昆醫(yī)分生基因治療不考試?yán)メt(yī)分生基因治療不考試1（優(yōu)選）昆醫(yī)分生基因治療不考試（優(yōu)選）昆醫(yī)分生基因治療不考試2基因治療概況基因治療，是基于修飾活細(xì)胞遺傳物質(zhì)而進(jìn)行的醫(yī)學(xué)干預(yù)，是一種以預(yù)防和治療疾病為目的的人類基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。即：以改變細(xì)胞遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)治療?；蛑委煾艣r基因治療概況基因治療，是基于修飾活細(xì)胞遺傳物質(zhì)而進(jìn)行的醫(yī)學(xué)干3基因研究與治療發(fā)展歷程發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)建立DNA重組技術(shù)在大腸桿菌中成功表達(dá)胰島素第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素上市美國(guó)批準(zhǔn)第一個(gè)體細(xì)胞基因治療方案，治療嚴(yán)重綜合性免疫缺損癥英國(guó)培養(yǎng)出第一只克隆羊多莉人類基因組計(jì)劃“工作草圖”繪制完畢基因治療產(chǎn)品上市19531973197819821990199720002004基因研究與治療發(fā)展歷程發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)建立DNA重組技術(shù)4

基因治療的發(fā)展史及研究概況

1967年Nirenbeg首先提出基因工程可用于人類疾病治療的設(shè)想。1980年Cline首次將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠獲得成功，次年對(duì)2名重癥β-地中海貧血患者進(jìn)行治療，雖未獲成功，1985年美聯(lián)邦國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)成立了基因治療委員會(huì)，并于1989年首次批準(zhǔn)Arderson等將抗新霉素基因?qū)牒谏亓龌颊叩哪[瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)作為標(biāo)記基因。1990年Blaese將正常人的腺苷脫胺酶基因?qū)?名腺苷胱氨酸（ADA）缺乏癥患者的淋巴細(xì)胞獲得成功，成為醫(yī)學(xué)史上的重要里程碑。1991年Szczylik等在小鼠慢粒白血病模型上，將反義寡核苷酸導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，阻斷了癌細(xì)胞的增殖.

在我國(guó)，1991年12月復(fù)旦大學(xué)遺傳研究所與第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院合作，以攜帶凝血因子IX基因的反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，對(duì)兩例血友病B患者進(jìn)行了首次基因治療?；蛑委煹陌l(fā)展史及研究概況1967年Nirenbeg首先5

惡性腫瘤心血管疾病遺傳病感染性疾病威脅人類健康的重大疾病基因治療對(duì)象基因治療概況惡性腫瘤威脅人類健康的重大疾病基因治療對(duì)象基因治療概6基因治療藥與基因工程藥DNAPROTEINRNA基因工程藥基因治療藥基因治療概況基因治療藥與基因工程藥DNAPROTEINRNA基因工程藥基7人類基因組計(jì)劃“工作草圖”繪制完畢即采用多態(tài)性連鎖分析的方法，尋找具有基因缺陷的染色體，并判斷被檢者是否存在該條染色體的缺陷。InvivoGATusingrecombinantadenovirusesorliposomestodelivertheCFTRgene它最常見的點(diǎn)突變是在第12、13或61密碼子的突變。直接診斷的前提是被檢測(cè)基因必須已被克隆，基因的正常序列和結(jié)構(gòu)已闡明。技術(shù)含量高，生產(chǎn)成本低；GenetherapystrategyTcellsandhemopoieticstemcells或應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增病原體基因的保守序列；國(guó)際基因治療研究概況-載體即采用多態(tài)性連鎖分析的方法，尋找具有基因缺陷的染色體，并判斷被檢者是否存在該條染色體的缺陷。①必須較堅(jiān)固，足以耐受處理，易于由人體分離并便于回輸。嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷病SCIDUpdatedJuly.Insomecases,aphospholipidbilayerisformed,withhydrophilicphosphategroupslocatedontheexternalsurfacesandhydrophobiclipidslocatedinternally(left).Cellsaltered美國(guó)Gelsinger事件4、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)(SSCP)；腺病毒載體（最常用）331項(xiàng)（24.國(guó)際基因治療研究概況-地理分布治療基因載體靶細(xì)胞基因治療制品基因治療要素基因治療概況人類基因組計(jì)劃“工作草圖”繪制完畢治療基因載體靶細(xì)胞基因治療8最理想的方式目前的主要方式基因治療策略基因治療概況

基因替代（GeneReplacement）基因修復(fù)（GeneModification）基因添加（GeneAddition）基因失活（Geneblock）最理想的方式目前的主要方式基因治療策略基因治療概況基因替代9昆醫(yī)分生基因治療不考試課件10昆醫(yī)分生基因治療不考試課件11昆醫(yī)分生基因治療不考試課件12昆醫(yī)分生基因治療不考試課件13昆醫(yī)分生基因治療不考試課件14昆醫(yī)分生基因治療不考試課件15

體細(xì)胞基因治療生殖細(xì)胞基因治療基因治療種類基因治療概況體細(xì)胞基因治療基因治療種類基因治療概況16基因治療的途徑因受體細(xì)胞的不同分為兩種：①生殖細(xì)胞基因治療(germcellgenetherapy)：是將正常外源基因轉(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞(精細(xì)胞、卵細(xì)胞及中早期胚胎)中，使子代成為正常的個(gè)體。由于此法改變了生殖細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，影響人類基因構(gòu)成，并影響到子代的發(fā)育，同時(shí)涉及一系列的倫理問題，美聯(lián)邦國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)目前規(guī)定禁止用于人類，僅可用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。②體細(xì)胞基因治療(somaticcellgenetherapy)：是指將正常基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，從而達(dá)到治療目的。由于該療法只涉及體細(xì)胞的遺傳改變，而不影響子代，故到目前為止，人類所進(jìn)行的基因治療，均為體細(xì)胞基因治療基因治療的途徑因受體細(xì)胞的不同分為兩種：17昆醫(yī)分生基因治療不考試課件18目前使用較多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。1990年Blaese將正常人的腺苷脫胺酶基因?qū)?名腺苷胱氨酸（ADA）缺乏癥患者的淋巴細(xì)胞獲得成功，成為醫(yī)學(xué)史上的重要里程碑。1991年Szczylik等在小鼠慢粒白血病模型上，將反義寡核苷酸導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，阻斷了癌細(xì)胞的增殖.3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；TcellsandhemopoieticstemcellsTcellsandhemopoieticstemcells第一項(xiàng)體細(xì)胞基因治療臨床試驗(yàn)ras癌基因是人類腫瘤中普遍存在的被激活的癌基因。目前適用基因治療的疾病直接診斷的前提是被檢測(cè)基因必須已被克隆，基因的正常序列和結(jié)構(gòu)已闡明。HemopoieticstemcellsTheefficiencyoftransfercanbeincreasedbythefurtherrefinementofcouplinganinactivatedadenovirustotheDNA

transferrincomplex:followingendocytosisandtransporttolysosomes,theaddedadenoviruscausesvesicledisruption,allowingtheDNAtoavoiddegradationandtosurviveinthecytoplasm.4、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)(SSCP)；③生物法：生物法主要是指病毒介導(dǎo)(以病毒為載體)的基因轉(zhuǎn)移。Familialhypercholesterolemia4歲女孩，AshantiDesilva基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)病毒為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移具有靶向性好、效率高的特點(diǎn)，另外可利用細(xì)胞自身機(jī)制生產(chǎn)所需要的目的蛋白質(zhì)，是目前進(jìn)入臨床前期研究的較為理想的載體之一。血紅蛋白病，包括異常血紅蛋白病、α-地中海貧血和β-地中海貧血；ExvivoGATusingretrovirustodelivertheLDLreceptorgene(LDLR)它最常見的點(diǎn)突變是在第12、13或61密碼子的突變。體外基因治療(Exvivo)：從病人體內(nèi)獲取細(xì)胞，體外培養(yǎng)并進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移后，重新輸入患者體內(nèi)前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子基因后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，腫瘤轉(zhuǎn)移灶被T細(xì)胞及NK細(xì)胞附著?；蛑委熗緩交蛑委煾攀瞿壳笆褂幂^多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮19體內(nèi)基因治療(Invivo)：直接將基因或改造后的病毒(插入目的基因)導(dǎo)入人體患病組織中攜p53基因的重組腺病毒導(dǎo)入人體腫瘤組織引起腫瘤細(xì)胞裂解基因治療途徑基因治療概況體內(nèi)基因治療(Invivo)：直接將基因或改造后的病毒(插20基因治療的要求是：①向一定的細(xì)胞導(dǎo)入治療基因；②輸送到細(xì)胞核，并整合到DNA的正確位置；③穩(wěn)定的表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、定位和修飾?；蛑委煹囊笫牵?1基因治療的途徑基因治療的途徑22選擇靶細(xì)胞的原則是：①必須較堅(jiān)固，足以耐受處理，易于由人體分離并便于回輸。②具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長(zhǎng)，能存活幾個(gè)月甚至幾年，最好可延續(xù)至病人的整個(gè)生命期。③易于受外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

目前使用較多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。腫瘤基因治療常用的靶細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞自身，其次是淋巴細(xì)胞和造血干細(xì)胞。選擇靶細(xì)胞的原則是：23基因轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法基因轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法24基因轉(zhuǎn)移方法分三類：①化學(xué)法：包括磷酸鹽沉淀、脂質(zhì)體(Plasmid-liposomecomplex)包埋、多聚季銨鹽和DEAE-葡萄糖等化學(xué)試劑轉(zhuǎn)移。這些方法通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性或增加DNA與細(xì)胞的吸附而實(shí)施基因轉(zhuǎn)移。②物理法：包括電穿孔、顯微注射、裸露DNA直接注射、顆粒轟擊等。物理方法轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)易受DNA酶降解，不易穩(wěn)定地存在于細(xì)胞基因中。③生物法：生物法主要是指病毒介導(dǎo)(以病毒為載體)的基因轉(zhuǎn)移。包括DNA病毒如腺病毒(AV)、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、細(xì)小病毒(HI)、痘苗病毒(VV)和RNA病毒即反轉(zhuǎn)錄病毒(RV)?；蜣D(zhuǎn)移方法分三類：25生物傳導(dǎo)的方法生物傳導(dǎo)的方法26Adenovirusesentercellsbyreceptor-mediatedendocytosis:Bindingofviralcoatproteintoaspecificreceptorontheplasmamembraneofcellsisfollowedbyendocytosis,aprocessinwhichtheplasmamembraneinvaginatesandthenpinchesofftoformanintracellularvesicle(endosome).SubsequentvesicledisruptionbyadenovirusproteinsallowsvirionstoescapeandmigratetowardsthenucleuswhereviralDNAentersthroughporesinthenuclearenvelope.AdaptedfromCuriel(1994)withpermissionfromtheNewYorkAcademyofSciencesAdenovirusesentercellsbyre27Genetransferviathereceptor-mediatedendocytosispathway.ThenegativelychargedplasmidDNAcanbindreversiblytothepositivelychargedpolylysineattachedtothetransferrinmolecule.Duringthisprocess,theDNAiscondensedintoacompactcirculartoroidwiththetransferrinmoleculeslocatedexternallyandfreetobindtocellsurfacetransferrinreceptors.Followinginitialendosomeformation,aportionoftheendocytosedconjugatescanmigratetothenucleus,althoughaverysignificantfractionisalternativelytransferredtolysosomeswheretheDNAisdegraded.TheefficiencyoftransfercanbeincreasedbythefurtherrefinementofcouplinganinactivatedadenovirustotheDNA

transferrincomplex:followingendocytosisandtransporttolysosomes,theaddedadenoviruscausesvesicledisruption,allowingtheDNAtoavoiddegradationandtosurviveinthecytoplasm.AdaptedfromCuriel(1994)withpermissionfromTheNewYorkAcademyofSciences.Genetransferviathereceptor281967年Nirenbeg首先提出基因工程可用于人類疾病治療的設(shè)想。Exogenousgenesthatintegrateintochromosomescanbestablytransmittedtoalldaughtercells,unlikeepisomal(extrachromosomal)genes.ExvivoGATusingrecombinantretrovirusescontaininganADAgene體外基因治療(Exvivo)：從病人體內(nèi)獲取細(xì)胞，體外培養(yǎng)并進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移后，重新輸入患者體內(nèi)(C)Useofliposomestotransfergenesintocells.或?qū)⒑怂岱肿与s交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。p53基因突變是人類癌癥中另一個(gè)常見突變基因，約50%以上的癌癥都有p53基因突變。Exvivogeneaugmentationtherapyforadenosinedeaminase(ADA)deficiency.Duringthisprocess,theDNAiscondensedintoacompactcirculartoroidwiththetransferrinmoleculeslocatedexternallyandfreetobindtocellsurfacetransferrinreceptors.門靜脈注射大劑量的重組腺病毒國(guó)際基因治療研究概況-載體體內(nèi)基因治療(Invivo)：直接將基因或改造后的病毒(插入目的基因)導(dǎo)入人體患病組織中②物理法：包括電穿孔、顯微注射、裸露DNA直接注射、顆粒轟擊等。1，3/9例分別在近3年及5年后相繼表現(xiàn)出T細(xì)胞白血病的癥狀p53基因突變是人類癌癥中另一個(gè)常見突變基因，約50%以上的癌癥都有p53基因突變。巴黎NeckerEnfantsMalade醫(yī)院采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶IL2RG/γc基因治療重癥聯(lián)合免疫缺陷?。⊿CID-X1）的臨床試驗(yàn)；④外源DNA的檢測(cè)。不論病原體是病毒、細(xì)菌或寄生蟲，它們都具有特異的基因組。截止2007年7月，全世界批準(zhǔn)的基因治療臨床試驗(yàn)方案概況美國(guó)批準(zhǔn)第一個(gè)體細(xì)胞基因治療方案，治療嚴(yán)重綜合性免疫缺損癥②物理法：包括電穿孔、顯微注射、裸露DNA直接注射、顆粒轟擊等。Inothercasesthereisamultilamellarlipidenvelope.它最常見的點(diǎn)突變是在第12、13或61密碼子的突變。前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子基因后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，腫瘤轉(zhuǎn)移灶被T細(xì)胞及NK細(xì)胞附著。Bycontrast,episomalgeneswhichdonotintegratebutreplicateextrachromosomally(underthecontrolofavectororiginofreplication)maynotsegregatetoalldaughtercellsduringsubsequentmitoses.UpdatedJuly.以改變細(xì)胞遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)治療。InvivoGATusingrecombinantadenovirusesorliposomestodelivertheCFTRgene基因治療方案總數(shù)1309項(xiàng)Asaresult,thistypeofapproachhasbeenparticularlyappliedingenetherapieswherethetargettissueconsistsofnondividingcells。基因治療藥與基因工程藥目前使用較多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。SubsequentvesicledisruptionbyadenovirusproteinsallowsvirionstoescapeandmigratetowardsthenucleuswhereviralDNAentersthroughporesinthenuclearenvelope.Bycontrast,episomalgeneswhichdonotintegratebutreplicateextrachromosomally(underthecontrolofavectororiginofreplication)maynotsegregatetoalldaughtercellsduringsubsequentmitoses.GenetherapystrategyTheplasmamembranesofcellsarefluidstructureswhoseprincipalcomponentsarephospholipids,andsomixingofcellsandliposomescanresultinoccasionalfusionbetweenthelipidbilayeroftheliposomeandtheplasmamembrane.1967年Nirenbeg首先提出基因工程可用于人類疾病治療的設(shè)想。AnionicliposomeshaveanegativesurfacechargeandwhenthelipidconstitutentsaremixedwithnegativelychargedDNAmolecules(seepanelCbelow),theDNAisinternalized.目前適用基因治療的疾?、傧蛞欢ǖ募?xì)胞導(dǎo)入治療基因；Exvivogeneaugmentationtherapyforadenosinedeaminase(ADA)deficiency.理想載體目前仍無(wú)法得到。Invivoliposomegenedelivery.(A)and(B)Structureofliposomes.Liposomesaresyntheticvesicleswhichcanformspontaneouslyinaqueoussolutionfollowingartificialmixingoflipidmolecules.Insomecases,aphospholipidbilayerisformed,withhydrophilicphosphategroupslocatedontheexternalsurfacesandhydrophobiclipidslocatedinternally(left).Inothercasesthereisamultilamellarlipidenvelope.AnionicliposomeshaveanegativesurfacechargeandwhenthelipidconstitutentsaremixedwithnegativelychargedDNAmolecules(seepanelCbelow),theDNAisinternalized.CationicliposomeshaveasurfacepositivechargeandDNAmoleculesbindtothesurfaceofliposomes.(C)Useofliposomestotransfergenesintocells.ThisfigureillustratestheuseofanionicliposomestotransferinternallylocatedDNAintocells.Theplasmamembranesofcellsarefluidstructureswhoseprincipalcomponentsarephospholipids,andsomixingofcellsandliposomescanresultinoccasionalfusionbetweenthelipidbilayeroftheliposomeandtheplasmamembrane.Whenthishappenstheclonedgenescanbetransferredintothecytoplasmofacell,andcanthencemigratetothenucleusbypassivediffusionthroughtheporesofthenuclearenvelope.Notethat,inpractice,cationicliposomeshavebeenmorewidelyusedfortransferringDNAintocells.1967年Nirenbeg首先提出基因工程可用于人類疾病治療29基因的整合途徑基因的整合途徑30Exogenousgenesthatintegrateintochromosomescanbestablytransmittedtoalldaughtercells,unlikeepisomal(extrachromosomal)genes.Thefigureillustratestwopossiblefatesofgenesthathavebeentransferredintonucleatedcells.Genetherapyinvolvingchromosomalintegrationofexogenousgenesoffersthepossibilityofcontinuedstableexpressionoftheinsertedgeneandapermanentcure,butcarriescertainrisks,notablythepossibilitythatoneoftheintegrationeventsmayresultincancer.Bycontrast,episomalgeneswhichdonotintegratebutreplicateextrachromosomally(underthecontrolofavectororiginofreplication)maynotsegregatetoalldaughtercellsduringsubsequentmitoses.Asaresult,thistypeofapproachhasbeenparticularlyappliedingenetherapieswherethetargettissueconsistsofnondividingcells。Exogenousgenesthatintegrate31基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體32轉(zhuǎn)運(yùn)載體要求：①能夠高效轉(zhuǎn)運(yùn)治療所需的一個(gè)或多個(gè)目的基因；②載體具有準(zhǔn)確的靶向性，無(wú)免疫原性，易于生產(chǎn)、提純；③無(wú)致病性，對(duì)受者及環(huán)境無(wú)危害；④使其所攜帶的基因能按要求準(zhǔn)確表達(dá)。理想載體目前仍無(wú)法得到。病毒為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移具有靶向性好、效率高的特點(diǎn)，另外可利用細(xì)胞自身機(jī)制生產(chǎn)所需要的目的蛋白質(zhì)，是目前進(jìn)入臨床前期研究的較為理想的載體之一。轉(zhuǎn)運(yùn)載體要求：33目前適用基因治療的疾病⑴遺傳性疾病，首選單基因缺陷癥如鐮狀細(xì)胞病、甲型和乙型血友病、地中海貧血、ADA缺乏所致重癥聯(lián)合免疫缺陷病、嘌呤核苷磷酸化酶PNP缺乏癥、遺傳性α1-抗胰蛋白酶缺乏癥、囊性纖維化等。⑵免疫缺乏病，如白細(xì)胞粘附分子缺陷病、TcR-CD3缺乏癥。⑶腫瘤及惡性血液病，主要適用于基因突變者如膀胱癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、白血病等。⑷其他疾病如糖尿病、肌營(yíng)養(yǎng)不良、高血壓、某些精神病、AIDS、慢性活動(dòng)型肝炎、心血管疾病等。目前適用基因治療的疾病⑴遺傳性疾病，首選單基因缺陷癥如鐮狀34單基因疾病的基因治療單基因疾病的基因治療35

Exvivogeneaugmentationtherapyforadenosinedeaminase(ADA)deficiency.

Notethatidentificationofsuitablytransformedcellsishelpedbyhavinganappropriateselectablemarkerintheretrovirusvector,suchasaneoRgenewhichconfersresistancetotheneomycinanalogG418.Followinginfection,thetargetcellscanbeculturedinamediumcontainingG418toselectforthepresenceofretroviralsequences,andthenassayedbyPCRforthepresenceoftheinsertedADAgene.SuitableADA+cellscanthenbeexpandedinculturebeforebeingreintroducedintothepatient.

Exvivogeneaugmentationthe36

Examplesofgenetherapytrialsforinheriteddisorders

DisorderCellsalteredGenetherapystrategyADAdeficiencyTcellsandhemopoieticstemcellsExvivoGATusingrecombinantretrovirusescontaininganADAgeneCysticfibrosisRespiratoryepitheliumInvivoGATusingrecombinantadenovirusesorliposomestodelivertheCFTRgeneFamilialhypercholesterolemiaLivercellsExvivoGATusingretrovirustodelivertheLDLreceptorgene(LDLR)Gaucher'sdiseaseglucocerebrosidaseHemopoieticstemcellsExvivoGATusingretrovirusestodeliverthegene(GBA)GAT,geneaugmentationtherapy.

Examplesofgenetherapytria37

直接基因水平治療；副作用??；技術(shù)含量高，生產(chǎn)成本低；病毒液性質(zhì)穩(wěn)定；生產(chǎn)簡(jiǎn)單可靠，無(wú)環(huán)境污染。基因治療的優(yōu)勢(shì)基因治療概況直接基因水平治療；基因治療的優(yōu)勢(shì)基因治療概況381990年,美國(guó)

嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷病SCID4歲女孩，AshantiDesilva13歲，正常生活第一項(xiàng)體細(xì)胞基因治療臨床試驗(yàn)基因治療概況1990年,美國(guó)第一項(xiàng)體細(xì)胞基因治療臨床試驗(yàn)基因治療概39兩項(xiàng)新措施：（1）制定了基因治療臨床試驗(yàn)監(jiān)查計(jì)劃；（2）定期開辦基因治療安全性專題研討會(huì)。并否決了一項(xiàng)由少數(shù)激進(jìn)分子提出的“停止基因治療臨床試驗(yàn)”議案。1999年9月17日，18歲的JesseGelsinger參加賓夕法尼亞大學(xué)治療鳥氨酸甲酰氨基轉(zhuǎn)移酶（OTC）缺乏癥臨床試驗(yàn)后死亡。美國(guó)Gelsinger事件調(diào)查結(jié)果：應(yīng)只包括女性；血氨值已偏高；門靜脈注射大劑量的重組腺病毒（1X1014VP）調(diào)查結(jié)論：臨床試驗(yàn)存在違規(guī)行為，而與進(jìn)行的基因治療的制品本身無(wú)直接關(guān)系?；蛑委煾艣r兩項(xiàng)新措施：1999年9月17日，18歲的JesseGel40巴黎NeckerEnfantsMalade醫(yī)院采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶IL2RG/γc基因治療重癥聯(lián)合免疫缺陷?。⊿CID-X1）的臨床試驗(yàn)；1999.10起，9/10名兒童的免疫力得到了恢復(fù)；2002.10-2005.1，3/9例分別在近3年及5年后相繼表現(xiàn)出T細(xì)胞白血病的癥狀法國(guó)“氣泡兒童”事件法國(guó)政府立即終止了該項(xiàng)試驗(yàn)。美國(guó)FDA暫停了27項(xiàng)同類以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體基因治療臨床試驗(yàn)。英國(guó)則表示不會(huì)停止這類基因治療臨床試驗(yàn)。意大利的米蘭，類似的臨床試驗(yàn)仍在進(jìn)行。研究表明IL2RG/γc基因本身有缺陷，導(dǎo)致白血病的發(fā)生?；蛑委煾艣r巴黎NeckerEnfantsMalade醫(yī)院采用逆轉(zhuǎn)41Bubble-boy基因治療概況Bubble-boy基因治療概況42基因治療方案總數(shù)1309項(xiàng)腺病毒載體（最常用）331項(xiàng)（24.7%）

p53gene65項(xiàng)

Ad-p5362項(xiàng)

II/III&III期45項(xiàng)

其中：Ad-p53項(xiàng)目

12項(xiàng)III期

32項(xiàng)

其中：Ad-p53項(xiàng)目

6項(xiàng)截止2007年7月，全世界批準(zhǔn)的基因治療臨床試驗(yàn)方案概況基因治療概況基因治療方案總數(shù)431991年Szczylik等在小鼠慢粒白血病模型上，將反義寡核苷酸導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，阻斷了癌細(xì)胞的增殖.理想載體目前仍無(wú)法得到。Adenovirusesentercellsbyreceptor-mediatedendocytosis:Bindingofviralcoatproteintoaspecificreceptorontheplasmamembraneofcellsisfollowedbyendocytosis,aprocessinwhichtheplasmamembraneinvaginatesandthenpinchesofftoformanintracellularvesicle(endosome).巴黎NeckerEnfantsMalade醫(yī)院采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶IL2RG/γc基因治療重癥聯(lián)合免疫缺陷病（SCID-X1）的臨床試驗(yàn)；不論病原體是病毒、細(xì)菌或寄生蟲，它們都具有特異的基因組。直接診斷的前提是被檢測(cè)基因必須已被克隆，基因的正常序列和結(jié)構(gòu)已闡明。（2）定期開辦基因治療安全性專題研討會(huì)。國(guó)際基因治療研究概況-地理分布意大利的米蘭，類似的臨床試驗(yàn)仍在進(jìn)行?；蛑委?，是基于修飾活細(xì)胞遺傳物質(zhì)而進(jìn)行的醫(yī)學(xué)干預(yù)，是一種以預(yù)防和治療疾病為目的的人類基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。Tcellsandhemopoieticstemcells基因治療，是基于修飾活細(xì)胞遺傳物質(zhì)而進(jìn)行的醫(yī)學(xué)干預(yù)，是一種以預(yù)防和治療疾病為目的的人類基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。在我國(guó)，1991年12月復(fù)旦大學(xué)遺傳研究所與第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院合作，以攜帶凝血因子IX基因的反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，對(duì)兩例血友病B患者進(jìn)行了首次基因治療。1，3/9例分別在近3年及5年后相繼表現(xiàn)出T細(xì)胞白血病的癥狀1967年Nirenbeg首先提出基因工程可用于人類疾病治療的設(shè)想。②物理法：包括電穿孔、顯微注射、裸露DNA直接注射、顆粒轟擊等。直接診斷的前提是被檢測(cè)基因必須已被克隆，基因的正常序列和結(jié)構(gòu)已闡明。CationicliposomeshaveasurfacepositivechargeandDNAmoleculesbindtothesurfaceofliposomes.基因治療的發(fā)展史及研究概況②體細(xì)胞基因治療(somaticcellgenetherapy)：是指將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，從而達(dá)到治療目的。③生物法：生物法主要是指病毒介導(dǎo)(以病毒為載體)的基因轉(zhuǎn)移。1，3/9例分別在近3年及5年后相繼表現(xiàn)出T細(xì)胞白血病的癥狀國(guó)際基因治療研究概況-地理分布基因治療概況Total1309UpdatedJuly.20071991年Szczylik等在小鼠慢粒白血病模型上，將反義44國(guó)際基因治療研究概況-國(guó)家分布基因治療概況國(guó)際基因治療研究概況-國(guó)家分布基因治療概況45基因治療概述國(guó)際基因治療研究概況-目的基因基因治療概述國(guó)際基因治療研究概況-目的基因46國(guó)際基因治療研究概況-適應(yīng)癥基因治療概況國(guó)際基因治療研究概況-適應(yīng)癥基因治療概況47國(guó)際基因治療研究概況-載體基因治療概況國(guó)際基因治療研究概況-載體基因治療概況48國(guó)際基因治療研究概況-臨床分期基因治療概述國(guó)際基因治療研究概況-臨床分期基因治療概述49國(guó)際基因治療研究概況-年度狀況基因治療概述國(guó)際基因治療研究概況-年度狀況基因治療概述50國(guó)內(nèi)基因治療及相關(guān)研究概況基因治療概況國(guó)內(nèi)基因治療及相關(guān)研究概況基因治療概況51基因治療概況基因治療概況52人基因治療研究和制劑質(zhì)量控制指導(dǎo)原則基因治療概況人基因治療研究和制劑質(zhì)量控制指導(dǎo)原則基因治療概況53基因診斷基因診斷54基因診斷:

是從基因水平闡明疾病的病因所在，是屬于全新內(nèi)容、全新技術(shù)和全新概念的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。它是以DNA和RNA為診斷材料，通過(guò)檢查基因的存在、缺陷和表達(dá)異常，對(duì)人體健康狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過(guò)程?；蛟\斷:55基因診斷的基本原理：是通過(guò)檢測(cè)DNA或RNA的結(jié)構(gòu)變化、量的多少及表達(dá)功能是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診的依據(jù)。基因診斷的臨床意義：在于可以對(duì)疾病作出早期、確切的診斷，可以確定個(gè)體對(duì)疾病的易感性以及疾病的分期分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等。

近十年來(lái)，基因診斷技術(shù)已逐步成為實(shí)驗(yàn)診斷的常規(guī)技術(shù)，基因診斷的原理和技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，包括遺傳學(xué)、傳染病學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)以及法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?；蛟\斷的基本原理：56基因診斷的基本方法①基因突變的診斷；②多態(tài)性分析；③基因表達(dá)的檢測(cè)；④外源DNA的檢測(cè)。

基因診斷的基本方法①基因突變的診斷；57基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)基因診斷中常用的技術(shù)主要包括：1、核酸分子雜交；2、DNA指紋3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；4、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)(SSCP)；5、限制酶酶譜分析；6、DNA序列測(cè)序7、DNA芯片技術(shù)?；蛟\斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)基因診斷中常用的技術(shù)主要包括58遺傳性疾病基因診斷1.直接診斷直接診斷的前提是被檢測(cè)基因必須已被克隆，基因的正常序列和結(jié)構(gòu)已闡明。采用基因突變的診斷方法，通過(guò)各種分子生物學(xué)技術(shù)直接檢測(cè)導(dǎo)致遺傳性疾病發(fā)生的各種基因突變。2.間接診斷在許多情況下，疾病的致病基因尚未被克隆而無(wú)法進(jìn)行直接診斷，但若致病位點(diǎn)已在基因組中被定位，則可以采用間接診斷策略。即采用多態(tài)性連鎖分析的方法，尋找具有基因缺陷的染色體，并判斷被檢者是否存在該條染色體的缺陷。間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過(guò)分析DNA的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性來(lái)判斷被檢者是否具有帶致病基因的染色體，以判斷被檢者患病的可能性。遺傳性疾病基因診斷1.直接診斷59基因診斷在遺傳性疾病中的臨床應(yīng)用

血紅蛋白病，包括異常血紅蛋白病、α-地中海貧血和β-地中海貧血；杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)；甲型血友病等等?；蛟\斷在遺傳性疾病中的臨床應(yīng)用60感染性疾病的基因診斷

感染性疾病是感染了某種病原體而引起的一類疾病。不論病原體是病毒、細(xì)菌或寄生蟲，它們都具有特異的基因組。對(duì)常見病原體的特異基因或DNA片段的組成特點(diǎn)現(xiàn)在可采用核酸分子雜交技術(shù)，針對(duì)病原體特異的核酸序列設(shè)計(jì)探針來(lái)進(jìn)行雜交；或應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增病原體基因的保守序列；或?qū)⒑怂岱肿与s交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。這些方法能夠?qū)Υ蠖鄶?shù)感染性疾病作出明確的病原體診斷，及對(duì)潛伏感染或帶菌者作出診斷，并能對(duì)病原體進(jìn)行分類和分型鑒定。感染性疾病的基因診斷61腫瘤的基因診斷

1.檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因：癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因等基因的突變及表達(dá)異常。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)人類腫瘤如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌等癌組織中都存在癌基因和(或)抑癌基因的缺失或點(diǎn)突變等改變，這些改變可作為某些腫瘤的基因標(biāo)志。對(duì)癌基因和抑癌基因的檢測(cè)，是目前腫瘤基因診斷的一個(gè)重要方面。腫瘤的基因診斷1.檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因：62Tcellsandhemopoieticstemcells1，3/9例分別在近3年及5年后相繼表現(xiàn)出T細(xì)胞白血病的癥狀國(guó)際基因治療研究概況-地理分布基因治療，是基于修飾活細(xì)胞遺傳物質(zhì)而進(jìn)行的醫(yī)學(xué)干預(yù)，是一種以預(yù)防和治療疾病為目的的人類基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。即采用多態(tài)性連鎖分析的方法，尋找具有基因缺陷的染色體，并判斷被檢者是否存在該條染色體的缺陷。對(duì)常見病原體的特異基因或DNA片段的組成特點(diǎn)現(xiàn)在可采用核酸分子雜交技術(shù)，針對(duì)病原體特異的核酸序列設(shè)計(jì)探針來(lái)進(jìn)行雜交；其中：Ad-p53項(xiàng)目6項(xiàng)Whenthishappenstheclonedgenescanbetransferredintothecytoplasmofacell,andcanthencemigratetothenucleusbypassivediffusionthroughtheporesofthenuclearenvelope.由于此法改變了生殖細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，影響人類基因構(gòu)成，并影響到子代的發(fā)育，同時(shí)涉及一系列的倫理問題，美聯(lián)邦國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)目前規(guī)定禁止用于人類，僅可用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。ras癌基因是人類腫瘤中普遍存在的被激活的癌基因。SubsequentvesicledisruptionbyadenovirusproteinsallowsvirionstoescapeandmigratetowardsthenucleuswhereviralDNAentersthroughporesinthenuclearenvelope.基因治療的發(fā)展史及研究概況前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子基因后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，腫瘤轉(zhuǎn)移灶被T細(xì)胞及NK細(xì)胞附著。（2）定期開辦基因治療安全性專題研討會(huì)。1991年Szczylik等在小鼠慢粒白血病模型上，將反義寡核苷酸導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，阻斷了癌細(xì)胞的增殖.Cysticfibrosis行的基因治療的制品本身無(wú)直接1980年Cline首次將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠獲得成功，次年對(duì)2名重癥β-地中海貧血患者進(jìn)行治療，雖未獲成功，Genetherapyinvolvingchromosomalintegrationofexogenousgenesoffersthepossibilityofcontinuedstableexpressionoftheinsertedgeneandapermanentcure,butcarriescertainrisks,notablythepossibilitythatoneoftheintegrationeventsmayresultincancer.基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)Theplasmamembranesofcellsarefluidstructureswhoseprincipalcomponentsarephospholipids,andsomixingofcellsandliposomescanresultinoccasionalfusionbetweenthelipidbilayeroftheliposomeandtheplasmamembrane.(1)ras癌基因的檢測(cè)

ras癌基因是人類腫瘤中普遍存在的被激活的癌基因。它最常見的點(diǎn)突變是在第12、13或61密碼子的突變。常用PCR/ASO法和PCR-SSCP法進(jìn)行點(diǎn)突變的檢測(cè)。(2)抑癌基因p53的檢測(cè)

p53基因突變是人類癌癥中另一個(gè)常見突變基因，約50%以上的癌癥都有p53基因突變。該基因的突變熱點(diǎn)位于密碼子130~290的區(qū)域，其中第175、284、273密碼子突變最為常見。常用的檢測(cè)方法有PCR-SSCP法、PCR結(jié)合序列分析、PCR-RFLP法。Tcellsandhemopoieticstemc63昆醫(yī)分生基因治療不考試?yán)メt(yī)分生基因治療不考試64（優(yōu)選）昆醫(yī)分生基因治療不考試（優(yōu)選）昆醫(yī)分生基因治療不考試65基因治療概況基因治療，是基于修飾活細(xì)胞遺傳物質(zhì)而進(jìn)行的醫(yī)學(xué)干預(yù)，是一種以預(yù)防和治療疾病為目的的人類基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。即：以改變細(xì)胞遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)治療?；蛑委煾艣r基因治療概況基因治療，是基于修飾活細(xì)胞遺傳物質(zhì)而進(jìn)行的醫(yī)學(xué)干66基因研究與治療發(fā)展歷程發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)建立DNA重組技術(shù)在大腸桿菌中成功表達(dá)胰島素第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素上市美國(guó)批準(zhǔn)第一個(gè)體細(xì)胞基因治療方案，治療嚴(yán)重綜合性免疫缺損癥英國(guó)培養(yǎng)出第一只克隆羊多莉人類基因組計(jì)劃“工作草圖”繪制完畢基因治療產(chǎn)品上市19531973197819821990199720002004基因研究與治療發(fā)展歷程發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)建立DNA重組技術(shù)67

基因治療的發(fā)展史及研究概況

1967年Nirenbeg首先提出基因工程可用于人類疾病治療的設(shè)想。1980年Cline首次將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠獲得成功，次年對(duì)2名重癥β-地中海貧血患者進(jìn)行治療，雖未獲成功，1985年美聯(lián)邦國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)成立了基因治療委員會(huì)，并于1989年首次批準(zhǔn)Arderson等將抗新霉素基因?qū)牒谏亓龌颊叩哪[瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)作為標(biāo)記基因。1990年Blaese將正常人的腺苷脫胺酶基因?qū)?名腺苷胱氨酸（ADA）缺乏癥患者的淋巴細(xì)胞獲得成功，成為醫(yī)學(xué)史上的重要里程碑。1991年Szczylik等在小鼠慢粒白血病模型上，將反義寡核苷酸導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，阻斷了癌細(xì)胞的增殖.

在我國(guó)，1991年12月復(fù)旦大學(xué)遺傳研究所與第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院合作，以攜帶凝血因子IX基因的反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，對(duì)兩例血友病B患者進(jìn)行了首次基因治療?；蛑委煹陌l(fā)展史及研究概況1967年Nirenbeg首先68

惡性腫瘤心血管疾病遺傳病感染性疾病威脅人類健康的重大疾病基因治療對(duì)象基因治療概況惡性腫瘤威脅人類健康的重大疾病基因治療對(duì)象基因治療概69基因治療藥與基因工程藥DNAPROTEINRNA基因工程藥基因治療藥基因治療概況基因治療藥與基因工程藥DNAPROTEINRNA基因工程藥基70人類基因組計(jì)劃“工作草圖”繪制完畢即采用多態(tài)性連鎖分析的方法，尋找具有基因缺陷的染色體，并判斷被檢者是否存在該條染色體的缺陷。InvivoGATusingrecombinantadenovirusesorliposomestodelivertheCFTRgene它最常見的點(diǎn)突變是在第12、13或61密碼子的突變。直接診斷的前提是被檢測(cè)基因必須已被克隆，基因的正常序列和結(jié)構(gòu)已闡明。技術(shù)含量高，生產(chǎn)成本低；GenetherapystrategyTcellsandhemopoieticstemcells或應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增病原體基因的保守序列；國(guó)際基因治療研究概況-載體即采用多態(tài)性連鎖分析的方法，尋找具有基因缺陷的染色體，并判斷被檢者是否存在該條染色體的缺陷。①必須較堅(jiān)固，足以耐受處理，易于由人體分離并便于回輸。嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷病SCIDUpdatedJuly.Insomecases,aphospholipidbilayerisformed,withhydrophilicphosphategroupslocatedontheexternalsurfacesandhydrophobiclipidslocatedinternally(left).Cellsaltered美國(guó)Gelsinger事件4、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)(SSCP)；腺病毒載體（最常用）331項(xiàng)（24.國(guó)際基因治療研究概況-地理分布治療基因載體靶細(xì)胞基因治療制品基因治療要素基因治療概況人類基因組計(jì)劃“工作草圖”繪制完畢治療基因載體靶細(xì)胞基因治療71最理想的方式目前的主要方式基因治療策略基因治療概況

基因替代（GeneReplacement）基因修復(fù)（GeneModification）基因添加（GeneAddition）基因失活（Geneblock）最理想的方式目前的主要方式基因治療策略基因治療概況基因替代72昆醫(yī)分生基因治療不考試課件73昆醫(yī)分生基因治療不考試課件74昆醫(yī)分生基因治療不考試課件75昆醫(yī)分生基因治療不考試課件76昆醫(yī)分生基因治療不考試課件77昆醫(yī)分生基因治療不考試課件78

體細(xì)胞基因治療生殖細(xì)胞基因治療基因治療種類基因治療概況體細(xì)胞基因治療基因治療種類基因治療概況79基因治療的途徑因受體細(xì)胞的不同分為兩種：①生殖細(xì)胞基因治療(germcellgenetherapy)：是將正常外源基因轉(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞(精細(xì)胞、卵細(xì)胞及中早期胚胎)中，使子代成為正常的個(gè)體。由于此法改變了生殖細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，影響人類基因構(gòu)成，并影響到子代的發(fā)育，同時(shí)涉及一系列的倫理問題，美聯(lián)邦國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)目前規(guī)定禁止用于人類，僅可用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。②體細(xì)胞基因治療(somaticcellgenetherapy)：是指將正常基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，從而達(dá)到治療目的。由于該療法只涉及體細(xì)胞的遺傳改變，而不影響子代，故到目前為止，人類所進(jìn)行的基因治療，均為體細(xì)胞基因治療基因治療的途徑因受體細(xì)胞的不同分為兩種：80昆醫(yī)分生基因治療不考試課件81目前使用較多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。1990年Blaese將正常人的腺苷脫胺酶基因?qū)?名腺苷胱氨酸（ADA）缺乏癥患者的淋巴細(xì)胞獲得成功，成為醫(yī)學(xué)史上的重要里程碑。1991年Szczylik等在小鼠慢粒白血病模型上，將反義寡核苷酸導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，阻斷了癌細(xì)胞的增殖.3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；TcellsandhemopoieticstemcellsTcellsandhemopoieticstemcells第一項(xiàng)體細(xì)胞基因治療臨床試驗(yàn)ras癌基因是人類腫瘤中普遍存在的被激活的癌基因。目前適用基因治療的疾病直接診斷的前提是被檢測(cè)基因必須已被克隆，基因的正常序列和結(jié)構(gòu)已闡明。HemopoieticstemcellsTheefficiencyoftransfercanbeincreasedbythefurtherrefinementofcouplinganinactivatedadenovirustotheDNA

transferrincomplex:followingendocytosisandtransporttolysosomes,theaddedadenoviruscausesvesicledisruption,allowingtheDNAtoavoiddegradationandtosurviveinthecytoplasm.4、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)(SSCP)；③生物法：生物法主要是指病毒介導(dǎo)(以病毒為載體)的基因轉(zhuǎn)移。Familialhypercholesterolemia4歲女孩，AshantiDesilva基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)病毒為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移具有靶向性好、效率高的特點(diǎn)，另外可利用細(xì)胞自身機(jī)制生產(chǎn)所需要的目的蛋白質(zhì)，是目前進(jìn)入臨床前期研究的較為理想的載體之一。血紅蛋白病，包括異常血紅蛋白病、α-地中海貧血和β-地中海貧血；ExvivoGATusingretrovirustodelivertheLDLreceptorgene(LDLR)它最常見的點(diǎn)突變是在第12、13或61密碼子的突變。體外基因治療(Exvivo)：從病人體內(nèi)獲取細(xì)胞，體外培養(yǎng)并進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移后，重新輸入患者體內(nèi)前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子基因后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，腫瘤轉(zhuǎn)移灶被T細(xì)胞及NK細(xì)胞附著?；蛑委熗緩交蛑委煾攀瞿壳笆褂幂^多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮82體內(nèi)基因治療(Invivo)：直接將基因或改造后的病毒(插入目的基因)導(dǎo)入人體患病組織中攜p53基因的重組腺病毒導(dǎo)入人體腫瘤組織引起腫瘤細(xì)胞裂解基因治療途徑基因治療概況體內(nèi)基因治療(Invivo)：直接將基因或改造后的病毒(插83基因治療的要求是：①向一定的細(xì)胞導(dǎo)入治療基因；②輸送到細(xì)胞核，并整合到DNA的正確位置；③穩(wěn)定的表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、定位和修飾?；蛑委煹囊笫牵?4基因治療的途徑基因治療的途徑85選擇靶細(xì)胞的原則是：①必須較堅(jiān)固，足以耐受處理，易于由人體分離并便于回輸。②具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長(zhǎng)，能存活幾個(gè)月甚至幾年，最好可延續(xù)至病人的整個(gè)生命期。③易于受外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

目前使用較多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。腫瘤基因治療常用的靶細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞自身，其次是淋巴細(xì)胞和造血干細(xì)胞。選擇靶細(xì)胞的原則是：86基因轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法基因轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法87基因轉(zhuǎn)移方法分三類：①化學(xué)法：包括磷酸鹽沉淀、脂質(zhì)體(Plasmid-liposomecomplex)包埋、多聚季銨鹽和DEAE-葡萄糖等化學(xué)試劑轉(zhuǎn)移。這些方法通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性或增加DNA與細(xì)胞的吸附而實(shí)施基因轉(zhuǎn)移。②物理法：包括電穿孔、顯微注射、裸露DNA直接注射、顆粒轟擊等。物理方法轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)易受DNA酶降解，不易穩(wěn)定地存在于細(xì)胞基因中。③生物法：生物法主要是指病毒介導(dǎo)(以病毒為載體)的基因轉(zhuǎn)移。包括DNA病毒如腺病毒(AV)、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、細(xì)小病毒(HI)、痘苗病毒(VV)和RNA病毒即反轉(zhuǎn)錄病毒(RV)?；蜣D(zhuǎn)移方法分三類：88生物傳導(dǎo)的方法生物傳導(dǎo)的方法89Adenovirusesentercellsbyreceptor-mediatedendocytosis:Bindingofviralcoatproteintoaspecificreceptorontheplasmamembraneofcellsisfollowedbyendocytosis,aprocessinwhichtheplasmamembraneinvaginatesandthenpinchesofftoformanintracellularvesicle(endosome).SubsequentvesicledisruptionbyadenovirusproteinsallowsvirionstoescapeandmigratetowardsthenucleuswhereviralDNAentersthroughporesinthenuclearenvelope.AdaptedfromCuriel(1994)withpermissionfromtheNewYorkAcademyofSciencesAdenovirusesentercellsbyre90Genetransferviathereceptor-mediatedendocytosispathway.ThenegativelychargedplasmidDNAcanbindreversiblytothepositivelychargedpolylysineattachedtothetransferrinmolecule.Duringthisprocess,theDNAiscondensedintoacompactcirculartoroidwiththetransferrinmoleculeslocatedexternallyandfreetobindtocellsurfacetransferrinreceptors.Followinginitialendosomeformation,aportionoftheendocytosedconjugatescanmigratetothenucleus,althoughaverysignificantfractionisalternativelytransferredtolysosomeswheretheDNAisdegraded.TheefficiencyoftransfercanbeincreasedbythefurtherrefinementofcouplinganinactivatedadenovirustotheDNA

transferrincomplex:followingendocytosisandtransporttolysosomes,theaddedadenoviruscausesvesicledisruption,allowingtheDNAtoavoiddegradationandtosurviveinthecytoplasm.AdaptedfromCuriel(1994)withpermissionfromTheNewYorkAcademyofSciences.Genetransferviathereceptor911967年Nirenbeg首先提出基因工程可用于人類疾病治療的設(shè)想。Exogenousgenesthatintegrateintochromosomescanbestablytransmittedtoalldaughtercells,unlikeepisomal(extrachromosomal)genes.ExvivoGATusingrecombinantretrovirusescontaininganADAgene體外基因治療(Exvivo)：從病人體內(nèi)獲取細(xì)胞，體外培養(yǎng)并進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移后，重新輸入患者體內(nèi)(C)Useofliposomestotransfergenesintocells.或?qū)⒑怂岱肿与s交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。p53基因突變是人類癌癥中另一個(gè)常見突變基因，約50%以上的癌癥都有p53基因突變。Exvivogeneaugmentationtherapyforadenosinedeaminase(ADA)deficiency.Duringthisprocess,theDNAiscondensedintoacompactcirculartoroidwiththetransferrinmoleculeslocatedexternallyandfreetobindtocellsurfacetransferrinreceptors.門靜脈注射大劑量的重組腺病毒國(guó)際基因治療研究概況-載體體內(nèi)基因治療(Invivo)：直接將基因或改造后的病毒(插入目的基因)導(dǎo)入人體患病組織中②物理法：包括電穿孔、顯微注射、裸露DNA直接注射、顆粒轟擊等。1，3/9例分別在近3年及5年后相繼表現(xiàn)出T細(xì)胞白血病的癥狀p53基因突變是人類癌癥中另一個(gè)常見突變基因，約50%以上的癌癥都有p53基因突變。巴黎NeckerEnfantsMalade醫(yī)院采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶IL2RG/γc基因治療重癥聯(lián)合免疫缺陷?。⊿CID-X1）的臨床試驗(yàn)；④外源DNA的檢測(cè)。不論病原體是病毒、細(xì)菌或寄生蟲，它們都具有特異的基因組。截止2007年7月，全世界批準(zhǔn)的基因治療臨床試驗(yàn)方案概況美國(guó)批準(zhǔn)第一個(gè)體細(xì)胞基因治療方案，治療嚴(yán)重綜合性免疫缺損癥②物理法：包括電穿孔、顯微注射、裸露DNA直接注射、顆粒轟擊等。Inothercasesthereisamultilamellarlipidenvelope.它最常見的點(diǎn)突變是在第12、13或61密碼子的突變。前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子基因后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，腫瘤轉(zhuǎn)移灶被T細(xì)胞及NK細(xì)胞附著。Bycontrast,episomalgeneswhichdonotintegratebutreplicateextrachromosomally(underthecontrolofavectororiginofreplication)maynotsegregatetoalldaughtercellsduringsubsequentmitoses.UpdatedJuly.以改變細(xì)胞遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)治療。InvivoGATusingrecombinantadenovirusesorliposomestodelivertheCFTRgene基因治療方案總數(shù)1309項(xiàng)Asa