℃貯存。◆抗血清的質(zhì)量鑒定質(zhì)量鑒定親和性◆抗體貯存抗血清加入0.1%61（三）單克隆抗體的制備

1975年由Kohler和Milsten采用雜交瘤技術(shù)第一次獲得。

基本原理：利用動物脾細(xì)胞即淋巴細(xì)胞可以分泌特異抗體，而骨髓瘤能夠在體外連續(xù)培養(yǎng)的性質(zhì)，將兩種細(xì)胞在融合劑（通常為PEG）的作用下進(jìn)行融合，獲得既可分泌特異抗體又可在體外連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞。因此，這種雜交瘤細(xì)胞就能在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生大量單一類型的高純度抗體。單克隆抗體是僅由一種類型的細(xì)胞制造出來的抗體，對應(yīng)于多克隆抗體/多株抗體——由多種類型的細(xì)胞制造出來的一種抗體。（三）單克隆抗體的制備1975年由Kohler和Mil62小鼠免疫細(xì)胞融合篩選克隆化擴(kuò)大培養(yǎng)注如小鼠誘發(fā)腹水單克隆抗體制備過程質(zhì)量鑒定抗體滴度親和常數(shù)交叉反應(yīng)免疫球蛋白類型、亞類小鼠免疫細(xì)胞融合篩選克隆化擴(kuò)大培養(yǎng)注如小鼠誘發(fā)腹水單克隆63特點(diǎn)高度勻質(zhì)性高度特異性來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)缺點(diǎn)熱穩(wěn)定性較差親和性較低價(jià)格較高與多克隆抗體比較特點(diǎn)高度勻質(zhì)性缺點(diǎn)熱穩(wěn)定性較差與多克隆抗體比較64（四）分離劑分離劑的作用是將分析體系中游離部分與結(jié)合部分進(jìn)行有效的分離，直接影響RIA測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。分離劑PR試劑(雙抗體與聚乙二醇沉淀法)磁性分離劑試管固相法分離效果好操作簡便易于大批量自動化分析（四）分離劑分離劑的作用是將分析體系中游離部分與結(jié)合部65（五）標(biāo)準(zhǔn)品與參考血清的制備1標(biāo)準(zhǔn)品要求與被測物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和免疫活性來源充足、價(jià)格便宜穩(wěn)定、均勻一致量值準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)純品制備（被測物質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚、可用化學(xué)方法合成）類似物制備（被測物質(zhì)結(jié)構(gòu)不確定、難以用化學(xué)方法合成）（五）標(biāo)準(zhǔn)品與參考血清的制備1標(biāo)準(zhǔn)品要求與被測物具有相同662參考血清一般含一個或幾個分析物，是免疫分析中用來比較和評價(jià)不同測定系統(tǒng)的偏倚和重復(fù)性的血清，也是用于內(nèi)部或外部質(zhì)量評